Lippia alba (mill) N. E. Br. ex Britt l Wilson - Verbenaceae - é relatada como uma planta medicinal com efeito fungitóxico para vários fungos fitopatogênicos e entre esses Colletotrilhum gloeosporioides (penz), causador da doença"queda de frutos jovens de citros". Testes realizados a partir de duas formas de L. alba - forma 1 (F1) e forma 2 (F2) mantidos em contato com gotas de suspensão de conídios de C. glocosponcides, sobre superfície de poliestireno durante diferentes períodos de tempo, demonstraram que substância(s) presente(s) em folhas secas das duas formas de L. alba altera(m) o padrão de germinação dos conídios, aumentado o comportamento e a largura do tubo germinativa e impedindo a formação do apressório. A não formação de apressórios pelos conídios foi também demonstrada a partir do contato de extratos acetônicos, etanólicos e hexânicos com gotas de suspensão de esporos em lâminas de poliestireno. Utilizando-se esses extratos, sobre meio BDA em placas de Petri, verificou-se também o efeito dos mesmos sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides. O extrato etanólico mostrou-se como e mais eficiente na redução do crescimento micelial, enquanto que o extrato aquoso não exibiu efeito algum nesse sentido. Através de bioensaios para frações fungitóxicas, pelo uso de placas de cromato-grafia delgada, demonstrou-se também o efeito fungitóxico dos extratos provenientes das duas formas de L.alba. Com o aparecimento de diferentes zonas de inibição do crescimento de L. gloeosporioides, comprovando-se o efeito fungitóxico de todos os extratos inclusive o aquoso, para as duas formas de L. alba. A quantificação de proteínas e carboidratos totais, bem como análise de macro e micronutrientes realizadas nas folhas secas das duas formas de L. alba não forneceram evidências para se efetuar correlações sobre o papel desses compostos na atividade fungistática apresentada / not available

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3083.pdf: 2248132 bytes, checksum: e9e87339e9e37807b3fca15951f08511 (MD5) Previous issue date: 2010-05-10 / The objective of the present research was to study the practical viability of Bacillus subtilis (ACB-69) to control Colletotrichum acutatum, the casual agent of postbloom fruit drop (PFD) under field conditions. First, the bacteria was tested in two different concentrations, one at 5% and the other at 10 %, in the experiment conducted on Pera Sweet orange plants grafted on cravo lemon trees (11 years of planting), in a private property located in Botucatu, São Paulo State, Brazil during the 2007/2008 season. The same treatments were repeated in the following season, however, with or without adding a carbon source (molasses at 5%), on Valencia orange plants grafted on Rangpur lime trees (15 years old). Additional studies were also carried out under the same conditions, aiming to determine the most appropriate growth stages of flowers to apply the biocontrol agent, for the best disease control. For all experiments, the biological products were applied with an air assisted sprayer with the additional intent of evaluating its practicality. It was verified that vi the weekly application of B. subtilis at 5% reduced the quantity of symptomatic flowers by 47%, while the chemical treatment only showed an18% efficiency when compared to the control. On the other hand, weekly applications of B. subtilis (at 10%) or with one week before the application of the other biological treatments caused a greater average number of effective fruits (ANEF). The addition of a carbon source at the moment of application may favor the antagonism of the bacteria; however, the addition is optional, particularly when its ANEF is evaluated. The best moment to apply the ACB-69 isolate to control PFD was in the open flower stage, when the percentage of symptomatic flowers was evaluated, however, when the bacteria is applied during all flowering stages there is a greater quantity of effective fruits per plant. The use of the air assisted sprayer was considered efficient for the antagonistic application, allowing a better distribution of the inoculum on the plant without damaging the bacterial cells, hence, enabling it to be an indication for future microorganism applications to control diseases. / O presente trabalho teve por objetivo estudar a viabilidade prática de Bacillus subtilis no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da Queda Prematura dos Frutos Cítricos (QPFC), sob condições de campo. Primeiramente, a bactéria foi testada em duas concentrações diferentes, a 5 e 10%, em experimento realizado em plantas de laranja Valencia enxertada sobre limoeiro Cravo (11 anos de plantio), em propriedade particular localizada no município de Botucatu, São Paulo, Brasil, durante a safra de 2007/2008. Os mesmos tratamentos foram repetidos na safra subseqüente, porém, acrescidos ou não de uma fonte de carbono (melaço a 5%), em plantas de laranjeira Valência enxertada sobre limão Cravo (15 anos de idade). Estudo adicional foi também realizado, nas mesmas condições, visando determinar o melhor estágio de desenvolvimento da flor para aplicação do agente de biocontrole, e, assim otimizar o controle da doença. As aplicações dos produtos foram realizados com uso de turboatomizador tratorizado, com o intuito adicional de avaliar a sua praticidade. Verificou-se que a aplicação de B. subtilis a 5% semanalmente, a quantidade de flores com sintomas foi reduzida em 47%, enquanto o tratamento químico apresentou uma eficiência de apenas 18%, quando em comparação com a testemunha. Por outro lado, B. subtilis (a 10%) aplicado semanalmente ou, com uma semana antes da aplicação dos demais tratamentos biológicos, proporcionou maior numero médio de frutos efetivos (NMFE). O acréscimo de uma fonte de carbono, no momento da aplicação, pode favorecer o antagonista da bactéria, no entanto, a adição é facultativa, principalmente, quando se avalia o NMFE. O melhor momento de aplicação do isolado ACB-69 para controle da PFC foi na fase de flor aberta, quando se avaliou a porcentagem de flores com sintomas, porém, quando a bactéria é aplicada em todos os estádios de florescimento, obtém-se uma maior quantidade de frutos efetivos na planta. A utilização do turboatomizador foi considerada eficiente para aplicação do antagônico, permitindo uma melhor distribuição do inoculo pela planta, não acarretando danificações nas células bacterianas, podendo, portanto, ser uma indicação para aplicações futuras do microrganismo para controle de doenças.

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3083.pdf: 2248132 bytes, checksum: e9e87339e9e37807b3fca15951f08511 (MD5) Previous issue date: 2010-05-10 / The objective of the present research was to study the practical viability of Bacillus subtilis (ACB-69) to control Colletotrichum acutatum, the casual agent of postbloom fruit drop (PFD) under field conditions. First, the bacteria was tested in two different concentrations, one at 5% and the other at 10 %, in the experiment conducted on Pera Sweet orange plants grafted on cravo lemon trees (11 years of planting), in a private property located in Botucatu, São Paulo State, Brazil during the 2007/2008 season. The same treatments were repeated in the following season, however, with or without adding a carbon source (molasses at 5%), on Valencia orange plants grafted on Rangpur lime trees (15 years old). Additional studies were also carried out under the same conditions, aiming to determine the most appropriate growth stages of flowers to apply the biocontrol agent, for the best disease control. For all experiments, the biological products were applied with an air assisted sprayer with the additional intent of evaluating its practicality. It was verified that the weekly application of B. subtilis at 5% reduced the quantity of symptomatic flowers by 47%, while the chemical treatment only showed an18% efficiency when compared to the control. On the other hand, weekly applications of B. subtilis (at 10%) or with one week before the application of the other biological treatments caused a greater average number of effective fruits (ANEF). The addition of a carbon source at the moment of application may favor the antagonism of the bacteria; however, the addition is optional, particularly when its ANEF is evaluated. The best moment to apply the ACB-69 isolate to control PFD was in the open flower stage, when the percentage of symptomatic flowers was evaluated, however, when the bacteria is applied during all flowering stages there is a greater quantity of effective fruits per plant. The use of the air assisted sprayer was considered efficient for the antagonistic application, allowing a better distribution of the inoculum on the plant without damaging the bacterial cells, hence, enabling it to be an indication for future microorganism applications to control diseases. / O presente trabalho teve por objetivo estudar a viabilidade prática de Bacillus subtilis no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da Queda Prematura dos Frutos Cítricos (QPFC), sob condições de campo. Primeiramente, a bactéria foi testada em duas concentrações diferentes, a 5 e 10%, em experimento realizado em plantas de laranja Valencia enxertada sobre limoeiro Cravo (11 anos de plantio), em propriedade particular localizada no município de Botucatu, São Paulo, Brasil, durante a safra de 2007/2008. Os mesmos tratamentos foram repetidos na safra subseqüente, porém, acrescidos ou não de uma fonte de carbono (melaço a 5%), em plantas de laranjeira Valência enxertada sobre limão Cravo (15 anos de idade). Estudo adicional foi também realizado, nas mesmas condições, visando determinar o melhor estágio de desenvolvimento da flor para aplicação do agente de biocontrole, e, assim otimizar o controle da doença. As aplicações dos produtos foram realizados com uso de turboatomizador tratorizado, com o intuito adicional de avaliar a sua praticidade. Verificou-se que a aplicação de B. subtilis a 5% semanalmente, a quantidade de flores com sintomas foi reduzida em 47%, enquanto o tratamento químico apresentou uma eficiência de apenas 18%, quando em comparação com a testemunha. Por outro lado, B. subtilis (a 10%) aplicado semanalmente ou, com uma semana antes da aplicação dos demais tratamentos biológicos, proporcionou maior numero médio de frutos efetivos (NMFE). O acréscimo de uma fonte de carbono, no momento da aplicação, pode favorecer o antagonista da bactéria, no entanto, a adição é facultativa, principalmente, quando se avalia o NMFE. O melhor momento de aplicação do isolado ACB-69 para controle da PFC foi na fase de flor aberta, quando se avaliou a porcentagem de flores com sintomas, porém, quando a bactéria é aplicada em todos os estádios de florescimento, obtém-se uma maior quantidade de frutos efetivos na planta. A utilização do turboatomizador foi considerada eficiente para aplicação do antagônico, permitindo uma melhor distribuição do inoculo pela planta, não acarretando danificações nas células bacterianas, podendo, portanto, ser uma indicação para aplicações futuras do microrganismo para controle de doenças.

Lippia alba (mill) N. E. Br. ex Britt l Wilson - Verbenaceae - é relatada como uma planta medicinal com efeito fungitóxico para vários fungos fitopatogênicos e entre esses Colletotrilhum gloeosporioides (penz), causador da doença"queda de frutos jovens de citros". Testes realizados a partir de duas formas de L. alba - forma 1 (F1) e forma 2 (F2) mantidos em contato com gotas de suspensão de conídios de C. glocosponcides, sobre superfície de poliestireno durante diferentes períodos de tempo, demonstraram que substância(s) presente(s) em folhas secas das duas formas de L. alba altera(m) o padrão de germinação dos conídios, aumentado o comportamento e a largura do tubo germinativa e impedindo a formação do apressório. A não formação de apressórios pelos conídios foi também demonstrada a partir do contato de extratos acetônicos, etanólicos e hexânicos com gotas de suspensão de esporos em lâminas de poliestireno. Utilizando-se esses extratos, sobre meio BDA em placas de Petri, verificou-se também o efeito dos mesmos sobre o crescimento micelial de C. gloeosporioides. O extrato etanólico mostrou-se como e mais eficiente na redução do crescimento micelial, enquanto que o extrato aquoso não exibiu efeito algum nesse sentido. Através de bioensaios para frações fungitóxicas, pelo uso de placas de cromato-grafia delgada, demonstrou-se também o efeito fungitóxico dos extratos provenientes das duas formas de L.alba. Com o aparecimento de diferentes zonas de inibição do crescimento de L. gloeosporioides, comprovando-se o efeito fungitóxico de todos os extratos inclusive o aquoso, para as duas formas de L. alba. A quantificação de proteínas e carboidratos totais, bem como análise de macro e micronutrientes realizadas nas folhas secas das duas formas de L. alba não forneceram evidências para se efetuar correlações sobre o papel desses compostos na atividade fungistática apresentada / not available

A podridão floral dos citros (PFC), causada por Colletotrichum acutatum, induz a abscisão de frutos jovens, podendo causar perdas de até 100%. A presença de inóculo viável na forma de conídios e/ou apressórios quiescentes na planta justifica a ocorrência generalizada da doença. Em períodos de chuva a PFC é agravada, possivelmente, em função de substâncias lavadas das diferentes partes da planta, as quais contêm metabólitos que estimulam o desenvolvimento do fungo. Diante do exposto, objetivou-se verificar o efeito das águas de lavagem brutas (ALBs) de flores, botões, folhas velhas (FV) e folhas novas (FN) e mistura destas sobre conídios, apressórios e hifas quiescentes de C. acutatum (isolados 61A e 142) in vitro e in vivo e sobre a severidade da PFC, bem como identificar substâncias presentes nas ALBs, exibindo a atividade biológica de interesse. Além disso, buscou-se verificar variações na composição das ALBs. O efeito de compostos voláteis brutos (CVBs) e os identificados a partir de laranjeira Valência (linalol, limoneno, mirceno, nonanal e a mistura destes) sobre o desenvolvimento do patógeno também foi avaliado. Todas as frações das ALBs estimularam a germinação dos conídios do fungo, sendo que a ALB de flores apresentou o maior estímulo para ambos os isolados. Para apressórios quiescentes (isolado 61A), o maior estímulo foi verificado nos tratamentos com ALBs de botões e da mistura e para conídios no tratamento mistura. Os maiores valores para comprimento do tubo germinativo foram observados nos tratamentos mistura, FN e botões. Para as estruturas quiescentes, o efeito das ALBs foi mais significativo para o isolado 142. Não foi observado efeito das ALBs sobre o micélio quiescente. Houve estímulo da germinação de conídios e ramificação de hifas in vivo, principalmente, em resposta ao tratamento com ALB de botões. A aplicação da ALB da mistura em flores resultou em maior severidade da PFC. Por sua vez, os CVBs apresentaram efeito inibitório. A exposição do isolado 61A aos voláteis (CVs) linalol, nonanal e mistura, resultou em germinação apenas na menor dose. O mirceno manteve a germinação semelhante a testemunha em todas as doses testadas, assim como limoneno nas doses de 0,005 a 0,25 µL mL-1. Todos os voláteis reduziram o comprimento do tubo germinativo. Para o isolado 142, houve redução em todas as variáveis para todas as doses dos CVs. Houve variações na composição das ALBs nas diferentes coletas, o que explica em parte a variação na capacidade de estímulo em alguns testes. Na ALB de flores, identificou-se a presença de cafeína, dos flavonóides glicosilados hesperidina e naringina, além de compostos glicosilados e peptídeos. Nas partes vegetais de laranjeira Valência foram identificados 54 CVs. As ALBs apresentam efeito estimulatório sobre conídios e apressórios quiescentes de C. acutatum in vitro e in vivo, bem como sobre a severidade da PFC. Os CVs linalol, limoneno, mirceno, nonanal e a mistura destes são, de forma geral, inibitórios ao desenvolvimento de C. acutatum. / The postbloom fruit drop of citrus (PFDC), caused by Colletotrichum acutatum, induces abscission of young fruits, and it may cause losses up to 100%. The presence of viable inoculum in the form of conidia and/or quiescent appressoria on the plant justifies the widespread occurrence of the disease. Under rain, the PFDC is increased, possibly due to substances washed from different parts of the plant, which contain metabolites that stimulate the development of the fungus. Therefore, we aimed to determine the effect of watery washing (WWs) of flowers, flower buds, old leaves (OL) and young leaves (YL) and the mixture of them on quiescent conidia and hyphae of C. acutatum (isolates 61A and 142) in vitro and in vivo and on the severity of the PFDC, and to identify substances in the WWs, exhibiting the biological activity of interest. In addition, variations in the composition of WWs were determinated. The effect of crude volatile compounds (CVCs) and those identified from Valencia sweet orange (linalool, limonene, myrcene, nonanal and the mixture of them) on the development of the pathogen was also evaluated. All fractions of WWs stimulated spore germination, and the flower WW exhibited the highest effect for both isolates. For quiescent appressoria (isolate 61A), the highest stimulus was observed in treatments with WWs from flower buds and the mixture and for quiescent conidia in the treatment mixture. The highest values for germ tube length were observed on the treatments mixture, YL and flower buds. For the quiescent structures, the effect of WWs was more significant for isolate 142. There was no effect of WWs on the quiescent mycelium. There was stimulation of conidia germination and hyphal branching in vivo in response mainly to treatment with WW from flower buds. The application of the mixture of WW in flowers resulted in higher severity of the PFDC. On the other hand, the CVCs showed inhibitory effect. Exposure of the isolate 61A to the volatiles (VCs) linalool, nonanal and the mixture of them, resulted in germination only at the lowest concentration. The germination on myrcene was similar to control at all doses tested as well as on limonene at doses from 0.005 to 0.25 mL mL-1. All volatiles reduced the length of the germ tube. In the case of isolate 142, a reduction in all variables for all concentration of VCs was observed. There were changes in the composition of WWs based upon times of harvesting, which partly explains the variations observed in the ability to stimulate the structures in some experiments. In flower WWs, we identified the presence of caffeine, the flavonol glycosides hesperidin and naringin, glycosylated compounds and peptides. In the plant parts of sweet orange \'Valencia\' were identified 54 VCs. The WWs have stimulatory effect on quiescent conidia and appressoria of C. acutatum in vitro and in vivo as well as in the severity of the PFDC. The VCs linalool, limonene, myrcene, nonanal and the mixture of them are, in general, inhibitory to the development of C. acutatum.

A podridão floral dos citros (PFC), causada por Colletotrichum acutatum, induz a abscisão de frutos jovens, podendo causar perdas de até 100%. A presença de inóculo viável na forma de conídios e/ou apressórios quiescentes na planta justifica a ocorrência generalizada da doença. Em períodos de chuva a PFC é agravada, possivelmente, em função de substâncias lavadas das diferentes partes da planta, as quais contêm metabólitos que estimulam o desenvolvimento do fungo. Diante do exposto, objetivou-se verificar o efeito das águas de lavagem brutas (ALBs) de flores, botões, folhas velhas (FV) e folhas novas (FN) e mistura destas sobre conídios, apressórios e hifas quiescentes de C. acutatum (isolados 61A e 142) in vitro e in vivo e sobre a severidade da PFC, bem como identificar substâncias presentes nas ALBs, exibindo a atividade biológica de interesse. Além disso, buscou-se verificar variações na composição das ALBs. O efeito de compostos voláteis brutos (CVBs) e os identificados a partir de laranjeira Valência (linalol, limoneno, mirceno, nonanal e a mistura destes) sobre o desenvolvimento do patógeno também foi avaliado. Todas as frações das ALBs estimularam a germinação dos conídios do fungo, sendo que a ALB de flores apresentou o maior estímulo para ambos os isolados. Para apressórios quiescentes (isolado 61A), o maior estímulo foi verificado nos tratamentos com ALBs de botões e da mistura e para conídios no tratamento mistura. Os maiores valores para comprimento do tubo germinativo foram observados nos tratamentos mistura, FN e botões. Para as estruturas quiescentes, o efeito das ALBs foi mais significativo para o isolado 142. Não foi observado efeito das ALBs sobre o micélio quiescente. Houve estímulo da germinação de conídios e ramificação de hifas in vivo, principalmente, em resposta ao tratamento com ALB de botões. A aplicação da ALB da mistura em flores resultou em maior severidade da PFC. Por sua vez, os CVBs apresentaram efeito inibitório. A exposição do isolado 61A aos voláteis (CVs) linalol, nonanal e mistura, resultou em germinação apenas na menor dose. O mirceno manteve a germinação semelhante a testemunha em todas as doses testadas, assim como limoneno nas doses de 0,005 a 0,25 µL mL-1. Todos os voláteis reduziram o comprimento do tubo germinativo. Para o isolado 142, houve redução em todas as variáveis para todas as doses dos CVs. Houve variações na composição das ALBs nas diferentes coletas, o que explica em parte a variação na capacidade de estímulo em alguns testes. Na ALB de flores, identificou-se a presença de cafeína, dos flavonóides glicosilados hesperidina e naringina, além de compostos glicosilados e peptídeos. Nas partes vegetais de laranjeira Valência foram identificados 54 CVs. As ALBs apresentam efeito estimulatório sobre conídios e apressórios quiescentes de C. acutatum in vitro e in vivo, bem como sobre a severidade da PFC. Os CVs linalol, limoneno, mirceno, nonanal e a mistura destes são, de forma geral, inibitórios ao desenvolvimento de C. acutatum. / The postbloom fruit drop of citrus (PFDC), caused by Colletotrichum acutatum, induces abscission of young fruits, and it may cause losses up to 100%. The presence of viable inoculum in the form of conidia and/or quiescent appressoria on the plant justifies the widespread occurrence of the disease. Under rain, the PFDC is increased, possibly due to substances washed from different parts of the plant, which contain metabolites that stimulate the development of the fungus. Therefore, we aimed to determine the effect of watery washing (WWs) of flowers, flower buds, old leaves (OL) and young leaves (YL) and the mixture of them on quiescent conidia and hyphae of C. acutatum (isolates 61A and 142) in vitro and in vivo and on the severity of the PFDC, and to identify substances in the WWs, exhibiting the biological activity of interest. In addition, variations in the composition of WWs were determinated. The effect of crude volatile compounds (CVCs) and those identified from Valencia sweet orange (linalool, limonene, myrcene, nonanal and the mixture of them) on the development of the pathogen was also evaluated. All fractions of WWs stimulated spore germination, and the flower WW exhibited the highest effect for both isolates. For quiescent appressoria (isolate 61A), the highest stimulus was observed in treatments with WWs from flower buds and the mixture and for quiescent conidia in the treatment mixture. The highest values for germ tube length were observed on the treatments mixture, YL and flower buds. For the quiescent structures, the effect of WWs was more significant for isolate 142. There was no effect of WWs on the quiescent mycelium. There was stimulation of conidia germination and hyphal branching in vivo in response mainly to treatment with WW from flower buds. The application of the mixture of WW in flowers resulted in higher severity of the PFDC. On the other hand, the CVCs showed inhibitory effect. Exposure of the isolate 61A to the volatiles (VCs) linalool, nonanal and the mixture of them, resulted in germination only at the lowest concentration. The germination on myrcene was similar to control at all doses tested as well as on limonene at doses from 0.005 to 0.25 mL mL-1. All volatiles reduced the length of the germ tube. In the case of isolate 142, a reduction in all variables for all concentration of VCs was observed. There were changes in the composition of WWs based upon times of harvesting, which partly explains the variations observed in the ability to stimulate the structures in some experiments. In flower WWs, we identified the presence of caffeine, the flavonol glycosides hesperidin and naringin, glycosylated compounds and peptides. In the plant parts of sweet orange \'Valencia\' were identified 54 VCs. The WWs have stimulatory effect on quiescent conidia and appressoria of C. acutatum in vitro and in vivo as well as in the severity of the PFDC. The VCs linalool, limonene, myrcene, nonanal and the mixture of them are, in general, inhibitory to the development of C. acutatum.

Brazil is the largest citrus producer in the world and has a large global citrus market share. However, several diseases affect the crop, being postbloom fruit drop (PFD) one of them. PFD has gained importance in São Paulo State for the displacement of citrus areas to regions with weather conditions more favorable for this disease. The accurate identification of the causal agent of the PFD has been performed and it was renamed as Colletotrichum abscissum. The origin of the initial inoculum is still an enigma for PFD epidemics and the hypotheses that the initial inoculum could be present in propagation material have been discussed but it has never been demonstrated. The objective of this work was to detect and quantify Colletotrichum abscissum from citrus leaves of budwood increase block and citrus nursery plants by qPCR. Four commercial citrus farms from São Paulo State, Brazil with budwood increase block and citrus nursery plants of Pera and Valencia sweet orange varieties were used for this work. C. abscissum was detected in budwood increase block and in nursery plant in both varieties (Valencia and Pera) at the four farms sampled. Out of 122 budwood increase block samples, 89 (73%) were positive for C. absicissum. From nursery plants, out of 175 samples, 129 (73%) were detected with the pathogen. The majority of the positive samples of budwood increase blocks and nursery plants contained 10 to 200 and 10 to 400 conidia of C. absicissum, respectively. With the methods used was not possible to isolate the fungus from vegetative material. This finding suggests a new long distances dispersion type of C. abscissum in the cycle of postbloom fruit drop by propagation material. Confirmation of C. abscissum in budwood increase block and nursery plants would lead to update regulations for the production of certified citrus nursery trees and searching for new control strategies of the pathogen. / O Brasil é o maior produtor de citros do mundo e possui uma grande participação no mercado global de citros. No entanto, várias doenças afetam a cultura, sendo uma delas a podridão floral dos citros (PFC). PFC ganhou importância no Estado de São Paulo pelo deslocamento de áreas de citros para regiões com condições climáticas mais favoráveis para a doença. A identificação precisa do agente causal do PFC foi realizada, tendo sido renomeado como Colletotrichum abscissum. A origem do inóculo inicial ainda é um enigma para as epidemias de PFC e as hipóteses do que o inóculo inicial poderia estar presente no material de propagação já foram discutidas, mas nunca foram demonstradas. O objetivo deste trabalho foi detectar e quantificar Colletotrichum abscissum em folhas de borbulheiras e mudas de citros por meio de qPCR. Neste trabalho, foram utilizadas quatro fazendas comerciais de citros do Estado de São Paulo, Brasil, com borbulheiras e viveiros de mudas de citros das variedades laranja Pera e Valência. C. abscissum foi detectado em borbulheiras e em mudas em ambas as variedades (Valência e Pêra) nas quatro fazendas amostradas. Das 122 amostras de folhas de borbulheiras, 89 (73%) foram positivas para C. absicissum. Das 175 amostras de folhas de mudas de citros, 129 (73%) foram detectadas com o patógeno. A maioria das amostras positivas de borbulheiras e mudas de citros continham 10 a 200 e 10 a 400 conídios de C. absicissum, respectivamente. Com os métodos utilizados, não foi possível isolar o fungo do material vegetativo. Esta descoberta sugere um novo tipo de dispersão a longas distâncias de C. abscissum no ciclo de podridão floral dos citros por meio do material de propagação. A confirmação de C. abscissum nas borbulheiras e mudas de citros levaria à atualização da regulamentação para a produção de mudas de citros certificadas e à busca de novas estratégias de controle do patógeno.

Brazil is the largest citrus producer in the world and has a large global citrus market share. However, several diseases affect the crop, being postbloom fruit drop (PFD) one of them. PFD has gained importance in São Paulo State for the displacement of citrus areas to regions with weather conditions more favorable for this disease. The accurate identification of the causal agent of the PFD has been performed and it was renamed as Colletotrichum abscissum. The origin of the initial inoculum is still an enigma for PFD epidemics and the hypotheses that the initial inoculum could be present in propagation material have been discussed but it has never been demonstrated. The objective of this work was to detect and quantify Colletotrichum abscissum from citrus leaves of budwood increase block and citrus nursery plants by qPCR. Four commercial citrus farms from São Paulo State, Brazil with budwood increase block and citrus nursery plants of Pera and Valencia sweet orange varieties were used for this work. C. abscissum was detected in budwood increase block and in nursery plant in both varieties (Valencia and Pera) at the four farms sampled. Out of 122 budwood increase block samples, 89 (73%) were positive for C. absicissum. From nursery plants, out of 175 samples, 129 (73%) were detected with the pathogen. The majority of the positive samples of budwood increase blocks and nursery plants contained 10 to 200 and 10 to 400 conidia of C. absicissum, respectively. With the methods used was not possible to isolate the fungus from vegetative material. This finding suggests a new long distances dispersion type of C. abscissum in the cycle of postbloom fruit drop by propagation material. Confirmation of C. abscissum in budwood increase block and nursery plants would lead to update regulations for the production of certified citrus nursery trees and searching for new control strategies of the pathogen. / O Brasil é o maior produtor de citros do mundo e possui uma grande participação no mercado global de citros. No entanto, várias doenças afetam a cultura, sendo uma delas a podridão floral dos citros (PFC). PFC ganhou importância no Estado de São Paulo pelo deslocamento de áreas de citros para regiões com condições climáticas mais favoráveis para a doença. A identificação precisa do agente causal do PFC foi realizada, tendo sido renomeado como Colletotrichum abscissum. A origem do inóculo inicial ainda é um enigma para as epidemias de PFC e as hipóteses do que o inóculo inicial poderia estar presente no material de propagação já foram discutidas, mas nunca foram demonstradas. O objetivo deste trabalho foi detectar e quantificar Colletotrichum abscissum em folhas de borbulheiras e mudas de citros por meio de qPCR. Neste trabalho, foram utilizadas quatro fazendas comerciais de citros do Estado de São Paulo, Brasil, com borbulheiras e viveiros de mudas de citros das variedades laranja Pera e Valência. C. abscissum foi detectado em borbulheiras e em mudas em ambas as variedades (Valência e Pêra) nas quatro fazendas amostradas. Das 122 amostras de folhas de borbulheiras, 89 (73%) foram positivas para C. absicissum. Das 175 amostras de folhas de mudas de citros, 129 (73%) foram detectadas com o patógeno. A maioria das amostras positivas de borbulheiras e mudas de citros continham 10 a 200 e 10 a 400 conídios de C. absicissum, respectivamente. Com os métodos utilizados, não foi possível isolar o fungo do material vegetativo. Esta descoberta sugere um novo tipo de dispersão a longas distâncias de C. abscissum no ciclo de podridão floral dos citros por meio do material de propagação. A confirmação de C. abscissum nas borbulheiras e mudas de citros levaria à atualização da regulamentação para a produção de mudas de citros certificadas e à busca de novas estratégias de controle do patógeno.

A migração da citricultura paulista das regiões norte e central para a região sudoeste, tem submetido a cultura à clima mais chuvoso e, consequentemente, à maior ocorrência da podridão floral dos citros (PFC). A PFC, cujo agente causal é C. acutatum, induz a abscisão de frutos jovens e pode causar perdas de 100%. Alguns componentes do monociclo dessa doença ainda encontram-se indefinidos. Os processos de sobrevivência e colonização têm sido sustentados por evidências oriundas de experimentos não conclusivos. Até o momento, os métodos de detecção não têm sido eficazes para detectar o patógeno em folhas assintomáticas de citros, além de não serem capazes de quantificá-lo. Diante dessas lacunas, esse trabalho buscou avaliar o período de sobrevivência do patógeno na superfície de folhas assintomáticas entre as floradas; verificar se o patógeno coloniza os tecidos das folhas de citros; estabelecer um método sensível para detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides na superfície foliar e; monitorar quantitativamente os patógenos em campos de produção de citros no Estado de São Paulo. A sobrevivência do patógeno foi avaliada em condições controladas, casa de vegetação e condições ambientais. Foi notado que o patógeno sobreviveu até sete meses em condições controladas, até dez meses em casa de vegetação e até seis meses sob condições ambientais. Chuvas regulares associadas ao molhamento foliar prolongado, auxiliaram na manutenção e sobrevivência do inóculo na superfície foliar. O processo de colonização do patógeno foi investigado por microscopia de luz, transmissão e confocal. Não foi observada colonização do patógeno em tecidos foliares. O peg de penetração proveniente dos apressórios penetrou a cutícula e ficou restrito numa camada péctica, acima da parede periclinal da epiderme. Diferentes métodos foram avaliados para a detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides em folhas de citros. Foi desenvolvida uma PCR em tempo real (qPCR) e uma PCR multiplex em tempo real (qPCR multiplex), ambas específicas e altamente sensíveis à detecção dos patógenos. O DNA da planta não influenciou na amplificação da qPCR. As qPCR foram muito mais sensíveis que a PCR convencional e Nested-PCR. Distintos métodos para processamento das amostras e para obtenção do DNA foram avaliados. O método do congelamento e a maceração do tecido foliar, foram os mais eficazes para o processamento da amostras e, a extração do DNA (CTAB ou Qiagen) foi melhor método de obtenção do DNA para quantificação dos patógenos. O spot e extração do DNA foram validados para a detecção dos patógenos tanto para a qPCR quanto para a qPCR multiplex. O monitoramento dos patógenos foi realizado em áreas localizadas em duas distintas regiões do Estado de São Paulo. Foi notado considerável aumento na quantidade de inóculo quando ocorreram chuvas regulares, com muitos dias com chuvas. O inóculo se concentrou no interior da copa em épocas com baixo volume de chuvas. A quantidade de inóculo de C. acutatum na área localizada em Santa Cruz do Rio Pardo foi consideravelmente maior que na área de Barretos e ambas apresentaram quantidades similares de C. gloeosporioides. / The migration of the citrus culture in São Paulo State from the northern and central regions to the south-western region submitted the culture to a wetter climate and, consequently, a higher incidence of postbloom fruit drop (PFD). PFD, whose causal agents are C. acutatum and C. gloeosporioides, induces the abscission of young fruits and can causes loss of 100% of the culture. Some monocycle components of this disease are still undetermined. The survival and colonization processes are supported by evidences from inconclusive experiments. To date, the detection methods have not been effective in detecting and quantifying the pathogen in asymptomatic citrus leaves. This study aimed to assess the survival period of C. acutatum on the surface of asymptomatic leaves between the flowering seasons, to verify whether the pathogen colonizes the tissues of citrus leaves of citrus, to establish a sensitive method for detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves surface and to monitor quantitatively the pathogens in citrus orchards in the State of São Paulo in Brazil. The survival of the pathogen was evaluated under controlled conditions, in a greenhouse and in environmental conditions. The pathogen survived for seven months under controlled conditions, ten months in a greenhouse and six months under environmental conditions. Regular rainfall associated with the prolonged leaf wetness favored the maintenance and survival of the inoculum on the leaf surface. The colonization process of the pathogen was investigated by light, confocal and transmission microscopy. Pathogen colonization was not observed on leaf tissues. The penetration peg from appressoria penetrated the cuticle and was restricted in a pectic layer on the periclinal epidermal wall. Different methods were evaluated for the detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves of citrus plants. It was developed a realtime PCR (qPCR) and a real-time multiplex PCR (qPCR multiplex), both specific and highly sensitive in the detection of pathogens. The plant DNA did not influence the qPCR amplification. The qPCRs were much more sensitive than the conventional PCR and Nested-PCR. Different methods for sample processing and for DNA extraction were evaluated. The freezing and maceration methods of foliar tissue were the most effective for sample processing and the DNA extraction (CTAB or Qiagen) was best method for extracting the DNA for pathogen quantification. The Spot and DNA extraction were validated for the detection of pathogens for both qPCR and multiplex qPCR. The monitoring of pathogens was carried out in two separate regions of the State of São Paulo in Brazil. It was observed a considerable increase in the number of inoculum when regular rainfall occurred, with many rainy days. The inoculum was concentrated within the tree canopy in seasons with low volume of rainfall. The number of inoculum of C. acutatum the at region of Santa Cruz do Rio Pardo was considerably higher than in the region of Barretos and both showed similar amounts of C. gloeosporioides.

A migração da citricultura paulista das regiões norte e central para a região sudoeste, tem submetido a cultura à clima mais chuvoso e, consequentemente, à maior ocorrência da podridão floral dos citros (PFC). A PFC, cujo agente causal é C. acutatum, induz a abscisão de frutos jovens e pode causar perdas de 100%. Alguns componentes do monociclo dessa doença ainda encontram-se indefinidos. Os processos de sobrevivência e colonização têm sido sustentados por evidências oriundas de experimentos não conclusivos. Até o momento, os métodos de detecção não têm sido eficazes para detectar o patógeno em folhas assintomáticas de citros, além de não serem capazes de quantificá-lo. Diante dessas lacunas, esse trabalho buscou avaliar o período de sobrevivência do patógeno na superfície de folhas assintomáticas entre as floradas; verificar se o patógeno coloniza os tecidos das folhas de citros; estabelecer um método sensível para detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides na superfície foliar e; monitorar quantitativamente os patógenos em campos de produção de citros no Estado de São Paulo. A sobrevivência do patógeno foi avaliada em condições controladas, casa de vegetação e condições ambientais. Foi notado que o patógeno sobreviveu até sete meses em condições controladas, até dez meses em casa de vegetação e até seis meses sob condições ambientais. Chuvas regulares associadas ao molhamento foliar prolongado, auxiliaram na manutenção e sobrevivência do inóculo na superfície foliar. O processo de colonização do patógeno foi investigado por microscopia de luz, transmissão e confocal. Não foi observada colonização do patógeno em tecidos foliares. O peg de penetração proveniente dos apressórios penetrou a cutícula e ficou restrito numa camada péctica, acima da parede periclinal da epiderme. Diferentes métodos foram avaliados para a detecção e quantificação de C. acutatum e C. gloeosporioides em folhas de citros. Foi desenvolvida uma PCR em tempo real (qPCR) e uma PCR multiplex em tempo real (qPCR multiplex), ambas específicas e altamente sensíveis à detecção dos patógenos. O DNA da planta não influenciou na amplificação da qPCR. As qPCR foram muito mais sensíveis que a PCR convencional e Nested-PCR. Distintos métodos para processamento das amostras e para obtenção do DNA foram avaliados. O método do congelamento e a maceração do tecido foliar, foram os mais eficazes para o processamento da amostras e, a extração do DNA (CTAB ou Qiagen) foi melhor método de obtenção do DNA para quantificação dos patógenos. O spot e extração do DNA foram validados para a detecção dos patógenos tanto para a qPCR quanto para a qPCR multiplex. O monitoramento dos patógenos foi realizado em áreas localizadas em duas distintas regiões do Estado de São Paulo. Foi notado considerável aumento na quantidade de inóculo quando ocorreram chuvas regulares, com muitos dias com chuvas. O inóculo se concentrou no interior da copa em épocas com baixo volume de chuvas. A quantidade de inóculo de C. acutatum na área localizada em Santa Cruz do Rio Pardo foi consideravelmente maior que na área de Barretos e ambas apresentaram quantidades similares de C. gloeosporioides. / The migration of the citrus culture in São Paulo State from the northern and central regions to the south-western region submitted the culture to a wetter climate and, consequently, a higher incidence of postbloom fruit drop (PFD). PFD, whose causal agents are C. acutatum and C. gloeosporioides, induces the abscission of young fruits and can causes loss of 100% of the culture. Some monocycle components of this disease are still undetermined. The survival and colonization processes are supported by evidences from inconclusive experiments. To date, the detection methods have not been effective in detecting and quantifying the pathogen in asymptomatic citrus leaves. This study aimed to assess the survival period of C. acutatum on the surface of asymptomatic leaves between the flowering seasons, to verify whether the pathogen colonizes the tissues of citrus leaves of citrus, to establish a sensitive method for detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves surface and to monitor quantitatively the pathogens in citrus orchards in the State of São Paulo in Brazil. The survival of the pathogen was evaluated under controlled conditions, in a greenhouse and in environmental conditions. The pathogen survived for seven months under controlled conditions, ten months in a greenhouse and six months under environmental conditions. Regular rainfall associated with the prolonged leaf wetness favored the maintenance and survival of the inoculum on the leaf surface. The colonization process of the pathogen was investigated by light, confocal and transmission microscopy. Pathogen colonization was not observed on leaf tissues. The penetration peg from appressoria penetrated the cuticle and was restricted in a pectic layer on the periclinal epidermal wall. Different methods were evaluated for the detection and quantification of C. acutatum and C. gloeosporioides on leaves of citrus plants. It was developed a realtime PCR (qPCR) and a real-time multiplex PCR (qPCR multiplex), both specific and highly sensitive in the detection of pathogens. The plant DNA did not influence the qPCR amplification. The qPCRs were much more sensitive than the conventional PCR and Nested-PCR. Different methods for sample processing and for DNA extraction were evaluated. The freezing and maceration methods of foliar tissue were the most effective for sample processing and the DNA extraction (CTAB or Qiagen) was best method for extracting the DNA for pathogen quantification. The Spot and DNA extraction were validated for the detection of pathogens for both qPCR and multiplex qPCR. The monitoring of pathogens was carried out in two separate regions of the State of São Paulo in Brazil. It was observed a considerable increase in the number of inoculum when regular rainfall occurred, with many rainy days. The inoculum was concentrated within the tree canopy in seasons with low volume of rainfall. The number of inoculum of C. acutatum the at region of Santa Cruz do Rio Pardo was considerably higher than in the region of Barretos and both showed similar amounts of C. gloeosporioides.