Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-21T14:15:29Z No. of bitstreams: 1 2013_AnabeleAzevedoLima.pdf: 3543950 bytes, checksum: 6ba8669583b959be92fa864df919b6e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-21T15:18:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AnabeleAzevedoLima.pdf: 3543950 bytes, checksum: 6ba8669583b959be92fa864df919b6e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-21T15:18:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AnabeleAzevedoLima.pdf: 3543950 bytes, checksum: 6ba8669583b959be92fa864df919b6e5 (MD5) / O Brasil destaca-se por ser um dos maiores exportadores de produtos agrícolas no mundo e diante dessa realidade a utilização de agrotóxicos impacta tanto o meio ambiente quanto a saúde pública. Uma alternativa a essa prática é a utilização de agentes biológicos no controle de pragas. Um exemplo é a utilização do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) no controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, sendo o maior exemplo mundial de sucesso de um vírus utilizado como bioinseticida. Os baculovírus são vírus de DNA fita dupla, específicos de artrópodes. Uma das características apresentada no genoma viral do isolado AgMNPV-2D está na ausência dos genes quitinase (chiA) e catepsina (v-cath). Essa ausência pode ser responsável por não ocorrer a liquefação e a melanização das larvas de A. gemmatalis mortas pela infecção com o AgMNPV-2D. O capítulo I do presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da expressão dessas proteínas em insetos infectados com AgMNPV recombinantes contendo esses genes derivados de dois baculovírus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). O vírus recombinante, contendo os genes chiA e v-cath provenientes do baculovírus CfDefNPV, (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) foi capaz de promover a liquefação e melanização do corpo das larvas de A. gemmatalis após a morte das mesmas, entretanto, o vírus vAgp2100Ac.chiA/v-cath, construído neste trabalho, não teve o mesmo efeito. Bioensaios com larvas neonatas e de terceiro instar de A. gemmatalis infectadas com o vírus recombinante vAgp2100Cf.chiA/v-cath apresentaram uma maior atividade inseticida. A CL 50 do vírus recombinante foi de 3 (para larvas neonatas) a 4 vezes (para larvas de 3º estágio) menor do que a CL 50 do vírus selvagem. A expressão dos genes chiA e v-cath durante a infecção de células de inseto pelo vírus recombinante foi analisada por qPCR e detectou a presença e aumento de transcritos dos genes a partir de 6 h até 72 h p.i. Outro exemplo à prática de utilização de agentes biológicos no controle de inseto-praga destaca-se o fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae. O capítulo II do presente trabalho propôs avaliar se a expressão de enzimas quitinase do fungo durante a infecção do vírus é capaz de aumentar a patogenicidade viral em larvas de Spodoptera frugiperda. Foi construído um vírus recombinante inserindo o gene de uma quitinase (chi2) do fungo entomopatogênico M. anisopliae no genoma do vírus AcMNPV, para avaliar o efeito da expressão heteróloga na patogenicidade do vírus recombinante. A CL 50 apresentada pelo vírus recombinante sugere um aumento na virulência quando comparado com o vírus selvagem e a quantidade de enzima detectada também apresentou maiores níveis em células de inseto infectadas com o vírus recombinante comparado ao vírus selvagem. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brazil stands out for being one of the largest exporters of agricultural products in the world, therefore the use of pesticides impacts on both the environment and public health. An alternative to this practice is the use of biological agents to control pests. An example is the use of baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) in the control of velvetbean caterpillar, A. gemmatalis, which is the greatest global example of successfully using a virus as a bio-insecticide. Baculoviruses are arthropod-specific double-stranded DNA viruses. One of the interesting features of the AgMNPV-2D isolateviral genome is the absence of chitinase (chiA) and cathepsin (v- cath) genes. This absence can be responsible for the lack of liquefaction and larval melanization in A. gemmatalis killed by AgMNPV-2D infection. Chapter I of this study intended to analyze the effect of these proteins expression in insects infected by recombinant AgMNPV containing these genes derived from two baculovirus (Choristoneura fumiferana defective nucleopolyhedrovirus - CfDefNPV e Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus - AcMNPV). The recombinant viruses containing the genes v-cath and chiA from the baculovirus CfDefNPV (vAgp2100Cf.chiA/v-cath) was able to promote the liquefaction and melanization of A. gemmatalis larvae bodies after their death, although the vAgp2100Ac.chiA/v-cath virus prepared in this study, did not present the same effect. Bioassays with third-instar neonate larvae of A. gemmatalis infected with the vAgp2100Cf.chiA/v-cath recombinant virus showed higher insecticidal activity. The LC 50 of the recombinant virus was from 3 (for neonate larvae) to 4 times (for 3rd larval stage) lower than the LC 50 of the wild-type virus. The expression of v-cath and chiA genes during infection of insect cells by the recombinant virus was analyzed by qPCR, which detected both the presence and the increase of gene transcripts from 6 h to 72 h p.i. Another noteworthy example of the practical use of biological agents to control insect pest is the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Chapter II of this study aimed to assess whether the expression of fungal chitinase enzymes during viral infection is able to increase viral pathogenicity in larvae of Spodoptera frugiperda. Constructs was made inserting a chitinase gene (chi2) from the entomopathogenic fungus M. anisopliae into the genome of AcMNPV virus, in order to evaluate the effect of heterologous expression in the recombinant virus pathogenicity. The LC 50 presented by the recombinant virus suggests an increase in virulence when compared to wild type virus and the amount of enzyme also showed the highest levels detected in insect cells infected with recombinant virus compared to wild virus.

Orientador: Marcelo Diniz Vitorino. / Dissertação (mestrado) - Universidade Regional de Blumenau, Centro de Ciências Tecnológicas, Programa de Pós-Graduação de Engenharia Florestal.

Orientadora : Profª Drª Ida Chapaval Pimentel / Co-orientadora : Profª Drª Mariana Porsani / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Microbiologia, parasitologia e patologia / Resumo: O cultivo de couve-manteiga (Brassica oleracea var. acephala) é acometido de infestações de diversas pragas, entre elas o pulgão da couve Brevicoryne brassicae (Hemiptera, Aphididae). O controle biológico é uma forma de contornar a proliferação destas sem utilizar agentes químicos agressivos. A redução destes diminui sua deposição sobre as plantas, contaminação de vias pluviais e consumo pela população. Fungos e actinobactérias são agentes microbianos utilizados por sua conhecida atividade entomopatogênica. Dentre estes, os retirados de sedimento marinho podem ser promissores no controle biológico, principalmente devido à adaptação às condições extremas deste ambiente. Neste sentido, foram avaliados cinco isolados fúngicos (Aspergillus versicolor, A. sydowii, Penicillium dipodomyicola, e Trichoderma harzianum), e cinco bacterianos (Streptomyces variabilis, S. seoulensis, S. cavourensis, S. parvus e S. bacillaris) em relação à letalidade contra B. brassicae. Os mais virulentos em cada categoria foram A. versicolor (100% de mortalidade em 48h) e S. variabilis (100% de mortalidade em 96h). Em seguida foi estipulada a Concentração Letal Média (CL50) para cada isolado (16,43 × 103 conídios.mL-1 e 0,20 × 107 células.mL-1, respectivamente). A concentração sub-letal (CL25) foi mensurada (0,32 × 103 conídios.mL-1 e 0,12 × 106 células.mL-1, respectivamente) e utilizada a fim de avaliar seus efeitos sobre os parâmetros de crescimento populacional de B. brassicae. Ambos não apresentaram efeito direto sobre a taxa líquida de reprodução, a duração média de uma geração, a taxa intrínseca de crescimento populacional, na razão finita de aumento populacional nem no tempo que a população leva para duplicar em número. A. versicolor também foi comparado a dois produtos comerciais, Methamax® e Bovemax®, apresentando mortalidade total similar a estes inseticidas. A aplicação de solução de S. variabilis alterou o comportamento alimentar de B. brassicae, resultando em uma redução de 75% das excretas. A. versicolor e S. variabilis mostram-se organismos promissores como agentes de biocontrole. Palavras-chave: Controle biológico, bioprospecção, concentração letal média, entomopatógeno. / Abstract: The kale crop (Brassica oleracea var. Acephala) is affected by infestations of various pests, including the cabbage aphid Brevicoryne brassicae (Hemiptera, Aphididae). Biological control is a way to reduce the proliferation of these without using harsh chemicals. Reducing these decreases their deposition on plants, contamination of storm tracks and consumption by the population. Fungi and actinomycetes are microbial agents used for their known entomopathogenic properties. Among these, isolates from marine sediment can be promising for biological control, mainly due to adaptation to extreme conditions of this environment. In this sense, we evaluated five fungal isolates (Aspergillus versicolor, A. sydowii, Penicillium dipodomyicola and Trichoderma harzianum) and five bacterial (Streptomyces variabilis, S. seoulensis, S. cavourensis, S. and S. parvus bacillaris) in relation to mortality against B. brassicae. The more virulent in each category were A. versicolor (100% mortality in 48 hours) and S. variabilis (100% mortality at 96h). Then it was stipulated the Mean Lethal Concentration (LC50) for each isolate (16,43 × 103 conidia.mL-1 and 0,20 × 107 cells.mL-1, respectively). The sub-lethal concentration (LC25) was measured (0,32 × 103 conidia.ml-1 and 0,12 × 106 cell.mL-1, respectively) and used in order to evaluate its effects on the parameters of population growth of B. brassicae. Both do not present a direct effect on the net reproductive rate, the average length of a generation, intrinsic rate of population growth, finite rate of population growth or the time the population takes to double in size. A. versicolor was also compared to two commercial products, Methamax® and Bovemax®, with total mortality similar to them. The application of S. variabilis solution changed the feeding behavior of B. brassicae, resulting in a reduction of 75 % of the excreta. A. versicolor and S. variabilis are shown promising organisms as this aphid control agents. Keywords: Biological control, bioprospecting, median lethal concentration, entomopathogen

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-04-03T11:36:04Z No. of bitstreams: 1 2012_ FabriciodaSilvaMorgado.pdf: 4901007 bytes, checksum: 8b12854ca2ed846876f2f45f52dfc5db (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-03T16:40:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ FabriciodaSilvaMorgado.pdf: 4901007 bytes, checksum: 8b12854ca2ed846876f2f45f52dfc5db (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-03T16:40:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ FabriciodaSilvaMorgado.pdf: 4901007 bytes, checksum: 8b12854ca2ed846876f2f45f52dfc5db (MD5) / O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) é um dos melhores exemplos do uso de um vírus para controlar a população de um inseto-praga. Este baculovírus infecta larvas da mariposa Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), uma peste do cultivo de soja, e tem sido utilizado como agente de controle biológico no Brasil por mais de duas décadas. Isto depende da habilidade deste vírus gerar dois fenótipos virais, um responsável pela sobrevivência no ambiente fora do hospedeiro, o corpo de oclusão (OB), que é usado como bioinseticida, o outro fenótipo é responsável pela infecção sistêmica, o budded virus (BV), que é uma partícula viral envelopada por membrana da célula hospedeira. Estes dois fenótipos ocorrem em momentos distintos da infecção celular, os BVs na fase tardia e os OBs na fase muito tardia. A regulação temporal e quantitativa da expressão gênica em baculovírus é baseada em transcrição, isto é, a expressão dos genes virais é determinada pela sequência dos promotores que regulam os genes. Neste trabalho, foram isolados os promotores dos genes ie1, gp64, vp39, p6.9, polh, p10 e hel, do baculovírus AgMNPV, e o promotor CMVie1 do Herpesvírus humano CMV, estas sequências reguladoras foram clonadas a montante do gene luciferase de vaga-lume e, a partir disto, baculovírus AgMNPV recombinantes foram construídos por recombinação homóloga. Isto permitiu avaliar a atividade de cada promotor durante a infecção de células de inseto permissivas e não-permissivas, além de quantificar a atividade dos promotores durante a infecção de larvas Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda. Os promotores vp39, p6.9 e polh foram os mais produtivos nos ensaios de expressão em células de inseto e lagartas. Também foi possível confirmar que o AgMNPV é capaz de transduzir células de mamíferos cultivadas in vitro. Este trabalho serve como uma demonstração do uso do baculovírus AgMNPV como vetor de expressão de proteínas heterólogas. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) is one of the best examples of the use of a virus to control an insect pest in agriculture worldwide. This baculovirus infects larvae of Anticarsia gemmatalis moth (Lepidoptera), a soy bean pest, and has been used as a successful biocontrol agent in Brazil for over two decades. This depends on the unique ability to generate two viral phenotypes, one responsible for the viral survival in the environment outside the host and the agent of primary infection, which consists of viral particles encapsulated into a polyhedral shaped protein crystal, the occlusion body (OB), which is used as a bioinsecticide, and a second phenotype, the budded virus (BV), which is a single membrane-containing viral particle. The temporal and quantitative regulation of gene expression in baculoviruses is transcription based, that is, the expression is determined by the sequence of the gene regulating promoters. In this work, the promoters of the AgMNPV ie1, gp64, vp39, p6.9, polh, p10 and hel genes and the Herpesvirus CMVie1 promoter, have been isolated and cloned upstream of the firefly luciferase gene, and recombinant AgMNPV baculoviruses were constructed by homologous recombination. The activity of each promoter was analysed during permissible and non-permissible insect cell infections, and during the infection of the Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larvae. The vp39, p6.9 and polh promoters were the most efficient in the protein expression assays conducted in insect cells and larvae. It was also possible to confirm that the AgMNPV baculovirus is capable of transducing mammalian cells grown in vitro. This work is a demonstration of the biotecnological potential of the AgMNPV baculovirus as a vector for the expression of heterologous proteins.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-23T13:51:26Z No. of bitstreams: 1 2013_LunalvaAurelioPedrosoSallet.pdf: 2550245 bytes, checksum: 770a7daceae14893e8f854d2a5081ff8 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-03T12:26:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LunalvaAurelioPedrosoSallet.pdf: 2550245 bytes, checksum: 770a7daceae14893e8f854d2a5081ff8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-03T12:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LunalvaAurelioPedrosoSallet.pdf: 2550245 bytes, checksum: 770a7daceae14893e8f854d2a5081ff8 (MD5) / A avicultura industrial brasileira destaca-se como uma das atividades mais dinâmicas no país, entretanto os ataques de insetos-praga estão aumentando e preocupando os produtores. Dentre estas pragas avícolas, destaca-se o Alphitobius diaperinus (Panzer, 1797) (Coleoptera: Tenebrionidae), popularmente conhecido como cascudinho da cama de frangos. Uma alternativa para o controle desses insetos é a utilização de agentes de controle biológico, como Bacillus thuringiensis, bactéria que sintetiza diferentes proteínas tóxicas a muitas pragas. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar estirpes de B. thuringiensis tóxicas ao cascudinho da cama de frangos. Este trabalho está dividido em quatro etapas. Na primeira foi feita uma revisão sobre avicultura, A. diaperinus e B. thuringiensis, ecologia e modo de ação. Na segunda parte descreve o estabelecimento de uma criação massal de A. diaperinus em laboratório. Esta criação está estabelecida e encontra-se na oitava geração de laboratório, fato ainda não descrito na literatura. A terceira parte descreve a identificação de estirpes tóxicas a A. diaperinus, a caracterização bioquímica e molecular, a toxicidade das estripes e a ligação das toxinas a proteínas localizadas na borda escovada de células do intestino médio de A. diaperinus. Foram testadas 193 estirpes de B. thuringiensis e dessas duas estirpes se destacaram: a estirpe nativa S1806 que causou 60% de mortalidade e a estirpe de B. thuringiensis recombinante S2492 que causou mortalidade de 80% a A. diaperinus. Os resultados obtidos no ensaio de ligação com as membranas contendo as BBMV’s das larvas de A. diaperinus demonstraram ligações à marcação com biotina das proteínas Cry10, Cry1Ab e Cry4B, sendo a marcação mais forte com a proteína Cry10. A quarta parte descreve o estabelecimento de um marcador para a identificação de A. diaperinus. Para este estudo foi utilizado oligonucleotídios de mtDNA, seguido de análises por PCR-RFLP que apresentaram perfis eletroforéticos, que permitiram o estabelecimento de um marcador para identificação de A. diaperinus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Brazilian poultry industry stands out as one of the most dynamic in the country, however the attacks of insect pests are increasing and worrying producers. Among these pests poultry, highlight the Alphitobius diaperinus (Panzer, 1797) (Coleoptera: Tenebrionidae), popularly known as mealworm from broiler litter. An alternative for the control of these insects is the use of biological control agents such as Bacillus thuringiensis, a bacterium that synthesizes proteins toxic to many different pests. The aim of this study was to identify and characterize strains of B. thuringiensis toxic to catfish from broiler litter. This paper is divided into four stages. The first was made a revision on poultry, A. diaperinus and B. thuringiensis, ecology and mode of action. The second part describes the establishment of a mass rearing of A. diaperinus laboratory. This creation is established and is the eighth generation of the laboratory, a fact not yet described in the literature. The third section describes the identification of strains toxic to A. diaperinus, the biochemical and molecular characterization, the toxicity of strains and toxins binding to proteins located on the edge brushed midgut cells of A. diaperinus. 193 were tested strains of B. thuringiensis strains and these two stood out: S1806 native strain that caused 60 % mortality and strain of B. thuringiensis recombinant S2492 that caused 80% mortality to A. diaperinus . The results of the binding assay with membranes containing the BBMV 's larvae of A. diaperinus connections shown biotin labeling of proteins Cry10 , Cry1Ab and Cry4B , the marking being stronger with the protein Cry10 . The fourth section describes the establishment of a marker identifying A. diaperinus. For this study we used primers of mtDNA, followed by PCR-RFLP analysis showed that electrophoretic profiles, allowing the establishment of a marker for identification of A. diaperinus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-03-21T13:05:26Z No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-03-21T13:45:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T13:45:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_PablineMarinhoVieira_Parcial.pdf: 10665470 bytes, checksum: f1332eb503825366aa2631b295e58808 (MD5) / Trichoderma harzianum é um microorganismo de controle biológico eficaz contra várias espécies de patógenos de plantas. Dentre estes, Fusarium solani é um importante causador de prejuízos econômicos na agricultura. Nesse trabalho, através de bibliotecas subtrativas (SSH) e RT-PCR tempo real, foram identificados genes de T. harzianum que estão envolvidos no controle biológico deste fitopatógeno. A análise comparativa de respostas transcricionais em Trichoderma harzianum permitiu uma interpretação abrangente do micoparasitismo, identificou genes marcadores para o biocontrole, e principalmente, de interesse biotecnológico na agricultura. Como os desafios em biotecnologia agrícola incluem identificar genes para estratégias de resistência a estresses bióticos e abióticos em plantas, uma aquaporina identificada nesta biblioteca foi utilizada para a transformação genética de Trichoderma harzianum e Nicotianatabacum (tabaco). Organismos geneticamente modificados com o gene codificador de uma aquaporina foram avaliados em diferentes condições de estresses abióticos (etanol, peróxido de hidrogênio, polietileno-glicol, sorbitol e cloreto de sódio) e biótico (Fusarium solani). Em condições ótimas de crescimento, não foram observadas alterações na germinação ou crescimento em T. harzianum e tabaco. Em ensaios de tolerância a Fusarium solani, linhagens de plantas geneticamente modificadas não apresentaram resistência ao fitopatógeno. Entretanto, nas condições de estresse abióticos avaliadas, aquaporina aumentou a tolerância a estresse salino em ambos os organismos transformados. Sendo assim, nossos resultados confirmam o elevado potencial de T. harzianum como fonte de genes com aplicações promissoras em plantas transgênicas resistentes a estresses abióticos sem alteração fenotípica. / Trichoderma harzianum, a filamentous soil fungus, is an effective biocontrol agent against many plant-pathogen species. Despite its relevance in plant protection, there is a lack of studies concerning its use as a biological control agent against Fusarium solani, which is involved in several crop diseases. In order to provide information about the genes from T. harzianum that are involved in the biocontrol of this pathogen, we have used subtractive library hybridization (SSH) and RT-PCR techniques. Transcriptional responses in Trichoderma harzianum allowed a comprehensive interpretation of my coparasitism, identified biocontrol-related genes, and also genes of biotechnological value. Following its identification in our library, a gene encodinganaquaporinhasbeenusedtoenhancetolerancetobioticandabioticstresses in both Trichoderma harzianum and Nicotiana tabacum plants. Transformants were selected and evaluated underdifferent abiotic (ethanol, hydrogen peroxide, polyethyleneglycol, sorbitol and sodium chloride) andbiotic (Fusarium solani) stresses. Analysis under stress-free condition showed that both Trichoderma harzianum and to bacco plants transformed with aquaporin did not present differences in growth and germination rates when compared with wild type. Furthermore, potential tolerance against Fusarium solani was assessed in plants by challeng in gleaves with the pathogen and no tolerance was observed in all lines tested. However, evaluations under abiotic stresses revealed that both organisms presented tolerance to salt stresses. Our results under scorethe high potential of T. harzianum as a sourceof genes with promising applications in transgenic plants resistant to abiotic stresses without phenotypic alteration.

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3083.pdf: 2248132 bytes, checksum: e9e87339e9e37807b3fca15951f08511 (MD5) Previous issue date: 2010-05-10 / The objective of the present research was to study the practical viability of Bacillus subtilis (ACB-69) to control Colletotrichum acutatum, the casual agent of postbloom fruit drop (PFD) under field conditions. First, the bacteria was tested in two different concentrations, one at 5% and the other at 10 %, in the experiment conducted on Pera Sweet orange plants grafted on cravo lemon trees (11 years of planting), in a private property located in Botucatu, São Paulo State, Brazil during the 2007/2008 season. The same treatments were repeated in the following season, however, with or without adding a carbon source (molasses at 5%), on Valencia orange plants grafted on Rangpur lime trees (15 years old). Additional studies were also carried out under the same conditions, aiming to determine the most appropriate growth stages of flowers to apply the biocontrol agent, for the best disease control. For all experiments, the biological products were applied with an air assisted sprayer with the additional intent of evaluating its practicality. It was verified that vi the weekly application of B. subtilis at 5% reduced the quantity of symptomatic flowers by 47%, while the chemical treatment only showed an18% efficiency when compared to the control. On the other hand, weekly applications of B. subtilis (at 10%) or with one week before the application of the other biological treatments caused a greater average number of effective fruits (ANEF). The addition of a carbon source at the moment of application may favor the antagonism of the bacteria; however, the addition is optional, particularly when its ANEF is evaluated. The best moment to apply the ACB-69 isolate to control PFD was in the open flower stage, when the percentage of symptomatic flowers was evaluated, however, when the bacteria is applied during all flowering stages there is a greater quantity of effective fruits per plant. The use of the air assisted sprayer was considered efficient for the antagonistic application, allowing a better distribution of the inoculum on the plant without damaging the bacterial cells, hence, enabling it to be an indication for future microorganism applications to control diseases. / O presente trabalho teve por objetivo estudar a viabilidade prática de Bacillus subtilis no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da Queda Prematura dos Frutos Cítricos (QPFC), sob condições de campo. Primeiramente, a bactéria foi testada em duas concentrações diferentes, a 5 e 10%, em experimento realizado em plantas de laranja Valencia enxertada sobre limoeiro Cravo (11 anos de plantio), em propriedade particular localizada no município de Botucatu, São Paulo, Brasil, durante a safra de 2007/2008. Os mesmos tratamentos foram repetidos na safra subseqüente, porém, acrescidos ou não de uma fonte de carbono (melaço a 5%), em plantas de laranjeira Valência enxertada sobre limão Cravo (15 anos de idade). Estudo adicional foi também realizado, nas mesmas condições, visando determinar o melhor estágio de desenvolvimento da flor para aplicação do agente de biocontrole, e, assim otimizar o controle da doença. As aplicações dos produtos foram realizados com uso de turboatomizador tratorizado, com o intuito adicional de avaliar a sua praticidade. Verificou-se que a aplicação de B. subtilis a 5% semanalmente, a quantidade de flores com sintomas foi reduzida em 47%, enquanto o tratamento químico apresentou uma eficiência de apenas 18%, quando em comparação com a testemunha. Por outro lado, B. subtilis (a 10%) aplicado semanalmente ou, com uma semana antes da aplicação dos demais tratamentos biológicos, proporcionou maior numero médio de frutos efetivos (NMFE). O acréscimo de uma fonte de carbono, no momento da aplicação, pode favorecer o antagonista da bactéria, no entanto, a adição é facultativa, principalmente, quando se avalia o NMFE. O melhor momento de aplicação do isolado ACB-69 para controle da PFC foi na fase de flor aberta, quando se avaliou a porcentagem de flores com sintomas, porém, quando a bactéria é aplicada em todos os estádios de florescimento, obtém-se uma maior quantidade de frutos efetivos na planta. A utilização do turboatomizador foi considerada eficiente para aplicação do antagônico, permitindo uma melhor distribuição do inoculo pela planta, não acarretando danificações nas células bacterianas, podendo, portanto, ser uma indicação para aplicações futuras do microrganismo para controle de doenças.

Made available in DSpace on 2016-06-02T18:57:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3083.pdf: 2248132 bytes, checksum: e9e87339e9e37807b3fca15951f08511 (MD5) Previous issue date: 2010-05-10 / The objective of the present research was to study the practical viability of Bacillus subtilis (ACB-69) to control Colletotrichum acutatum, the casual agent of postbloom fruit drop (PFD) under field conditions. First, the bacteria was tested in two different concentrations, one at 5% and the other at 10 %, in the experiment conducted on Pera Sweet orange plants grafted on cravo lemon trees (11 years of planting), in a private property located in Botucatu, São Paulo State, Brazil during the 2007/2008 season. The same treatments were repeated in the following season, however, with or without adding a carbon source (molasses at 5%), on Valencia orange plants grafted on Rangpur lime trees (15 years old). Additional studies were also carried out under the same conditions, aiming to determine the most appropriate growth stages of flowers to apply the biocontrol agent, for the best disease control. For all experiments, the biological products were applied with an air assisted sprayer with the additional intent of evaluating its practicality. It was verified that the weekly application of B. subtilis at 5% reduced the quantity of symptomatic flowers by 47%, while the chemical treatment only showed an18% efficiency when compared to the control. On the other hand, weekly applications of B. subtilis (at 10%) or with one week before the application of the other biological treatments caused a greater average number of effective fruits (ANEF). The addition of a carbon source at the moment of application may favor the antagonism of the bacteria; however, the addition is optional, particularly when its ANEF is evaluated. The best moment to apply the ACB-69 isolate to control PFD was in the open flower stage, when the percentage of symptomatic flowers was evaluated, however, when the bacteria is applied during all flowering stages there is a greater quantity of effective fruits per plant. The use of the air assisted sprayer was considered efficient for the antagonistic application, allowing a better distribution of the inoculum on the plant without damaging the bacterial cells, hence, enabling it to be an indication for future microorganism applications to control diseases. / O presente trabalho teve por objetivo estudar a viabilidade prática de Bacillus subtilis no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da Queda Prematura dos Frutos Cítricos (QPFC), sob condições de campo. Primeiramente, a bactéria foi testada em duas concentrações diferentes, a 5 e 10%, em experimento realizado em plantas de laranja Valencia enxertada sobre limoeiro Cravo (11 anos de plantio), em propriedade particular localizada no município de Botucatu, São Paulo, Brasil, durante a safra de 2007/2008. Os mesmos tratamentos foram repetidos na safra subseqüente, porém, acrescidos ou não de uma fonte de carbono (melaço a 5%), em plantas de laranjeira Valência enxertada sobre limão Cravo (15 anos de idade). Estudo adicional foi também realizado, nas mesmas condições, visando determinar o melhor estágio de desenvolvimento da flor para aplicação do agente de biocontrole, e, assim otimizar o controle da doença. As aplicações dos produtos foram realizados com uso de turboatomizador tratorizado, com o intuito adicional de avaliar a sua praticidade. Verificou-se que a aplicação de B. subtilis a 5% semanalmente, a quantidade de flores com sintomas foi reduzida em 47%, enquanto o tratamento químico apresentou uma eficiência de apenas 18%, quando em comparação com a testemunha. Por outro lado, B. subtilis (a 10%) aplicado semanalmente ou, com uma semana antes da aplicação dos demais tratamentos biológicos, proporcionou maior numero médio de frutos efetivos (NMFE). O acréscimo de uma fonte de carbono, no momento da aplicação, pode favorecer o antagonista da bactéria, no entanto, a adição é facultativa, principalmente, quando se avalia o NMFE. O melhor momento de aplicação do isolado ACB-69 para controle da PFC foi na fase de flor aberta, quando se avaliou a porcentagem de flores com sintomas, porém, quando a bactéria é aplicada em todos os estádios de florescimento, obtém-se uma maior quantidade de frutos efetivos na planta. A utilização do turboatomizador foi considerada eficiente para aplicação do antagônico, permitindo uma melhor distribuição do inoculo pela planta, não acarretando danificações nas células bacterianas, podendo, portanto, ser uma indicação para aplicações futuras do microrganismo para controle de doenças.

Nomuraea rileyi é um entomofungo que infecta principalmente lepidópteros representantes da superfamília Noctuoidea, que inclui pragas-chave de diversas culturas de grande importância econômica. No entanto, a susceptibilidade das espécies a este agente é variável, mesmo entre representantes da mesma família e até de mesmo gênero. Um dos fatores responsáveis por esta susceptibilidade diferenciada pode ser a composição lipídica da cutícula larval. O objetivo deste estudo foi avaliar a estrutura e composição cuticular de larvas de lepidópteros e sua relação com a susceptibilidade a N. rileyi. Foram utilizadas as espécies Anticarsia gemmatalis, Mythimna sequax, Rachiplusia nu e Spodoptera cosmioides e duas linhagens do fungo (CH87551 e UB93150). Larvas de segundo instar foram obtidas a partir da criação massal no Laboratório de Controle de Pragas da Universidade de Caxias do Sul e submetidas a suspensões de 107, 108 e 109 conídios/mL por 24 horas e após, transferidas para recipientes de 200mL contendo dietas artificiais específicas. Os bioensaios foram mantidos em condições controladas e avaliados diariamente por 14 dias. Para análise da composição lipídica cuticular, exúvias oriundas da metamorfose larval-pupal foram submetidas à extração com hexano e posteriormente à diclorometano-metanol. Para obtenção das exúvias de M. sequax, as larvas foram alimentadas com Lolium multiflorum. Os extratos obtidos foram analisados por cromatografia de camada delgada e seus componentes separados por cromatografia em coluna aberta, cujas frações resultantes foram analisadas por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas (GCMS). Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram obtidas de larvas de segundo ínstar de cada espécie, submetidas uma suspensão de 108 conídios/mL e analisadas 24, 48 e 72 horas após a exposição ao patógeno. Os resultados demonstraram que as espécies avaliadas foram diferentemente afetadas por N. rileyi e, mesmo pelas diferentes linhagens avaliadas. A CL50 (log dose) obtida com as linhagens CH e UB foi de 6,73 e 7,97 para A. gemmatalis e 8,26 e 9,16 para R. nu respectivamente. S. cosmioides foi susceptível apenas à linhagem UB, porém a taxa de mortalidade foi de apenas 11,5% na maior concentração e M. sequax não foi susceptível a nenhuma das linhagens avaliadas. A composição lipídica cuticular apresentou diferenças quali-quantitativas entre as larvas. Os principais componentes identificados em A gemmatalis, M. sequax e R nu foram hidrocarbonetos, respondendo por 72,3, 74,5 e 83,6% respectivamente, com menor diversidade de compostos para M. sequax. Ácidos graxos lineares e ramificados (C14 a C20) foram identificados, com diferentes composições em cada uma das espécies. Identificou-se um aldeído e um álcool graxo em A. gemmatalis e outro aldeído graxo em R. nu. Em S. cosmioides, o componente majoritário identificado foi vitamina E, com mais de 70%. Nas imagens de MEV foi possível observar conídios de N. rileyi aderidos à superfície cuticular das quatro espécies avaliadas, especialmente na região abdominal e nos pseudopodes, mesmo depois de 48 horas após contato, sobretudo em S. cosmioides e M. sequax, espécies nas quais muitos dos conídios visualizados apresentaram tubo germinativo crescendo paralelamente à superfície. As espécies que se mostraram mais susceptíveis nestes bioensaios foram as que apresentaram, além de grandes quantidades de alcanos, as maiores diversidades destes compostos. As espécies menos susceptíveis apresentaram pouca quantidade e/ou variedade de alcanos ou ainda algum composto antioxidante, como no caso da vitamina E. Os resultados obtidos sugerem que, além das diferenças na composição lipídica e na estrutura cuticular das larvas, a variabilidade de N. rileyi pode estar relacionada à susceptibilidade diferenciada observada nas espécies, no entanto o potencial de uso deste agente como ferramenta no manejo integrado de pragas é considerável e precisa ser mais bem compreendido e explorado. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-17T13:31:41Z No. of bitstreams: 1 Tese Edegar Fronza.pdf: 3725314 bytes, checksum: 32cc4a3977412216d6e2f6670f9ae4b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-17T13:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Edegar Fronza.pdf: 3725314 bytes, checksum: 32cc4a3977412216d6e2f6670f9ae4b1 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Nomuraea rileyi is an entomofungus that mainly infects lepidopteran representatives of the Noctuoidea superfamily, which includes key-pests of various crops of large economic importance. Nevertheless, the susceptibility of species in relation to this agent is variable, even among representatives of the same family or genus. One of the factors responsible for this differentiated susceptibility might be the lipid composition of the larval cuticle. The aim of this study was to assess the cuticular structure and composition of lepidopteran larvae and their relationship with the susceptibility to N. rileyi fungi. The species Anticarsia gemmatalis, Mythimna sequax, Rachiplusia nu and Spodoptera cosmioides and two strains of the fungus (CH87551 and UB93150) were used. Second instar larvae were obtained from the mass creation of the Pest Control Laboratory at the University of Caxias do Sul and subjected to suspensions of 107, 108 and 109 conidia/mL for 24 hours and subsequently transferred to 200mL containers containing specific artificial diets. The bioassays were maintained in controlled conditions and assessed daily for 14 days. In order to perform an analysis of the cuticular lipid composition, exuviae derived from the larval-pupal metamorphosis were subjected to extraction with hexane and with dichloromethane-methanol afterwards. For obtaining the M. sequax exuviae, the larvae were fed with Lolium multiflorum. The obtained extracts were analyzed by means of slender layer chromatography and their components were separated using open column chromatography components, whose resulting fractions were analyzed through gas chromatography attached to mass detector (GCMS). Images of scanning electron microscopy (SEM) were obtained from second instar larvae of each species, subjected to a suspension of 108 conidia/mL and analyzed 24, 48 and 72 hours after exposure to the pathogen. The results showed that the assessed species were differently affected by N. rileyi fungi or even by different assessed strains. The LC50 (log dose) obtained with the CH and UB strains was 6,73 and 7,97 for A. gemmatalis and 8,26 and 9,16 for R. nu respectively. S. cosmioides was susceptible only to the UB strain, but the mortality was limited to 11.5% in the highest concentration and M. sequax was not susceptible to any of the assessed strains. The cuticular lipid composition showed qualitative and quantitative differences between the larvae. The main components identified in A. gemmatalis, M. sequax and R. nu were hydrocarbons, accounting for 72,3, 74,5 and 83,6% respectively, with lower diversity of compounds for M. sequax. Linear and branched fatty acids (C14 to C20) have been identified, with different compositions in each one of the species. It was found an aldehyde and a fatty alcohol in A. gemmatalis and other fatty aldehyde in R. nu. In S. cosmioides, the major identified component was vitamin E, with more than 70%. In the SEM images, it was possible to observe conidia of N. rileyi attached to the cuticular surface of the four assessed species, especially in the abdominal region and in pseudopods, even after 48 hours of contact, mainly in S. cosmioides and M. sequax, species in which many observed conidia showed germ tube growing in tandem with the surface. The species that were more likely in these bioassays were the ones that presented, in addition to large amounts of alkanes, the greatest diversities of these compounds. The less susceptible species showed little quantity and/or variety of alkanes or even some antioxidant compound, as in the case of the vitamin E. The obtained results suggest that, besides differences in the lipid composition and cuticular structure of the larvae, the variability of N. rileyi might be related to the differentiated susceptibility observed in species, however, the potential usage of this agent as a tool for holding an integrated pest management is sizeable and needs to be better understood and explored.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-07T17:49:19Z No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-15T14:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T14:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MarcellaTelesdosReis.pdf: 3786731 bytes, checksum: 10325c274157e8e088a67c87d434c89c (MD5) / O Brasil se destaca no cenário mundial como um dos principais produtores de feijão. Entretanto, vários problemas fitossanitários contribuem para redução da renda líquida auferida na exploração da cultura, entre os quais, o mofo branco e a podridão de escleródio, causadas pelos fungos Sclerotinia sclerotiorum (SS) e Sclerotium rolfsii (SR), respectivamente, reconhecidas como principais doenças do feijão. O controle biológico, pelo uso de Trichoderma tem sido proposto como um dos métodos de manejo das doenças. Espécies desse gênero possuem grande importância agronômica e atuam como decompositores primários de matéria orgânica, destacando-se também pela produção de metabólitos e enzimas com propriedades antifúngicas. Em face disso, o trabalho foi conduzido com o objetivo de identificar isolados de Trichoderma com potencial de uso contra SS e SR. Cento e quarenta e nove isolados foram testados in vitro e 50 destes foram pré-selecionados e identificados com base no seqüenciamento das regiões ITS e TEF do rDNA. Dentre esses, foram identificadas sete espécies do gênero Trichoderma: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale e T. erinaceum. Vinte isolados foram testados em casa de vegetação. Resultados desse estudo mostram que, in vitro, 10,6% dos isolados testados contra SS e 14% contra SR apresentaram nota 1 no pareamento de cultura; 15,33% dos isolados para SS e 4,6% para SR mostram níveis elevados de antagonismo quanto a inibição micelial do patógeno por metabólitos não-voláteis. Dos 20 isolados selecionados para os estudos em casa de vegetação, quatro se destacaram: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) e CEN189 (T. spirale) sobre os demais quanto a promoção de crescimento. A técnica de identificação por MALDI TOF MS foi utilizada com oito dos isolados de Trichoderma previamente identificados com base no sequenciamento de fragmentos do DNA, agrupando-se de acordo com as espécies, conforme o esperado e formando clados no dendograma. Metabólito bruto extraído do isolado CEN277 (T. asperellum) foi analisado em HPLC e mostrou grande potencial quanto à inibição do crescimento micelial de S. sclerotiorum. As técnicas utilizadas com cromatografia líquida e MALDI TOF MS, embora iniciais, proporcionaram resultados interessantes e necessitam de mais dedicação para a obtenção de resultados conclusivos na identificação das moléculas envolvidas. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brazil stands out in the global scenario as one the leading producers of beans. However, many phytossanitary problems contribute to a reduction of yield, including white mold and sclerotia rot, caused by the fungi Sclerotinia sclerotiorum (SS) and Sclerotium rolfsii (SR) respectively, whith are recognized as major bean diseases. Biological control using Trichoderma has been proposed as a method of managing these diseases. Species of this genus are, of great agronomic interest and act as primary decomposers of organic material and are, also highlighted by the production of enzymes and metabolites with antifungal properties. For this reason, this study was conducted in order to identify Trichoderma isolates able to implement the biocontrol of these diseases. One hundred forty-nine isolates were tested in vitro and 50 of these were pre-selected and identified based on sequencing of the TEF and ITS regions of rDNA. Seven species of Trichoderma have been identified based on molecular characterization: T. harzianum, T. stromaticum, T. koningiopsis, T. asperellum, T. tomentosum, T. spirale and T. erinaceum. Among fifty isolates, 20 were tested under greenhouse conditions. Results of this study show that, in vitro, 10.6% of the isolates tested against SS and 14% against SR reached note 1 in paired culture; 15.33% of the isolates for SS and 4.6% for SR show elevated levels of antagonism regarding pathogen mycelial inhibition by non-volatile metabolits. From 20 isolates selected for studies under greenhouse conditions, four stood out compared to others, as promoting growth: CEN207 (T. koningiopsis), CEN188 (T. spirale), CEN200 (T. koningiopsis) and CEN189 (T. spirale). The technique of identification by MALDI TOF MS was used with eight isolates of Trichoderma previously identified based on DNA sequencing, grouped according to the species, as expected forming a clade on the dendrogram. Crude metabolite extracted from the CEN277 (T. asperellum) was analyzed by HPLC and showed great potential for the inhibition of mycelial growth of S. sclerotiorum. The techniques used in liquid chromatography and MALDI TOF MS, although preliminars, have provided interesting results and motivate further studies to identils the involved molecule.