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Význam replikačně defektních prasečích endogenních retrovirů při xenotransplantaci / The significance of porcine replication defect endogenous retroviruses in xenotransplantation

Daniel, Petr January 2014 (has links)
The shortage of human tissues and organs for allotransplantation can be overcome by xenotransplantation. As a source of organs, the miniature pig is convenient. However, the presence of pathogens transmissible to the recipients, especially porcine endogenous retrovirus (PERV), represents a threat for successfull xenotransplantation. Infectious PERVs contain three classes of envelope glycoprotein. Two classes, PERV-A and PERV-B are polytropic, they can infect human, pig and mink cells in vitro. PERV-C is evolutionary young, ecotropic isolate that can infect pig only. We previously detected a new full-lenght, but replication-defective PERV-A isolate dubbed (MAMBA) with high transcriptional activity in Large-White pig from a Czech breed. To support our results with PERV-MAMBA epigenetic regulation in pig tissues, in vitro DNA methylation essay was accomplished. Methylated or non-methylated reporter plasmids containing provirus 5' LTR were transfected into 293T cells and luciferase activity was measured. In both cases, methylated LTR decreased significantly expression of luciferase. Thus, PERV LTR-driven transcription is sensitive to DNA methylation. We also used PERV-A MAMBA provirus to study recombination between two pig endogenous retroviruses. We prepared 293T and BeWo cell clones harboring PERV-A...
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Protéines à motif tripartite (TRIM) chez le porc (Sus scrofa) et réplication du rétrovirus endogène porcin / Tripartite motif proteins (TRIM) in pig (Sus scrofa) and porcine endogenous retrovirus replication

Demange, Antonin 19 December 2013 (has links)
Les études des interactions entre cellules hôtes et rétrovirus ont conduit à définir le concept de restriction virale dont les facteurs constituent une part de l'immunité innée des cellules hôtes. Ces facteurs contribuent au contrôle des rétrovirus endogènes (ERV) dont l'émergence peut être associée à certaines pathologies telles que des leucémies ou des immunodéficiences. Chez le porc, certains ERV (PERV) sont réplicatifs, pourtant aucune pathologie ne leur a, à ce jour, été associée. Les mécanismes de restriction virale impliqués dans ce phénomène ont fait l'objet de nombreuses études. Elles n'ont cependant concerné que certains facteurs. Les protéines porcines à motif tripartite (poTRIM) n'ont ainsi fait l'objet que de peu d'études. Pourtant, de nombreux membres de cette famille participent à la restriction virale chez d'autres organismes que le porc. La présente étude s'intéresse par conséquent aux orthologues porcins de ces protéines et à leur relation avec les PERV. L'élaboration d'une stratégie d'expression de ces protéines dans un modèle humain, sensible à l'infection par le PERV nous a permis d'évaluer et de caractériser les effets des TRIM sur le cycle infectieux du PERV. Cette stratégie a mis en évidence une activité de restriction par TRIM8 tandis que TRIM44 semble au contraire agir en faveur de la réplication virale. En ce qui concerne poTRIM11, elle favorise l'entrée du PERV tout en inhibant son expression. L'étude a également confirmé l'insensibilité du PERV vis-à-vis de poTRIM5α. L'ensemble de ces résultats contribuent à la compréhension de la relation entre la réplication des PERV et le contrôle mené par son hôte. / From studies of pathogens and their host interaction has emerged the concept of viral restriction considered to be part of an innate immune system. These factors contribute to the control of endogenous retroviruses (ERV) whose emergence may be associated with several diseases such as leukemia or immunodeficiency. Three subgroups of the porcine ERV-γ-1 group (PERV) are replicative. Nevertheless, these PERVs are not associated with any pathology in the pig. Several studies have been performed on viral restriction mechanism capabilities of the pig but these covered a very limited number of restriction factors. Regarding the porcine tripartite motif-containing (poTRIM) proteins, knowledge is weak although several members of this family have proved to be implicated in the viral restriction of other species. The purpose of this study is to investigate the relationship between these orthologous poTRIMs proteins and replicating PERVs. In order to explore this potential interaction, a TRIM protein expressing model in human cells, known to be sensitive to the PERV infection, has been developed. It has enabled us to assess and characterize potential TRIMs effects on the PERV infection cycle. We equally identified poTRIM8 as a restriction factor. Conversely, poTRIM44 seems to act as an enhancer of the PERV infection, while, TRIM11 displayed ambiguous effects including an enhancer effect of the early infectious stages and an inhibitor activity of the late infectious stages. In this study, we also confirmed the PERV insensitivity to the porcine TRIM5α protein. Finally, this work aims at contributing to the understanding of the relationship between PERV replication and their control leading by the host cells.
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Étude comparative des processus intégratifs des rétrovirus aviaires et porcins / Comparative study of the integrative processes of the avian and porcine retroviruses

Al Andary, Elsy 19 December 2011 (has links)
Les rétrovirus sont des virus à ARN, enveloppés présents dans de nombreuses espèces animales de rente, chez les animaux de compagnie et chez l’homme. Une des particularités des rétrovirus concerne l’intégration du génome viral au sein du génome de la cellule infectée; cette intégration est réalisée par une enzyme virale, l’intégrase. Le projet de cette thèse vise à mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme notamment en identifiant des facteurs cellulaires interagissant avec celle-ci, facteurs qui pourraient être des agents favorisant le processus intégratif ou, au contraire, des agents restrictifs. Les intégrases de deux modèles de rétrovirus ont été utilisées dans cette étude : L’intégrase de RAV1, un rétrovirus exogène aviaire du genre des alpharétrovirus appartenant au sous-groupe A de la famille des ASLV. Cette enzyme virale est largement étudiée soit au niveau structural ou fonctionnel, mais les données concernant ses partenaires cellulaires sont rares et insuffisantes. La seconde intégrase est celle du PERV A/C, un rétrovirus endogène porcin du genre gammarétrovirus. Aucune information sur cette enzyme n’a été décrite jusqu’à présent. Ces deux enzymes, en fusion avec une étiquette 6xHistidine, ont été donc produites en bactérie, et en cellules d’insecte puis purifiées sur colonne d’affinité en FPLC. Leurs activités catalytiques ont été testées in vitro. Ces tests permettent de valoriser la capacité de l’intégrase à exercer principalement les 2 fonctions dont elle est responsable in vivo, le clivage en 3’ et le transfert de brins, et une activité qu’elle exerce exclusivement in vitro, la désintégration. Les protéines pures et actives ont ensuite servies à la vérification de leur interaction avec une protéine cellulaire, Brd2. La technique ‘Far western blot’ a ainsi permis de valider l’interaction entre l’intégrase de PERV et la protéine cellulaire, puis d’identifier les domaines de l’intégrase et de Brd2 impliqués dans cette interaction. A terme, l’identification de ce facteur cellulaire et la validation de son rôle dans le processus intégratif permettront de mieux comprendre ce processus particulier développé par les rétrovirus et pourront conduire au développement d’inhibiteurs dirigés contre cette interaction / A critical step for retroviral replication is the stable integration of the provirus genome into the genome of its host; this integration is realized by a viral enzyme, the integrase. The aim of this work was to better understand the functioning of the integrase, particularly, by identifying host factors that might interact with it, and which could be factors favoring the integration process or, restrictive factors. Therefore, we used two models of retroviral integrases: The integrase of RAV1, an alpharetrovirus belonging to the subgroup A of the family of ALSV. Although this viral enzyme is widely studied, still not enough data are available about its cellular cofactors. The second enzyme studied here is the integrase of PERV, a gammaretrovirus. No studies of either PERV integrase activities in vitro or of proteins interacting with this viral enzyme have been available until now. In the present study, we have expressed the PERV and ALSV integrases as fusion proteins with a 6xHistidine Tag in both Escherichia coli and insect SF9 cells. After that, we analysed their ability to mediate catalytic activities (3’-end processing, strand transfer and disintegration) in vitro. We also investigated the interaction of these two viral enzymes with the cellular protein Brd2, using the Far western blot method. Our results validate Brd2 as a cofactor of PERV integrase and point to the important role of particular domains of the PERV integrase and Brd2 in mediating the interaction. Finally, this study contibute to a better understanding of the precise interaction between cellular proteins and integrase, and may lead in the future to the development of protein-protein interaction inhibitors

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