Le développement de l’uvéite auto-immune expérimentale (UAE) se fait en plusieurs étapes, commençant par l’activation en périphérie de lymphocytes T auxiliaires auto-réactifs spécifiques d’antigènes rétiniens, leur migration vers l’œil, où ils sont réactivés de façon antigène-spécifique et CMH II (complexe majeur d’histocompatibilité de classe II)-dépendante pour enfin induire la rupture de la barrière hémato-rétinienne (BHR), permettant le recrutement aspécifique de cellules inflammatoires responsables des dommages tissulaires. Tous ces processus représentent des cibles potentielles pour des thérapies biologiques ciblées. Dans cette perspective, notre travail a pour but d’approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans le recrutement de cellules inflammatoires, la présentation locale d’antigènes rétiniens et la rupture de la BHR interne lors de l’induction de l’UAE par transfert adoptif.L’expression de molécules d’adhésion par les cellules de la BHR joue un rôle central dans l’infiltration de cellules inflammatoires dans l’œil. Dans ce contexte, nous avons d’abord montré qu’à l’instar de ce que nous avions démontré pour VCAM-1, l’expression d’ICAM-1 est fortement induite dans la rétine durant l’UAE, avec une intensité et une extension corrélées à la sévérité de la maladie. Cependant, alors que VCAM-1 est uniquement inductible, une expression basale d’ICAM-1 est détectée dans la rétine naïve. Le ligand d’ICAM-1, LFA-1, est exprimé de façon ubiquitaire par les cellules immunes circulantes, contrairement au ligand de VCAM-1, VLA-4, qui n’est exprimé que par une minorité de cellules. Par ailleurs, nous avons observé une répartition tissulaire différente de ces deux molécules d’adhésion dans la rétine. En effet, si ICAM-1 prédomine dans l’épithélium pigmentaire rétinien, VCAM-1 est fortement exprimé au niveau des lésions de vasculite, à la fois sur les cellules endothéliales et gliales péri- vasculaires. Ces 2 sites correspondent respectivement à la BHR externe et interne. Ces différences majeures en termes de distribution rétinienne des molécules d’adhésion pourraient refléter des voies d’entrée distinctes pour les cellules inflammatoires lors de leur pénétration dans l’œil.Comme les lymphocytes T auto-réactifs n’induisent la maladie qu’après avoir localement reconnu leur antigène, nous nous sommes ensuite intéressés à identifier les cellules présentatrices d’antigène (CPA) potentielles exprimant du CMH II dans la rétine lors de l’UAE. Nous avons tout d’abord observé une forte induction de l’expression de molécules du CMH II dans la rétine lors de l’inflammation intraoculaire, corrélée avec la sévérité de la maladie. Celle-ci est associée avec l’induction de l’expression de molécules de co-stimulation, particulièrement sur les cellules exprimant fortement le CMH II. L’expression la plus forte de CMH II se retrouve dans la rétine interne, au niveau des vaisseaux enflammés et s’étend vers les couches externes de la rétine et l’espace sous-rétinien dans les uvéites sévères. Nous avons identifié 3 populations de CPA potentielles exprimant le CMH II dans la rétine :des cellules CD45-CD11b- non-hématopoïétiques exprimant faiblement le CMH II et des cellules CD45+CD11b+ hématopoïétiques exprimant plus fortement le CMH II, pouvant être subdivisées en cellules Ly6C+ et Ly6C-. L’analyse bio-informatique à l’aveugle du transcriptome de ces 3 populations mène à une ségrégation claire des échantillons, avec un enrichissement en marqueurs de macrophages et de microglie dans les cellules Ly6C+ et Ly6C-, respectivement. Cependant, l’expression de Ly6C ne permet pas une ségrégation absolue entre macrophages infiltrants et microglie résidente. L’analyse fonctionnelle à l’aide de DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) révèle que les 2 populations de cellules hématopoïétiques sont plus compétentes dans la présentation d’antigène associée au CMH II et l’activation des lymphocytes T que les cellules non-hématopoïétiques.Paradoxalement, nos données n’ont pas mis en évidence d’expression de CMH II par les principales cellules de la BHR que sont les cellules endothéliales et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. Cependant, il est bien établi que les cellules endothéliales rétiniennes subissent un changement majeur de phénotype lors du développement d’une UAE. Afin d’investiguer de façon globale les mécanismes sous-jacents à la rupture de la BHR interne, nous avons étudié la régulation de l’expression génique des cellules endothéliales rétiniennes lors de l’uvéite non-infectieuse. En accord avec les données de nos travaux précédents, l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales rétiniennes n’a pas mis en évidence d’expression de CMH II lors de l’UAE. En revanche, cette approche nous a permis d’identifier 65 gènes modulés dans les cellules endothéliales rétiniennes lors du développement d’une UAE, confirmant non seulement l’implication de certaines molécules dont le rôle pathogénique est déjà connu, mais procurant également une liste de nouveaux gènes candidats et de voies fonctionnelles potentiellement associées à la rupture de la BHR lors d’une uvéite non- infectieuse. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'objectif de cette thèse repose sur le développement de micelles de polymères polyioniques, vecteurs de molécules thérapeutiques en immunothérapie avec des cellules dendritiques (DCs). Elles sont préparées à partir d'un copolymère à blocs double-hydrophiles, l'acide polyméthacrylique-b-polyoxyde d'éthylène (PMAA-b-POE) et d'un contre ion de charge opposée. De taille nanométrique, elles sont capables d'encapsuler des molécules thérapeutiques selon une association tripartite originale et de se désassembler à pH acide pour permettre leur libération dans le milieu endosomal.Le premier axe de travail a porté sur l'évaluation de la propriété des copolymères à induire un échappement endosomal en fonction de leur masse molaire en utilisant deux modèles membranaires (liposomes et globules rouges). La complexation des copolymères de masses molaires différentes avec la poly-L-lysine comme contre-ion a permis l'obtention de micelles avec des propriétés d'échappement endosomal variables. Cette propriété est intéressante car en fonction de la stratégie thérapeutique adoptée, elle orientera le choix de la masse molaire du copolymère pour la formulation des micelles.Le second axe a consisté en l'application de ces micelles pour la vectorisation d'un peptide modèle (peptide OVA) dans les DCs. La capacité des micelles à encapsuler le peptide et à le libérer au niveau des compartiments endosomaux a été évaluée par des techniques de spectrofluorimétrie et de microscopie confocale. Enfin, l'efficacité de présentation du peptide formulé dans les différentes micelles a été mise en évidence et a montré l'amélioration de la présentation par les DCs du peptide formulé dans les micelles comparé au peptide non formulé. Cette présentation est nettement supérieure en utilisant les micelles composées de copolymères de masse molaire élevée qui n'entraînent pas d'échappement endosomal.Le troisième axe de recherche a reposé sur la transfection des DCs avec des micelles de siRNA dirigés contre la protéine de surface CD86. Seules les micelles composées de copolymères de faible masse molaire ont permis l'encapsulation du siRNA et la baisse de l'expression de la protéine CD86 à la surface des DCs. Afin d'optimiser la capacité des micelles à encapsuler et transfecter les DCs, la formulation des micelles a été optimisée en remplaçant la PLL par un autre polycation la polyethylene imine PEI. Ces micelles polyioniques à base de copolymère PMAA-b-POE apparaissent donc comme des vecteurs de molécules d'intérêt thérapeutique prometteurs pour les cellules dendritiques en immunothérapie ou en thérapie génique. / The aim of the thesis work is based on the development of polymeric micelles vectors of therapeutic molecules in immunotherapy with dendritic cells (DCs). They are composed of a double hydrophilic blocks copolymers, poly(methacrylic acid)-b-poly(ethylene oxide) (PMAA-b-PEO) and an oppositely charged polyion. They are caracterized by a nanometric size, a capacity to encapsulate therapeutic molecules according to a tripartite association and are able to disassemble at acidic pH allowing the release of their cargo.The first part of this work has focused on the evaluation of the endosomal escape property of copolymers based on their molecular weight by using two membrane models (liposomes and red blood cells). Complexation of different molecular weight copolymers with poly- L- lysine as counter ion allowed the formation of micelles with variable endosomal escape properties. This property is interesting because according to the adopted therapeutic strategy, it will guide the choice of the copolymer micelles for formulation.The second part consisted of the application of these micelles for the vectorization of a model peptide (OVA peptide) in DCs. The ability of micelles to encapsulate and release this peptide in the endosomal compartments was assessed by fluorescence spectroscopy and confocal microscopy techniques. Finally, the effectiveness of the OVA presentation formulated in the different type of micelles has been demonstrated and shown that the peptide presentation by DCs was improved when it was formulated in micelles compared to unformulated peptide. This presentation was much higher using micelles composed of high molecular weight copolymers that do not involve endosomal escape.The third part of the research was based on the transfection of DCs with siRNA directed against CD86 protein surface. Only micelles composed of low molecular weight copolymers allowed the encapsulation of siRNA molecules and decreased the expression of CD86 protein on DCs surface. To increase the ability of micelles to encapsulate and transfect DCs, the micelle formulation was optimized by changing the PLL with another polycation PEI.These polyion micelles based PMAA-b-PEO copolymers appear as vectors of therapeutic molecules for promising strategies with dendritic cells such as vaccination and gene therapy.