Zusammenfassung Adriana J. Wöckel Feldstudien zur Beurteilung und Optimierung des gewählten Besamungstages bei Kühen unter Zuhilfenahme eines quantitativen Milchprogesteron-Schnelltests Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig Eingereicht im April 2017 92 Seiten, 11 Abbildungen, 17 Tabellen, 314 Literaturangaben Schlüsselwörter: Rind, Progesteron, Brunsterkennung, Milchprogesteron-Schnelltest, Praxistauglichkeit Einleitung Zur modernen ökonomischen Milchviehwirtschaft gehören Langlebigkeit, Gesundheit und eine gute reproduktive Leistung der Kühe. Ein effektives Brunstbeobachtungs- und Besamungsmanagement stellt dabei einen essentiellen Bestandteil dar. Aufgrund der intensiven Zucht, welche hauptsächlich auf Hochleistung der Tiere ausgelegt wird, kommt es immer mehr zur Verkürzung der Östrusdauer und Reduktion der Symptomatik, was die Detektion und Nutzung der Brunst deutlich erschwert. Es begründet sich somit die Notwendigkeit, neben der visuellen Brunstbeobachtung weitere Methoden, wie die Progesteronmessung, zu nutzen, um eine möglichst effiziente Überwachung umsetzen zu können. Ziele der Untersuchung In einem Hauptversuch sollte unter Anwendung des Hormonost® Farmertest der Firma Biolab GmbH (München) zur Milchprogesteronmessung der gewählte Besamungstag kontrolliert bzw. moduliert werden. Die erhobenen Fruchtbarkeitskennzahlen nach dem Versuch sollten mit den Ergebnissen bei Kontrolltieren, welche keine begleitende Progesteronmessung erfahren hatten, verglichen werden. Zusätzlich wurde der Einfluss der Parität und der Milchleistung der Tiere überprüft und in einem Teilversuch die Übereinstimmung der Beurteilung „Brunst“ zwischen dem Progesteronwert und den klinisch-gynäkologischen Befunden erfasst. Tiere, Material und Methoden Die Studie umfasste einen Hauptversuch, welcher von April bis Dezember 2014 in einem sächsischen Milchviehbetrieb an 84 Versuchs- und 68 Kontrolltieren der Rasse Holstein Friesian durchgeführt wurde. Dabei wurde an drei vorher festgelegten Zeitpunkten (Tag der Besamung, sechs Tage und 20 Tage später) eine Endgemelksprobe zur Progesteronmessung gewonnen und analysiert. Für den optimalen Tag der Besamung, welcher als Zeitpunkt eins definiert war, wurde der Tag mit der niedrigsten P4-Konzentration gewählt und die weiteren Untersuchungszeitpunkte anhand dessen festgelegt. Es wurden die Fruchtbarkeitskennzahlen des Betriebes vor und nach dem Versuch und tierbezogene Daten, wie Erstkalbealter, aktuelle Laktationsnummer, die Milchmenge im brunstnahen Zeitraum sowie die Wartezeit und gegebenenfalls wie viele Besamungen bereits vor dem Versuch stattfanden, erhoben und dokumentiert. Die Progesteronanalysen wurden mit dem Hormonost® Farmertest unter gleichbleibenden Bedingungen durchgeführt. Es erfolgte eine direkte Mitteilung der Werte an den Stallleiter und gegebenenfalls die Empfehlung einer weiteren künstlichen Besamung am Folgetag sowie die folgenden Probennahmetermine. In einem Teilversuch erfolgte bei 18 Versuchstieren die Progesteronmessung begleitend zur Erhebung klinisch-gynäkologischer Befunde am Tag der Besamung und 21 Tage später, der Umrinderkontrolle. Die Vorauswahl der Kühe und der Milchprobennahme-Plan entsprachen dem Hauptversuch. Ergebnisse Die erhobenen Fruchtbarkeitskennzahlen des Betriebes sowie die der Versuchstiere im Vergleich zu den Kontrolltieren verbesserten sich im Rahmen der Studie. Die Progesteron-kontrollierten Tiere wurden signifikant schneller tragend, wobei an den Messzeitpunkten eins und zwei kein signifikanter Unterschied zwischen später für „tragend“ bzw. „nicht tragend“ befundeten Tieren bestand. Rund zwei Drittel der Versuchstiere wurden aufgrund der P4-Messung ein weiteres Mal besamt. Erst 20 Tage nach der Besamung konnte statistisch ein signifikanter Unterschied zwischen später trächtigen und nicht trächtigen Kühen ermittelt werden. Im Laktationsgruppenvergleich zeichnete sich eine altersabhängige Minimierung der lutalen Leistung anhand niedrigerer P4-Werte ab. Der Milchmengenabfall zur Brunst erwies sich im Hauptversuch als signifikant, allerdings aufgrund der Reduktion von nur einem Liter als nicht praxisrelavant. Im Teilversuch konnte eine gute Übereinstimmung der Brunstbeurteilung zwischen rektaler Untersuchung (87,5-100 %) und vaginaler Untersuchung (93,8-100 %) mit der zugehörigen Milchprogesteronmessung gefunden werden. Schlussfolgerungen Die on-farm Milchprogesteronmessung mit dem Hormonost® Farmertest lässt sich nach etwas Übung sowohl vom Landwirt als auch vom Tierarzt gut durchführen und kann zu einer Verbesserung der fertilen Leistung, durch die Optimierung des Besamungstages und schnelleres Erkennen von nicht trächtigen Tieren in einem Milchviehbetrieb führen. Die Untersuchungsdauer betrug für bis zu sechs Milchproben rund 20 Minuten nach entsprechender Vorbereitungszeit und kostete ca. 3,73 € pro analysierter Milchprobe zzgl. der Anschaffungskosten für das Testsystem. Jene Tiere, bei denen eine unsichere Brunstdiagnose vorliegt, die eine Stillbrünstigkeit aufweisen oder unter einer lutealen Schwäche leiden, können über den Milchprogesterontest gut identifiziert werden. Die somit gewonnenen Informationen ermöglichen daraufhin, unter Einleitung geeigneter Maßnahmen, eine Verbesserung der Fertilität.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Sexualzyklus beim Rind 3 2.1.1 Östrus 4 2.1.2 Metöstrus 5 2.1.3 Diöstrus 5 2.1.4 Proöstrus 7 2.1.5 Wiedereintritt in den Zyklus nach der Kalbung 8 2.2 Das Gelbkörperhormon Progesteron 9 2.2.1 Progesteron 9 2.2.2 Progesteronverlauf während des Zyklus 10 2.2.3 Einflussfaktoren auf Progesteron, Brunstverhalten und Fruchtbarkeit 13 2.3 Fruchtbarkeitskennzahlen und Brunstbeobachtung 21 2.3.1 Erläuterung der wichtigsten Fruchtbarkeitskennzahlen 21 2.3.2 Bedeutung der Brunstbeobachtung für einen Milchviehbetrieb 23 2.3.3 Auswahl einzelner Methoden zur Brunstbeobachtung 25 2.3.3.1 Visuelle Brunstbeobachtung 25 2.3.3.2 Aktivitätsmessung (Bewegungs- und Wiederkauverhalten) 27 2.3.3.3 Farbmarkierung und Drucksensoren 31 2.3.3.4 Elektrische Leitfähigkeit im Vaginalschleim 32 2.3.3.5 Milchleistung 33 2.3.3.6 Brunstdiagnose durch den Tierarzt 34 2.3.3.7 Progesteronmessung 35 3 Tiere, Material und Methoden 40 3.1 Tiere 40 3.1.1 Versuchsbetrieb 40 3.1.2 Auswahlkriterien für die Versuchs- und Kontrolltiere 41 3.1.3 Versuchs- und Kontrolltiere 42 3.2 Material und Methoden 43 3.2.1 Milchprobengewinnung 43 3.2.2 Testsystem Hormonost® Farmertest 43 3.2.2.1 Allgemeines zum Hormonost® Farmertest 43 3.2.2.2 Testdurchführung und Messprinzip 44 3.2.2.3 Überprüfung der Messgenauigkeit und Durchführungssicherheit unter Anwendung der Kontrolllösungen 46 3.2.3 Betriebsdaten aus dem Herdenmanager 47 3.3 Versuchsaufbau und Ablauf 47 3.3.1 Vorversuch 47 3.3.2 Milchprogesteronmessung in Begleitung zum normalen Betriebsablauf (Versuch 1) 47 3.3.3 Milchprogesteronmessung in Kombination mit der Erhebung klinisch-gynäkologischer Befunde (Versuch 2) 49 3.4 Statistische Methoden 50 3.4.1 Statistische Tests des Vorversuchs 52 3.4.2 Statistische Tests der Milchprogesteronmessung in Begleitung zum normalen Betriebsablauf (Versuch 1) 52 3.4.3 Statistische Tests der Milchprogesteronmessung in Kombination mit der Erhebung klinisch-gynäkologischer Befunde (Versuch 2) 53 3.4.4 Erläuterung zur grafischen Darstellung der Ergebnisse 54 4 Ergebnisse 55 4.1 Ergebnisse des Vorversuchs 55 4.2 Ergebnisse zur Milchprogesteronmessung in Begleitung zum normalen Betriebsablauf (Versuch 1) 55 4.3 Ergebnisse zur Milchprogesteronmessung in Kombination mit der Erhebung klinisch-gynäkologischer Befunde (Versuch 2) 65 5 Diskussion 68 5.1 Ziel der Arbeit 68 5.2 Kritische Betrachtung der Methoden 68 5.2.1 Auswahl des Betriebes und der Tiere 68 5.2.2 Milch als Analysemedium für Progesteron 69 5.2.3 Versuchsplanung 70 5.2.4 Praktikabilität, Zeit- und Kostenaufwand des Hormonost® Farmertests 72 5.3 Diskussion der wichtigsten Versuchsergebnisse 74 5.3.1 Diskussion zur Milchprogesteronmessung in Begleitung zum normalen Betriebsablauf (Versuch 1) 74 5.3.2 Diskussion zur Milchprogesteronmessung in Kombination mit der Erhebung klinisch-gynäkologischer Befunde (Versuch 2) 84 5.4 Schlussfolgerung 87 6 Zusammenfassung 89 7 Summary 91 8 Literaturverzeichnis 93 9 Danksagung 111

Zur Kontrolle und Steigerung der Fruchtbarkeitsleistung von hochleistenden Milchkühen muss eine frühzeitige, sichere Methode zur Feststellung einer Trächtigkeit erfolgen. Neben der transrektalen Ultraschalldiagnostik als direkte Methode gibt es hierzu über den Nachweis boviner trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine (bovine Pregnancy Associated Glycoproteins = bPAGs) eine indirekte, genauso früh einsetzbare Methode. Über einen Hauptversuch sollten die Praktikabilität sowie die Sensitivität und Spezifität eines laborungebundenen blutbasierten bPAG-Trächtigkeitstests unter Feldbedingungen ermittelt werden. In Teilversuchen sollten die Haltbarkeit des bPAG in kühl- und gefriergelagerten Proben beurteilt werden. Zudem sollten die Testergebnisse von unbesamten Kühen post partum (p.p.) und früh wiederbesamten Kühen unter 60 Tagen p.p. vor dem Hintergrund vorliegender Rest-bPAG-Mengen der zurückliegenden Trächtigkeit analysiert werden. Im Hauptversuch befanden sich von Juli bis Dezember 2014 109 Kühe zweier Betriebe in Mecklenburg Vorpommern. Voraussetzung war, dass sich die Tiere mindestens 60 Tage p.p. befanden, um falsch positive Ergebnisse durch noch im Blut zirkulierende bPAGs der zurückliegenden Trächtigkeit auszuschließen. Bei dem zu validierenden „IDEXX Visual Pregnancy Test“ handelt es sich um einen indirekten Antigen-Capture ELISA, welcher bPAGs im Blutserum oder im EDTA-Plasma tragender Rinder nachweist. Verlässliche Ergebnisse sind laut Herstellerangabe erstmalig ab 28 Tagen post inseminationem (p.i.) möglich. Die Testergebnisse werden visuell im Vergleich mit parallel angesetzten Positiv- und Negativkontrollen zugeordnet. Als Goldstandard wurde in der Feldstudie bei jedem Tier eine erste Trächtigkeitsuntersuchung 28 Tage p.i., eine zweite 35 Tage und eine dritte nach dem 45. Tag p.i. mit transrektaler Sonografie vorgenommen. Während der ersten beiden Befundungen erfolgte eine Blutprobenentnahme aus der V. caudalis mediana und eine Untersuchung mit dem „IDEXX Visual Pregnancy Test“. Eine dritte Blutprobenentnahme (>45 Tage p.i.) wurde veranlasst, sofern das Testergebnis am Tag 35 nicht mit dem Ergebnis der transrektalen Sonografie übereinstimmte bzw. die visuelle Zuordenbarkeit des Testergebnisses nicht eindeutig möglich war. Im Hauptversuch lag die Trächtigkeitsrate bei 51,4% (56 von 109) und 48,6% (53 von 109) nicht tragenden Tieren. Alle 56 mittels transrektaler Sonografie als tragend diagnostizierten Kühe wurden ohne Ausnahme korrekt vom Trächtigkeitstest ebenfalls als positiv getestet. Folglich betrug die Sensitivität des Tests 100%. Bei 48 von 53 sonografisch nicht für tragend befundenen Tieren stimmte dies mit dem bPAG-Bluttest überein. Fünf Probandinnen wiesen 28 Tage p.i. ein falsch positives Testergebnis auf, welches bei zwei Kühen auch bei der dritten Testdurchführung am 47. bzw. am 49. Tag p.i. unverändert eine Trächtigkeit falsch anzeigte. Somit betrug die Spezifität 90,6%. Des Weiteren wurden Gütekriterien-Validationen mittels positivem und negativem prädiktivem Wert sowie über das positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnis und die Genauigkeit durchgeführt. Es resultierten jeweils sehr gute Werte hieraus. Die Teilversuche ergaben eine gute Haltbarkeit des bPAG auch bei vorheriger Kühl- oder Gefrierlagerung der Blutproben. Die bPAG aus der zurückliegenden Trächtigkeit blieben teils bis einschließlich Tag 55 p.p. nachweisbar. Der Zeitaufwand für den Bluttest betrug mindestens 175 Minuten pro Testdurchlauf; davon fielen 105 Minuten auf die eigentliche Testdurchführung. Je kleiner die Probenanzahl pro Testserie, desto teurer wird jeder einzelne Trächtigkeitstest pro Tier aufgrund der jeweils doppelt mit anzusetzenden Positiv- und Negativkontrollen. Der Trächtigkeitstest ist somit nur für größere Tierarztpraxen geeignet, die die nötige personelle Ausstattung und eine genügend große Anzahl an Trächtigkeitsuntersuchungen pro Testdurchlauf garantieren können. Aufgrund in Frage kommender falsch positiver Ergebnisse, aller Voraussicht nach dem späten embryonalen Fruchttod zuzuschreiben, wird eine direkte manuelle und/oder transrektal sonografische Nachuntersuchung zumindest aller am 28. Tag p.i. positiv getesteten Kühe nach dem 45. Tag p.i. für zwingend notwendig erachtet.

Zur Kontrolle und Steigerung der Fruchtbarkeitsleistung von hochleistenden Milchkühen muss eine frühzeitige, sichere Methode zur Feststellung einer Trächtigkeit erfolgen. Neben der transrektalen Ultraschalldiagnostik als direkte Methode gibt es hierzu über den Nachweis boviner trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine (bovine Pregnancy Associated Glycoproteins = bPAGs) eine indirekte, genauso früh einsetzbare Methode. Über einen Hauptversuch sollten die Praktikabilität sowie die Sensitivität und Spezifität eines laborungebundenen blutbasierten bPAG-Trächtigkeitstests unter Feldbedingungen ermittelt werden. In Teilversuchen sollten die Haltbarkeit des bPAG in kühl- und gefriergelagerten Proben beurteilt werden. Zudem sollten die Testergebnisse von unbesamten Kühen post partum (p.p.) und früh wiederbesamten Kühen unter 60 Tagen p.p. vor dem Hintergrund vorliegender Rest-bPAG-Mengen der zurückliegenden Trächtigkeit analysiert werden. Im Hauptversuch befanden sich von Juli bis Dezember 2014 109 Kühe zweier Betriebe in Mecklenburg Vorpommern. Voraussetzung war, dass sich die Tiere mindestens 60 Tage p.p. befanden, um falsch positive Ergebnisse durch noch im Blut zirkulierende bPAGs der zurückliegenden Trächtigkeit auszuschließen. Bei dem zu validierenden „IDEXX Visual Pregnancy Test“ handelt es sich um einen indirekten Antigen-Capture ELISA, welcher bPAGs im Blutserum oder im EDTA-Plasma tragender Rinder nachweist. Verlässliche Ergebnisse sind laut Herstellerangabe erstmalig ab 28 Tagen post inseminationem (p.i.) möglich. Die Testergebnisse werden visuell im Vergleich mit parallel angesetzten Positiv- und Negativkontrollen zugeordnet. Als Goldstandard wurde in der Feldstudie bei jedem Tier eine erste Trächtigkeitsuntersuchung 28 Tage p.i., eine zweite 35 Tage und eine dritte nach dem 45. Tag p.i. mit transrektaler Sonografie vorgenommen. Während der ersten beiden Befundungen erfolgte eine Blutprobenentnahme aus der V. caudalis mediana und eine Untersuchung mit dem „IDEXX Visual Pregnancy Test“. Eine dritte Blutprobenentnahme (>45 Tage p.i.) wurde veranlasst, sofern das Testergebnis am Tag 35 nicht mit dem Ergebnis der transrektalen Sonografie übereinstimmte bzw. die visuelle Zuordenbarkeit des Testergebnisses nicht eindeutig möglich war. Im Hauptversuch lag die Trächtigkeitsrate bei 51,4% (56 von 109) und 48,6% (53 von 109) nicht tragenden Tieren. Alle 56 mittels transrektaler Sonografie als tragend diagnostizierten Kühe wurden ohne Ausnahme korrekt vom Trächtigkeitstest ebenfalls als positiv getestet. Folglich betrug die Sensitivität des Tests 100%. Bei 48 von 53 sonografisch nicht für tragend befundenen Tieren stimmte dies mit dem bPAG-Bluttest überein. Fünf Probandinnen wiesen 28 Tage p.i. ein falsch positives Testergebnis auf, welches bei zwei Kühen auch bei der dritten Testdurchführung am 47. bzw. am 49. Tag p.i. unverändert eine Trächtigkeit falsch anzeigte. Somit betrug die Spezifität 90,6%. Des Weiteren wurden Gütekriterien-Validationen mittels positivem und negativem prädiktivem Wert sowie über das positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnis und die Genauigkeit durchgeführt. Es resultierten jeweils sehr gute Werte hieraus. Die Teilversuche ergaben eine gute Haltbarkeit des bPAG auch bei vorheriger Kühl- oder Gefrierlagerung der Blutproben. Die bPAG aus der zurückliegenden Trächtigkeit blieben teils bis einschließlich Tag 55 p.p. nachweisbar. Der Zeitaufwand für den Bluttest betrug mindestens 175 Minuten pro Testdurchlauf; davon fielen 105 Minuten auf die eigentliche Testdurchführung. Je kleiner die Probenanzahl pro Testserie, desto teurer wird jeder einzelne Trächtigkeitstest pro Tier aufgrund der jeweils doppelt mit anzusetzenden Positiv- und Negativkontrollen. Der Trächtigkeitstest ist somit nur für größere Tierarztpraxen geeignet, die die nötige personelle Ausstattung und eine genügend große Anzahl an Trächtigkeitsuntersuchungen pro Testdurchlauf garantieren können. Aufgrund in Frage kommender falsch positiver Ergebnisse, aller Voraussicht nach dem späten embryonalen Fruchttod zuzuschreiben, wird eine direkte manuelle und/oder transrektal sonografische Nachuntersuchung zumindest aller am 28. Tag p.i. positiv getesteten Kühe nach dem 45. Tag p.i. für zwingend notwendig erachtet.