Made available in DSpace on 2014-05-29T12:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69318.pdf: 2705339 bytes, checksum: 57938129a86016619372b159e93db18e (MD5) 69318.pdf.txt: 146396 bytes, checksum: d375b57913c69cc2fa43e4ddc043a908 (MD5) 69318.pdf.jpg: 1174 bytes, checksum: eee38814774015c69c4605ad49e693ac (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades. Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. Cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-II) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. Cruzi com propriedades similares ao complexo \03B3-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as sequências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-1). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-1, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenilina identificou por immunoblotting a banda de 48kDa na fração CZP-I como sendo presenilina, enquanto o soro anti-peptídeo NIC-1 de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. Cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. Cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-II (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXI/E da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. Cruzi possui uma constituição semelhante ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sítio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5\03BCM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXI/E não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. Cruzi é um bom alvo quimioterapêutico e imunológico / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and may present low sensitivity and specificity or cross drugs used nowadays to treat metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in (Cruzipsin-II) and a membrane remained unknown. Our results demonstrat proteolytic complex in T. cruzi eukaryotic cells. Using bioinformatics tools proteins (presenilin, nicastrin and Aph information was important for parallel synthesis of peptides epitopes of proteins using sera from eight patients. P nicastrina, 5 and Aph-1, 10. Some epitopes we sera were obtained in rabbits. Serum immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP of nicastrin also presented a marking in the same position. of epimastigotes localized addition, the markings were localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employ synthetic peptides for T. cruzi specificity and 70.53%. Using after affinity chromatography confirm were like those of strain Y: 37 and 34 kDa in CZP-II fraction (soluble allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E that the catalytic site of T. cruzi while significant differences were observed in the allosteric site. T 685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5 and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that due to their enzymatic funct target for chemotherapeutic and cross-reactions with other pathogens. Likewise, Chagas disease show severe side effects. Among the various membrane-bound (Cruzipsin-I); however, their demonstrate for the 1st time, the existence of a with similar properties to the -secretase tools, the primary sequences of three of four complex Aph-1) where localized at a protein database. and the identi Presenilin presented were selected by different criteria and anti anti-peptide PRE-2 of presenelin CZP-I as presenelin, while the anti Analysis by confocal microscopy the proteins mainly at anterior and middle portions of th found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co presenilin and nicastrin presented sensitivity . differential detergent extraction and analysis by SDS confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener 240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52, soluble). Enzyme assays using the inhibitor L APT of human presenilin apparently suggested presenilin has a constitution similar to the human presenilin, The active site inhibitor 458 M, while the modulator functions and cellular localization the presenilin for immune system. unexpensive, T. cruzi: a soluble biological functions membrane complex of other This identification of linear 10 major epitopes, re anti-peptide identified by , anti-peptide NIC-1 the cells. In colocalization employing four of 71.59% and SDS-PAGE says L-685,458 and he LM, modulators DAPT of T. cruzi is a good target for chemotherapeutic and for immune system.