Le gène ShcA encode pour 3 isoformes de la protéine adaptatrice Shc, soit p46, p52 et p66Shc. La plupart des études faites sur Shc ont été réalisées dans le contexte de l'isoforme p52Shc. Un des premiers rôles attribués à p52Shc a été sa capacité d'activer la voie de signalisation MAPK en aval des récepteurs tyrosine kinase. Par la suite, plusieurs rôles ont été attribués à p52Shc, dont l'induction de la prolifération cellulaire, la migration, l'angiogenèse et la croissance sans ancrage à la matrice extracellulaire. Tous ces processus biologiques sont impliqués dans l'initiation et la progression du cancer. Pendant longtemps on croyait que les 3 isoformes de Shc avaient les mêmes fonctions. Cependant en 1997, un rôle distinct a été découvert pour p66Shc. Cet isoforme est antagoniste à p52Shc, c'est-à-dire qu'il inhibe la voie MAPK, la prolifération ainsi que la migration cellulaire. De plus, p66Shc aurait un rôle pro-apoptotique suite à des stress cellulaires, dont le stress oxydatif. Ces observations suggèrent que p66Shc agirait comme suppresseur de tumeur. Nous nous sommes donc penchés sur son rôle au niveau de la carcinogenèse colorectale. Nos travaux nous ont d'abord permis de caractériser le statut des isoformes de Shc au niveau des cellules de cancer colorectal humain. On a observé une diminution de l'expression de p66Shc par rapport aux cellules normales ainsi qu'une augmentation de la phosphorylation de p52Shc dans les cellules cancéreuses humaines avec un potentiel plus agressif. Cependant, la réexpression de p66Shc dans les cellules DLD-1 possédant des niveaux non détectables de p66Shc, n'affecte pas la prolifération, la croissance sans ancrage à la matrice extracellulaire et ni l'apoptose suite à un stress oxydatif. Par la suite, les résultats obtenus par des analyses moléculaires nous ont permis de déterminer que la réexpression de p66Shc diminue la phosphorylation de p52Shc sur ses résidus tyrosines ainsi que l'interaction entre Grb2 et p52Shc. Toutefois, la réexpression de p66Shc n'a aucun impact sur l'activation de ERK. De plus, nos analyses in vivo ont démontré une diminution de la capacité des cellules DLD-1 réexprimant p66Shc à former des tumeurs chez les souris nues injectées de façon sous-cutanée, par rapport aux DLD-1 contrôles. Ce qui suggère que p66Shc joue un rôle en tant que suppresseur de tumeur in vivo. En conclusion, nos résultats indiquent que la réexpression de p66Shc dans la lignée cellulaire humaine de cancer colorectal, soit les DLD-1, n'a pas d'impact sur l'activation de ERK et ni sur les différents processus biologiques en aval des voies MAPK. Mais le fait que p66Shc inhibe la phosphorylation de p52Shc ainsi que l'interaction entre Grb2 et p52Shc in vitro , et qu'in vivo p66Shc agirait comme suppresseur de tumeur, indique qu'il existe un rôle pour p66Shc dans le cancer colorectal. Cependant, les mécanismes sur son implication restent encore à être élucidés.

Les voies de signalisation exercent à l’échelle moléculaire un contrôle spatiotemporel précis sur de nombreux processus cellulaires. Par exemple, à l’échelle d’un organisme en développement, ces réseaux complexes d’interaction opèrent entre différents groupes cellulaires et établissent une régulation fine, dynamique et intégrée de multiples processus tels la spécification, la différentiation, la prolifération et la migration cellulaire. Comprendre ces phénomènes requiert d’étudier la fonction précise de ces molécules et de ces réseaux de signalisation. Il est donc nécessaire de concevoir des outils adaptés contrôlant localement l’activité de molécules de signalisation pour étudier leur implication dans la régulation de processus cellulaires fondamentaux. Afin de développer des outils innovants pour l’étude de systèmes biologiques, nous proposons d’implémenter la technique de la relaxation chimique au sein de microsystèmes. Cette approche repose sur la conception de micro-dispositifs dédiés qui génèrent une modulation spatio-temporelle précise de la concentration de molécules de signalisation. Une telle perturbation génère une réponse spécifique du système biologique qui livre des informations décisives quant à la dynamique des réactions et quant à l’organisation des réseaux moléculaires à l’œuvre. Cette stratégie d’ingénierie pour l’étude de systèmes biologiques est générique et intrinsèquement multidisciplinaire. Au cours de ce travail, elle a été mise en œuvre pour deux projets collaboratifs, d’une part BioModulator à l’échelle cellulaire, et d’autre part Electromice à l’échelle d’un organisme complet. Nous avons mis nos compétences de physiciens spécialistes de micro/nanofabrication au service de l’équipe du Dr. Zoher Gueroui de l’Ecole Normale Supérieure ainsi que de l’équipe du Dr. Aitana Perea-Gomez de l’Institut Jacques Monod, ces deux équipes étudiant respectivement les processus impliqués dans l’auto-assemblage des microtubules et le développement de l’embryon précoce de souris. Plus précisément, le projet BioModulator repose sur la génération de gradients localisés de protéines présumées régulatrices du fuseau mitotique alors que le projet Electromice propose l’électroporation localisée d’acides nucléiques au sein d’embryons de souris pour modifier spatio-temporellement l’expression des gènes qui régissent le devenir des cellules visées et ainsi étudier les interactions contrôlant la croissance, la migration et la spécification de différents types cellulaires. Au cours de cette thèse, nous avons donc développé des méthodologies expérimentales ainsi que des protocoles adaptés à l’utilisation d’une instrumentation miniaturisée dédiée à l’étude de systèmes biologiques multi-échelles. Enfin, nous avons pu démontrer l’efficacité ainsi que la validité d’approches collaboratives et multidisciplinaires. En effet, elles permettent à la fois l’émergence de stratégies innovantes et ambitieuses et aussi de répondre à d’importantes questions en sciences de la vie et ce, pour le plus grand profit de toutes les communautés scientifiques participant à ce type de projet. / Cell-fate decisions and cellular functions are dictated by the spatiotemporal dynamics of molecular signaling networks. Moreover, at the scale of an entire organism, especially during its development, complex interactions between cell groups enable the fine, dynamic, and integrated regulation of tissue specification. Understanding these phenomena necessitates new dedicated tools. In this doctoral research, we propose to implement relaxation techniques in microfluidic systems. Our goal is to be able to precisely modulate in space and time the concentration of signaling molecules and to deduce, from the response of the biological system, information on the dynamics of the scrutinized reaction networks. More exactly, microsystems are used to perturbate living systems and associated models accounting for the recorded response are validated thanks to computer simulations. We have implemented this strategy both at the cellular level and at the organism scale during two collaborative projects. On one hand, we focused on the control by magnetic fields of microtubules regulators conjugated to magnetic particles, in order to decipher the basic molecular mechanisms responsible for the assembly and regulation of the mitotic spindle. On the other hand, we proposed a device for localized electroporation of DNA constructs into mouse embryos, in order to be able to study the dynamic cellular interactions that control the growth, migration and specification of the visceral endoderm between 5 and 7 days of development. A distinctive feature of this work lies in the proposed interdisciplinary approach. Combining several states of the art techniques from Chemistry, Physics, and Biophysics, our ambition has been to demonstrate that micro/nanotechnologies can open new perspectives in Biology.

Dans cette thèse, trois calculs de processus sont étudiés et appliqués à l'analyse de processus biologiques : une variante du π -calcul introduite ici, le Iπ-calcul; le κ-calcul de Danos et Laneve et sa variante à grain plus fin, le mκ-calcul; et les systèmes réactifs bigraphiques de Milner. Le manuscrit comporte trois parties. <br />Dans la première partie, nous modélisons la transduction du signal, et plus spécifiquement le processus d'activation de la protéine "ras". On introduit une nouvelle extension du π-calcul, le Iπ-calcul, pour modéliser ce processus biologique en présence d'aberrance. Le calcul est obtenu en ajoutant deux actions aberrantes au Iπ-calcul. Le Iπ-calcul, quoique déjà assez expressif pour exprimer l'aberrance, peut être encore précisé par l'introduction d'informations supplémentaires dans la syntaxe, soit sous forme de "tags" soit sous forme de types. Les tags sont plus intuitifs, mais ils introduisent de la redondance, qui est éliminée dans la présentation de cette information sous forme de types. Nous montrons l'équivalence entre les deux espèces de décoration. Le système de types / tags présenté ici est très rudimentaire, mais notre espoir est de l'enrichir pour intégrer des paramètres quantitatifs tels que la température, la concentration, etc... dans la modélisation des processus biologiques.<br />Dans la seconde partie, nous abordons d'un point de vue formel la question de l'auto-assemblage dans le κ-calcul, un langage de description d'interactions protéine-protéine. Nous définissons un sous-ensemble de règles de calcul réversibles nous permettant d'assurer un codage sans blocage du calcul "à gros grain" (le κ-calcul) dans un calcul "à grain fin" (le mκ-calcul). Nous prouvons la correction de cette simulation de manière interne (à l'aide des règles réversibles), améliorant ainsi les résultats de Danos et Laneve.<br />Enfin, dans une partie plus prospective, nous suggérons comment l'on peut utiliser les bigraphes pour modéliser et analyser les processus biologiques. Nous montrons d'abord commment coder l'exemple "ras" dans ce formalisme. Puis nous indiquons sur un exemple comment l'on peut traduire le κ--calcul dans les bigraphes.

Une caractéristique des systèmes dynamiques complexes, qu'ils soient physiques ou naturels, est la présence de processus évoluant à différentes échelles de temps (dynamiques multiples) et de façon fortement non-linéaire. Nous nous plaçons dans le cas où l'évolution de chaque processus étudié est une série de mesures, ou bien est issue de la simulation de modèles numériques. Pour concevoir ou améliorer ces modèles en se basant sur l'échelle qui l'intéresse, l'utilisateur doit d'abord être capable de représenter l'évolution de chaque processus à plusieurs échelles, déterminées objectivement selon l'évolution elle-même. Ensuite, le choix d'une ou de plusieurs représentations doit être guidé par l'interprétation des caractéristiques dynamiques à chaque échelle de temps. Nous définissons une notion de granularité temporelle, exprimant le niveau de détail de la représentation. Ayant affaire à des processus biologiques dont la forme de l'évolution est plus informative pour l'utilisateur que les valeurs numériques précises, une représentation qualitative/quantitative est élaborée : une segmentation de l'évolution initiale en épisodes triangulaires (exprimant différentes formes de comportements locaux), puis l'abstraction successive de ces épisodes triangulaires en épisodes trapézoïdaux, conduisent à l'obtention de toutes les représentations possibles de l'évolution, et de toutes les échelles de temps associées. Le développement d'outils graphiques, symboliques et statistiques permet d'identifier et d'interpréter automatiquement les principales caractéristiques dynamiques du processus à n'importe quelle échelle de temps : équilibre, stabilité, périodicité, récurrence, comportements majoritaires, etc. Ces caractéristiques permettent de conseiller un choix d'échelles de temps et, par suite, de fréquences d'échantillonnage pertinentes. Une fonctionnalité suppl émentaire vise à identifier et à dissocier localement les composantes fréquentielles de l'évolution initiale. Des exemples d'interprétation sont donnés pour deux modèles biologiques. Les analyses sont confrontées à la connaissance experte d'un agronome pour la validation de la méthode. Ce travail a conduit à la conception du logiciel PARADISE (Process AbstRaction AnD Interpretation SystEm)

L’anémie falciforme est une maladie monogénique causée par une mutation dans le locus de la β-globine. Malgré le fait que l’anémie falciforme soit une maladie monogénique, cette maladie présente une grande hétérogénéité clinique. On présume que des facteurs environnementaux et génétiques contribuent à cette hétérogénéité. Il a été observé qu’un haut taux d’hémoglobine fœtale (HbF) diminuait la sévérité et la mortalité des patients atteints de l’anémie falciforme. Le but de mon projet était d’identifier des variations génétiques modifiant la sévérité clinique de l’anémie falciforme. Dans un premier temps, nous avons effectué la cartographie-fine de trois régions précédemment associées avec le taux d’hémoglobine fœtale. Nous avons ensuite effectué des études d’association pan-génomiques avec deux complications cliniques de l’anémie falciforme ainsi qu’avec le taux d’hémoglobine fœtale. Hormis les régions déjà identifiées comme étant associées au taux d’hémoglobine fœtale, aucun locus n’a atteint le niveau significatif de la puce de génotypage. Pour identifier des groupes de gènes modérément associés au taux d’hémoglobine fœtale qui seraient impliqués dans de mêmes voies biologiques, nous avons effectué une étude des processus biologiques. Finalement, nous avons effectué l’analyse de 19 exomes de patients Jamaïcains ayant des complications cliniques mineures de l’anémie falciforme. Compte tenu de la taille des cohortes de réplication disponibles, nous n’avons pas les moyens de valider statistiquement les variations identifiées par notre étude. Cependant, nos résultats fournissent de bons gènes candidats pour des études fonctionnelles et pour les réplications futures. Nos résultats suggèrent aussi que le β-hydroxybutyrate en concentration endogène pourraient influencer le taux d’hémoglobine fœtale. De plus, nous montrons que la cartographie-fine des régions associées par des études pan-génomiques peut identifier des signaux d’association additionnels et augmenter la variation héritable expliquée par cette région. / Sickle cell disease is a monogenic disease caused by a mutation in the β-globin locus. Although it is a monogenic disease, it shows a high clinical heterogeneity. Environmental and genetic factors are thought to play a role in this heterogeneity. It has been observed that a high fetal hemoglobin (HbF) levels correlates with a diminution of the severity and mortality of patients with sickle cell disease. The goal of my project was to identify genetic modifiers of the clinical severity of sickle cell disease. First, I performed the fine-mapping of three regions previously associated with HbF levels. Second, I performed genome-wide association studies with two clinical complications of sickle cell disease as well as with HbF levels. Since no new loci reached array-wide significance for HbF levels, I performed a pathway analysis to identify additional HbF loci of smaller effect size that might implicate shared biological processes. Finally, I performed the analysis of 19 whole exomes from Jamaican sickle cell disease patients with very mild complications. In conclusion, given the sample size of the replication cohorts available, we do not currently have the means to statistically validate the association signals. However, these results provide good candidate genes for functional studies and for future replication. Our results also suggest that β-hydroxybutyrate in endogenous levels could influence HbF levels. Furthermore, we show that fine-mapping the loci associated in genome-wide association studies can identify additional signals and increase the explained heritable variation.