Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 293-345. Publ. aussi en version électronique.

Le tissu osseux est constamment renouvelé grâce au travail coopératif des cellules osseuses : les ostéoblastes qui forment l'os et les ostéoclastes qui le résorbent. Tout déséquilibre au niveau du remodelage osseux provoque plusieurs maladies notamment l'ostéoporose, caractérisée par la détérioration de la masse osseuse rendant l'os susceptible aux fractures. Certaines études ont révélé que des facteurs associés au développement de l'athérosclérose participent aussi au développement de l'ostéoporose. Les buts de l'étude étaient d'établir l'implication du calcium dans les voies de signalisation de la lysophosphatidylcholine (lysoPC), une des composantes des lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées et un facteur de risque de l'athérosclérose, et de déterminer les effets du lysoPC sur les fonctions ostéoblastiques des cellules MG-63 et des cellules MC3T3. Des mesures de calcium intracellulaire en microscopie confocale ont montré qu'à partir d'une concentration de 20µM, la lysoPC induit une mobilisation du calcium des réserves cytoplasmiques et un influx calcique de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. La mobilisation était absente lorsque les réserves du réticulum endoplasmique (RE) ont été épuisées par la Thapsigargine, indiquant que la mobilisation provient du calcium libéré du RE. De plus, l'inhibiteur de la phospholipase C (PLC), l'U73122, a bloqué la mobilisation, suggérant que la lysoPC stimule la PLC qui entraîne par la suite la libération du calcium du RE. Par ailleurs, l'influx calcique, d'origine extracellulaire, induit par la lysoPC a été bloqué par le rouge de ruthénium (RR). Ce dernier résultat suggère l'implication des canaux calciques de la famille « vallinoid transient receptor potential » (TRPV). L'expression protéique de TRPV2 et TRPV4 a été mise en évidence par des essais d'immunolocalisation qui ont révélé leur présence au niveau des membranes plasmiques. Lors d'études portant sur l'effet de la lysoPC sur les fonctions cellulaires, des essais de viabilité cellulaire ont démontré que la lysoPC causait une mortalité des ostéoblastes, avec une LC50 de 20µM. La pré-incubation des cellules en présence de RR a montré une protection partielle mettant en évidence l'implication des canaux TRPV. Par la suite, des mesures d'apoptose ont montré une augmentation significative de l'apoptose à partir de 15µM de la lysoPC. La présence de RR dans le milieu d'incubation permettait de réduire l'apoptose induite par la lysoPC. Aussi, la présence de tranilast comme inhibiteur des canaux TRPV2 permettait de réduire la cytotoxicité induite par la lysoPC. D'autre côté, des mesures de la stimulation de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont indiqué qu'une incubation des cellules avec la lysoPC stimule la production de ROS, dont l'augmentation est significative à partir de 20µM. Toutefois, l'ajout de l'antioxydant N-actélcystéine (NAC) au milieu d'incubation n'a pas influencé la cytotoxicité induite par la lysoPC. Par ailleurs, nos expériences ont indiqué que la lysoPC n'influence pas la migration cellulaire, ni la différenciation des cellules ostéoblastiques. Ces résultats indiquent que la lysoPC est à même d'altérer la viabilité des ostéoblastes et ainsi favoriser le développement de l'ostéoporose. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : lysoPC, ostéoblastes, mobilisation et influx calcique, toxicité, apoptose.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Sur la p. de t. 2A apparaît en indice. Bibliogr.: f. 86-96. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. [130]-149. Publié aussi en version électronique.

La cellule utilise des nœuds d’interactions protéiques relativement stables, conservés et souvent constitués d’adaptateurs moléculaires pour gérer des signaux reçus (synthèse, sécrétion, traffic, métabolisme, division), des problèmes de sécurité et de niveaux d’énergie. Nos résultats montrent que la cellule utilise aussi des nœuds relativement petits et dynamiques où des informations propres concernant des voies métaboliques apparemment indépendantes sont évaluées. Ces informations y sont intégrées localement et une décision y est prise pour action immédiate. Cette idée est supportée par notre étude sur le récepteur de l’insuline (RI). Ce récepteur transmembranaire à activité tyrosine kinase reconnaît un signal externe (insuline circulante) et engage la signalisation de l’insuline, les réponses métaboliques et le contrôle du glucose circulant. Le RI est aussi impliqué dans l’internalisation de l’insuline et sa dégradation dans les endosomes (clairance). Il régule donc indirectement la sécrétion de l’insuline par les cellules du pancréas endocrine. La signification pathophysiologique de l’endocytose du RI ainsi que les bases moléculaires d’une telle coordination sont peu connues. Nous avons construit un réseau d’interactions du RI (IRGEN) à partir d’un protéome de fractions Golgi-endosomales (G/E) hépatiques. Nous démontrons une forte hétérogénéité fonctionnelle autour du RI avec la présence des protéines ATIC, PTPLAD1, AMPKα et ANXA2. ANXA2 est une protéine impliquée dans la biogénèse et le transport endosomal. Nos résultats identifient un site de SUMOylation régulé par l’insuline dans sa région N-terminale. ATIC est une enzyme de la voie de synthèse des purines de novo dont le substrat AICAR est un activateur de l’AMPKα. Des analyses biochimiques in vitro et in vivo nous montrent que ATIC favorise la tyrosine phosphorylation du RI par opposition fonctionnelle à PTPLAD1. Une délétion partielle d’ATIC stimule l’activation de l’AMPK dont la sous-unité AMPKα2 apparaît déterminante pour le trafic du RI. Nous démontrons que ATIC, PTPLAD1, AMPKα, AICAR et ANXA2 contrôlent l’endocytose du RI à travers le cytosquelette d’actine et le réseau de microtubules. Nous ressortons un nœud de signalisation (ATIC, PTPLAD1, AMPKα) capable de détecter les niveaux d’activation du RI, d’énergie cellulaires (rapports AMP/ATP) et aussi d’agir sur la signalisation et l’endocytose du RI. Cette proximité moléculaire expliquerait le débat sur le mécanisme primaire du diabète de type 2 (DT2), notamment entre la sensibilité à l’insuline et sa clairance. Nous avons calculé un enrichissement de 61% de variants communs du DT2 parmi les protéines fonctionnellement proches du RI incluant RI, ATIC, AMPKα, KIF5A et GLUT2. Cet enrichissement suggère que l’hétérogénéité génétique révélée par les consortiums sur études génomiques (GWAS) converge vers des mécanismes peu étudiés de biologie cellulaire. / The normal cell deals efficiently with multiple signals, processes (synthesis, secretion, trafficking, metabolism, and division), and energy and security problems. To achieve these goals, the cell uses large and relatively stable proteins nodes (or hubs) often sustained by adapters. It appears that the cell also uses small, dynamics nodes where informations about apparently unconnected major pathways are evaluated. Not only these informations are locally integrated but also a decision is made for immediate action. This is exemplified here by the insulin receptor (IR). This receptor-tyrosine kinase recognizes signals from the outside (circulating insulin) and engages insulin signalling activity and the insulin response. Quite simultaneously, the insulin receptor is involved in insulin internalization and its subsequent degradation in endosomes (clearance of circulating insulin) and thus, it indirectly regulates insulin secretion by the -cells of the endocrine pancreas. The physiological significance of trafficking and the molecular bases of such coordination have received little attention. We constructed hepatic Golgi/endosomes (G/E) network of the internalized IR (IRGEN) and we found substantial heterogeneity within the close environment of IR, with the presence of ATIC, a metabolic enzyme of the de novo purine synthesis pathway, the putative tyrosine phosphatase PTPLAD1, the energy sensor AMPK and ANXA2, a protein involved in endosomes biogenesis and endosomal transport. Our results show that ANXA2 is SUMOylated on an insulin-dependent way at a non-concensus motif of its N-terminal domain. It appears that following insulin stimulation, the proteins ATIC, PTPLAD1, AMPKα associate within seconds with the activated IR and control its tyrosine kinase activity and traffic. We found that PTPLAD1 and AMPKα are rapidly compartmentalised within the plasma membrane (PM) and G/E fractions after insulin stimulation and that ATIC accumulates in the G/E fraction later. By using an in vitro reconstitution system and siRNA–mediated partial knockdown of ATIC and PTPLAD1 in HEK293 cells, we confirmed that ATIC, PTPLAD1 and AMPKα affect IR tyrosine phosphorylation and endocytosis and treatment with AICAR, increased IR endocytosis in cultured cells and in the liver. These results suggest the presence of a new signalling mechanism that senses in the same time adenylate synthesis, cell energy (ATP) and IR activation states and that acts consequently in regulating IR autophosphorylation and endocytosis. The IRGEN may explain the perceived promiscuity that exists between insulin resistance and clearance, as this new signalling node apparently controls both the IR activity and trafficking. The elevated number of common heritable variants associated with type 2 diabetes (T2D) in the actual IRGEN (more than 61 %) favours the idea that the confusing genetic heterogeneity converges however towards few biological mechanisms.

GRB2 est une protéine adaptatrice régulant la transduction du signal en aval de récepteurs tyrosine kinases (RTK). En interagissant avec différentes combinaisons de récepteurs et d’effecteurs, GRB2 régule la spécificité et diversité des réponses cellulaires. La suractivation du RTK HER2 dans le cancer du sein (HER2+) est associée à un mauvais pronostic. GRB2 interagit avec ce dernier et soutient la progression tumorale dépendante de HER2, constituant ainsi un acteur majeur de la signalisation en aval de ce RTK. L’objectif du projet était de caractériser les réseaux de GRB2 dans le cancer mammaire HER2+. Nous avons utilisé des purifications d’affinité couplées à la spectrométrie de masse pour caractériser l’interactome de GRB2 dans différents modèles du cancer du sein HER2+. Nous avons ainsi identifié 35 partenaires de GRB2 dans une lignée de cancer mammaire HER2+, incluant des interacteurs connus tels que PTPN11. Ces expériences ont de plus permis de valider 5 partenaires de GRB2 non recensés dans la littérature. Nous avons également mis en évidence pour la première fois des modifications dans les réseaux de signalisation dépendants de GRB2 dans la progression tumorale du cancer du sein HER2+. En effet, 62 partenaires de GRB2 ont été identifiés dans deux modèles, dont 18 sont associés à la protéine adaptatrice exclusivement après modélisation de la progression tumorale. Parmi ces derniers, 6 interacteurs de GRB2 ont été caractérisés pour la première fois par ces expériences. Nos travaux ont donc permis l’identification de 72 partenaires de GRB2, dont 11 ne sont pas recensés dans la littérature. L’un des partenaires de GRB2 identifié dans cette étude, MPZL1, est une glycoprotéine membranaire participant au processus métastatique en favorisant l’adhésion et la migration cellulaires. Ces processus ayant été démontrés dépendants de la signalisation de HER2 à travers son interaction à GRB2, nous avons caractérisé cette association plus en détail. Nous avons démontré que l’association de MPZL1 phosphorylée à GRB2 nécessite la phosphatase PTPN11 et le domaine SH2 de GRB2. Nous avons démontré que la fibronectine induit la nucléation du complexe et le recrutement membranaire de GRB2. En conclusion, nous avons identifié un nouveau complexe signalétique potentiellement impliqué dans l’adhésion cellulaire à la matrice. Nous postulons que ce complexe, ainsi que de nouvelles associations de GRB2 identifiées par nos travaux, puissent participer au processus métastatique induit par HER2, et ainsi puissent constituer de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes. / GRB2 is an adaptor protein involved in receptor tyrosine kinase (RTK) signaling. By interacting with a wide variety of RTKs as well as cytoplasmic effectors, GRB2 controls the specificity and diversity of cellular responses. GRB2 was shown to be crucial for HER2 RTK downstream signaling to regulate HER2-driven oncogenesis. HER2 is overexpressed in 15-20% of breast tumors (HER2+), and its overexpression is associated with a poor prognosis. Since GRB2 binding to different combinations of receptors and targets regulate downstream cell response, we hypothesized that GRB2 interaction network in a HER2 overexpression context would show new complexes promoting HER2-driven tumour progression. Thus, we sought to identify the GRB2-centered protein interaction network in different HER2+ breast cancer (BCa) models using affinity purifications followed by mass spectrometry analysis of the binding proteins. We identified 35 GRB2 binding partners in human HER2+ BCa cells, including both known (PTPN11) and novel interactors. In fact, 5 GRB2 interactors validated in our study were not previously described in the literature. Furthermore, we showed for the first time that GRB2-dependent signaling networks are modified in HER2+ BCa progression. Indeed, we identified 62 GRB2 binding partners in two tumour progression models, of which 18 were specific to tumour progression since they were not identified in the control conditions. Among these, 6 were not previously reported in the literature. One of the newly identified binding partner of GRB2, MPZL1, is a membrane glycoprotein involved in the metastatic process by promoting cell adhesion and migration on extracellular matrix. As these functions were shown to depend on HER2 signaling through GRB2, we sought to characterize the association further. We showed that MPZL1 interaction with GRB2 requires the glycoprotein phosphorylation, its association to phosphatase PTPN11 as well as the adaptor SH2 domain. Finally, we showed that fibronectin can trigger this complex association and GRB2 membrane recruitment. In conclusion, we identified a new signaling complex in HER2+ BCa that is likely involved in the control of cell adhesion and migration. Thus, we postulate that this complex, as well as other newly identified GRB2 associations, could promote HER2–driven oncogenesis and as such may represent interesting potential drug targets for HER2+ BCa.

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Ce projet de recherche porte sur la sous-unité gamma de la transducine (Gγt), participant à la phototransduction visuelle, plus précisément pour comprendre son mécanisme d'ancrage aux membranes par des interactions favorables de ses résidus et de son acylation de type farnésyle. La Gγt non-acylée a été obtenue en la surexprimant chez E. coli en fusion avec une étiquette de solubilisation/purification et en la purifiant par chromatographie d'affinité. L'identité de la séquence de la Gγt non-acylée a été confirmée par spectrométrie de masse. Afin d'étudier la forme acylée, des essais de surexpression ont été tentés en procédant à une cotransformation de la Gγt en présence de la farnésyle transférase. De plus, trois peptides ont été synthétisés commercialement pour analyser l'influence de chaque hélice alpha de la Gγt sur sa liaison membranaire, chacune comportant l'une des deux hélices : le segment C-terminal non-acylé, le segment C-terminal acylé et le segment N-terminal. Des analyses par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont permis de confirmer la structure secondaire native des formes de la Gγt et de caractériser leur dénaturation en fonction de la température et du temps. La liaison membranaire des formes de la Gγt a ensuite été analysée par le modèle des monocouches de Langmuir avec tensiométrie de surface, par spectroscopie infrarouge en présence de vésicules lipidiques et par spectroscopie infrarouge PM-IRRAS avec des monocouches de différents lipides. Finalement, l'analyse des résultats a permis de démontrer la fragilité de la structure de l'hélice alpha en C-terminal de la Gγt en fonction de la température et au cours de sa liaison membranaire ainsi que l'impact majeur de la farnésylation sur les propriétés de liaison membranaire de son segment C-terminal. Certaines questions de recherche ont été répondues et de nouvelles perspectives de recherche se dévoilent. / This research project aimed to study the gamma subunit (Gγt) of transducin, implicated in the visual phototransduction, more precisely the stability of its individual alpha helical segments and its mechanism of membrane binding involving favorable interactions from its residues and its farnesyl group. The non-acylated Gγt was obtained based on its expression in E. coli in fusion with a solubilization/purification tag and its subsequent purification by affinity chromatography. Its analysis by mass spectrometry allowed to confirm the identity of the non-acylated Gγt. The expression of the farnesylated Gγt was attempted. Three peptides were commercially synthesized to perform the analysis of each individual alpha helix of Gγt and to determine their role in its membrane binding. Each peptide segment contained one of the two alpha helices : the C-terminal non-acylated segment, the C-terminal acylated segment and the N-end segment. Circular dichroism and infrared spectroscopy analyses allowed to confirm the secondary structure of each form of Gγt, and their extent of denaturation has been determined as a function of temperature and time. The membrane binding of each form of Gγt was then analyzed using Langmuir monolayers with surface tensiometry, as well as by infrared spectroscopy in the presence of lipid vesicles and by infrared PM-IRRAS spectroscopy with different lipid monolayers. Finally, the results demonstrated the instability of the alpha helix of the C-terminal segment of Gγt as a function of temperature and the high impact of its farnesylation on the strength of its membrane binding. Some of the initially raised questions were answered while some new perspectives of research are presented.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie infantile multigénique et complexe. Les enfants atteints d’AF souffrent d’une insuffisance médullaire progressive potentiellement mortelle. En plus du phénotype hématologique, les enfants souffrant d’AF présentent de nombreuses malformations congénitales incluant le système nerveux central et une prédisposition accrue aux cancers particulièrement de type leucémique. Plusieurs gènes associés à la maladie ont été identifiés mais leur fonction dans l’étiologie de la maladie demeure inconnue. La présence d’une mutation dans l’un des gènes Fanconi entraine une perte progressive des cellules souches hématopoïétiques (CSH) menant à un épuisement médullaire et favorisant l’apparition de leucémies. Les protéines Fanconi forment trois complexes protéiques distincts qui participent de manière séquentielle dans une voie de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. La protéine Fanconi Anemia de groupe C, ou FANCC, est une composante du complexe majeur de cette voie Fanconi. Outre son rôle dans la voie Fanconi et dans les mécanismes de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN, FANCC est connue pour son implication dans la mort cellulaire programmée, la détoxification des radicaux oxygénés et la réponse aux cytokines. Afin d’identifier la fonction de la protéine FANCC dans les mécanismes de développement, nous avons procédé à un criblage d’une banque d’ADNc et identifié certains partenaires biochimiques de FANCC tel le récepteur de la Netrine-1, uncoordinated-5A (UNC5A). Puisque le récepteur UNC5A a une fonction de signal de survie cellulaire et est impliqué dans les mécanismes de croissance neuronale, nous avons étudié le rôle de l’interaction FANCC-UNC5A dans les mécanismes de différenciation neuronale. Nos résultats indiquent que FANCC régule la fonction pro-apoptotique de UNC5A. Lorsque FANCC est surexprimée, les cellules retardent leur entrée en apoptose tandis qu’en absence de FANCC, UNC5A favorise l’entrée en apoptose. De plus, nos résultats indiquent que FANCC conjointement à UNC5A promeut la neurogénèse; FANCC et UNC5A colocalisent dans les neurites cellulaires. Globalement, nos résultats suggèrent que FANCC par le biais de UNC5A joue un rôle important dans la mort cellulaire et la croissance axonale. Ainsi, une dérégulation de l’interaction FANCC-UNC5A chez les patients souffrent de FA pourrait expliquer certains aspects cliniques notamment les anomalies de développement. / Fanconi anemia (FA) is a recessive syndrome characterized by diverse clinical symptoms including progressive bone marrow failure, various congenital abnormalities, chromosomal instability and predisposition to malignancies. Studies of the canonical FA pathway have focused on the mechanism of repair of DNA cross-linking damage. However, some data suggest that FA proteins may have other functions besides DNA damage signaling events, and these functions may explain some of the disease phenotypes such as defects in hematopoiesis and congenital malformations. For instance, FANCC, which is predominantly located in the cytoplasm, has multifunctional roles and is an anti-apoptotic regulator. In addition to its function as a repulsive mediator in neural development, UNC5A, the receptor for the axon guidance molecule Netrin-1, has also been proposed to be a “dependence receptor” that triggers apoptosis in the absence of its ligand. Here, we identified a novel interaction of UNC5A with FANCC and showed that FANCC positively regulates UNC5A-mediated apoptosis. Under conditions of FANCC overexpression, apoptosis is decreased, whereas the absence of a functional FANCC protein increases UNC5A-mediated apoptosis. Furthermore, FANCC and UNC5A function as a complex in neurogenesis; they co-localize at synapses formed by neurites, and FANCC is required for the promotion of neuronal outgrowth by UNC5A. Based on these findings, we propose that FANCC plays a key role in tissue morphogenesis by either delaying UNC5A-mediated apoptosis or positively impacting the expression of UNC5A. Under FANCC-deficient conditions, dysregulation of the UNC5A signal pathway can lead to developmental defects such as those seen in FA patients.

Une chute d'expression de l'enzyme L-isoaspartyl (D-aspartate) méthyltransferase (PIMT), connue pour réparer les protéines endommagées qui ont accumulé des résidus aspartates anormaux, a été démontrée chez le rat atteint de troubles neurologiques à caractère épileptique et dans les glioblastomes humains. Dans cette étude, un profil protéomique correspondant au phénomène de l'inhibition de la PIMT a été dressé, suite à la combinaison de la technologie de l'ARN interférent (siRNA) et de la technologie de micro-puces d'anticorps (microarray). Un changement du niveau d'expression de plusieurs protéines, sous leur forme totale et phosphorylée, dont Erk et phospho-Erk, RSK et phospho-RSK ainsi que Akt et phospho-Akt a été observé. Ces résultats ont été confirmés par immunodétection, conjointement à la validation d'une méthode d'enrichissement des phosphoprotéines par chromatographie d'affinité dont la matrice est composée de trioxyde d'aluminium. Par la suite, un traitement combinant l'inhibition de la PIMT et l'utilisation de l'acide valproïque, un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, a permis d'observé un effet sur l'activation d'Akt et de RSK ainsi que sur l'expression de RSK1. Paralèllement, le traitement à l'acide valproïque a permis d'observer que celui-ci stimule l'expression de la PIMT. L'identification de ces protéines et de leur régulation lors de l'inhibition de la PIMT, suggère que la PIMT contrôle des voies de signalisation dont celle des Mitogen-activated protein kinases (MAPK) passant par ERK ainsi que d'autres voies de signalisation impliquant Akt et RSK. Lors de l'inhibition de la PIMT de concert avec le traitement à l'acide valproïque, ces voies de signalisation semblent être davantage activées. Bien que ce travail de recherche ne procure que des résultats préliminaires sur le contrôle que peut avoir la PIMT sur les voies de signalisation intracellulaires, ceux-ci font place à des hypothèses intéressantes qui une fois confirmées, permettront de trouver des cibles pharmacologiques qui aideront à contrer le développement des neuropathologies telles que l'épilepsie et les tumeurs cérébrales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : AKT, Cellules gliales cancéreuses, ERK, Immobilized metal-affinity chromatography, Phosphoprotéomique, PIMT, RSK.