Titre de l'écran-titre (visionné le 7 septembre 2023) / Les cellules épithéliales qui tapissent la lumière de l'épididyme travaillent de manière concertée afin d'établir un microenvironnement propice pour la maturation et le stockage des spermatozoïdes. Nous avons précédemment démontré que l'ATP, qui est sécrétée par les cellules principales de l'épididyme, fait partie d'un réseau de communication extracellulaire qui mène ultimement à la sécrétion de protons par les cellules claires avoisinantes. Le processus d'acidification luminale est nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes dans un état de dormance pendant leur transit dans l'épididyme. Nos travaux visent à étudier la régulation autocrine des cellules principales, en identifiant les transporteurs impliqués dans le processus de sécrétion d'ATP ainsi que leur réponse à l'ATP extracellulaire. Nous avons observé une sécrétion d'ATP constitutive par la lignée de cellules principales épididymaires (DC2) qui était inhibée de façon significative par le Probénécide (PBN), un inhibiteur de la pannexine-1 (PANX-1), et par l'antagoniste de P2X7, A438079. Nous avons aussi confirmé que CFTR est un modulateur de la sécrétion d'ATP. De plus, lorsque les inhibiteurs étaient utilisés en combinaison (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN et CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), aucune inhibition additionnelle de la sécrétion basale d'ATP n'a été détectée, ce qui suggère que PANX-1, P2X7 et CFTR moduleraient un mécanisme commun de sécrétion d'ATP par les cellules DC2. Par ailleurs, l'ajout d'ATPɣS (analogue non-hydrolysable de l'ATP) a induit une augmentation significative des niveaux de calcium intracellulaire (Ca²⁺ᵢ), qui était réduite sans être complètement abolie en absence de calcium dans le milieu extracellulaire. Ces résultats suggèrent une régulation autocrine des cellules principales via l'activation de voies dépendantes du Ca²⁺ᵢ qui impliquerait à la fois les récepteurs P2X et P2Y. Nous procédons actuellement à l'identification des sous-types de récepteurs P2 responsables de l'augmentation du Ca²⁺ᵢ induit par l'ATP dans les cellules DC2. / Epithelial cells lining the epididymis work in a concerted manner to establish an optimal luminal environment for the maturation and storage of spermatozoa. We previously showed that ATP, secreted from principal cells (PCs), is part of a complex extracellular communication network that ultimately leads to activation of neighboring clear cells (CCs). In particular, ATP and its hydrolysis product adenosine stimulate proton secretion by CCs via apical accumulation of the proton pump V-ATPase. Luminal acidification maintains sperm in a quiescent state during their transit in the epididymis. Here we explored the autocrine regulation of PCs by dissecting the transporters involved in ATP secretion, as well as their response to extracellular ATP. Constitutive ATP secretion by the epididymal principal cell line (DC2) was observed, which was significantly inhibited by the pannexin-1 (PANX-1) inhibitor, probenecid (PBN), and the P2X7 antagonist A438079. We also confirmed that CFTR is a modulator of ATP secretion by using the CFTRᵢₙₕ₁₇₂. When inhibitors were applied together (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN, and CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), no additional inhibition was detected on basal levels of ATP release. Furthermore, our results showed that addition of ATPɣS (non-hydrolysable form of ATP) significantly increased intracellular calcium (Ca²⁺ᵢ) levels, indicating that PCs are regulated in an autocrine manner through ATP signaling. Our results also indicate the participation of both P2X receptors and P2Y receptors subtypes in this response to luminal ATP. Our study suggests that P2X7, PANX-1 and CFTR modulate a common ATP release mechanism in the epididymis, and that ATP participates in PCs autocrine regulation via activation of Ca²⁺⁻dependent pathways. We are currently examining the participation of P2 receptor subtypes in the ATP-induced Ca²⁺ᵢ increase.

Le cancer de la bouche est un problème de santé publique majeur. Les traitements des cancers buccaux incluent l’utilisation de la chirurgie, de la chimiothérapie et de la radiothérapie. Bien que fonctionnels, ces traitements présentent de nombreux effets indésirables. Il est pertinent de mettre au point une nouvelle génération de médicaments anticancéreux efficaces et spécifiques. L’objectif de cette étude est d’évaluer les propriétés antitumorales de l'anéthol (1-méthoxy-4-[(E)-1-propényl]-benzène), un composé extrait du fenouil et de l'anis, afin de caractériser ses effets sur des cellules de carcinome buccal. Pour ce faire, des cellules gingivales cancéreuses (Ca9-22), des cellules épithéliales gingivales primaires et des fibroblastes ont été traités avec différentes concentrations d’anéthol. La prolifération cellulaire et l'effet cytotoxique de l’anéthol sur les trois types cellulaires ont été mesurés respectivement par MTT et LDH, tout comme l’effet synergique avec le cisplatine. La mort cellulaire, l’autophagie et le stress oxydatif des Ca9-22 ont été mesurés par cytométrie en flux. La migration cellulaire a été évaluée par la capacité de cicatrisation alors que l’expression des protéines impliquées dans les voies de signalisation de l’EGFR (ERK1/2, p38, pJNK) a été étudiée par immunobuvardage. Nos résultats ont démontré que l’anéthol diminue de manière dose-dépendante la prolifération cellulaire et induit l’apoptose des cellules cancéreuses comparativement aux cellules gingivales normales. L’anéthol inhibe le stress oxydatif et favorise l’autophagie des Ca9-22. L’anéthol inhibe la transition épithéliomésenchymateuse, réduit l’expression des métalloprotéases, ainsi que la production des protéines oncogènes, dont cyclineD1, mais augmente l’expression du gène suppresseur de tumeur p53. L’anéthol inhibe les voies de signalisation dépendantes de l’activation de l’EGFR et Wnt, et active le clivage des caspases et de PARP1. Enfin, l’anéthol montre une synergie avec le traitement par cisplatine. En conclusion, nos résultats obtenus suggèrent que l’anéthol pourrait être utilisé comme thérapie complémentaire ou alternative du cancer de la bouche. / Oral cancer is a major public health problem. Treatments for oral cancer include the use of surgery, chemotherapy, and radiation therapy. Although functional, these treatments have many side effects. It is relevant to develop a new generation of effective and specific anticancer drugs. The objective of this study is to assess the antitumor properties of anethole (1-methoxy-4 - [(E) -1-propenyl] -benzene), a compound extracted from fennel and anise, in order to characterize its effects on oral carcinoma cells. To do this, cancerous gum cells (Ca9-22), primary gingival epithelial cells and fibroblasts were treated with different concentrations of anethole. Cell proliferation and the cytotoxic effect of anethole on all three cell types were measured respectively by MTT and LDH, as was the synergistic effect with cisplatin. Cell death, autophagy and oxidative stress of Ca9-22 were measured by flow cytometry. Cell migration was assessed by the healing capacity while the expression of proteins involved in EGFR signaling pathways (ERK1/2, p38, pJNK) and other proteins involved in cancer-signaling pathways was studied by immunoblotting. Our results showed that anethole dose-dependently decreases cell proliferation and induces cancer cell apoptosis compared to normal gingival cells. Anethole inhibits oxidative stress and promotes autophagy of Ca9-22. Anethole inhibits epithelial-mesenchymal transition, reduces the expression of metalloproteases, as well as the production of oncogenic proteins, as cyclinD1, but increases the expression of the tumor suppressor gene p53. Anethole inhibits Wnt and signaling pathways dependent on EGFR activation, and activates the cleavage of caspases and PARP1. Finally, our results show that this compound has a synergistic effect with cisplatine treatment. In conclusion, these results suggest that anethole could be used as a complementary or alternative therapy to oral cancer.

Objectif: Plusieurs études écologiques, d'observation et expérimentales suggèrent que des apports ou des niveaux circulants élevés de vitamine D sont associés à des risques plus faibles de divers cancers, incluant le cancer du sein. Les effets de la vitamine D passent par son récepteur (VDR) et ultimement permettent la régulation de la croissance, de la différenciation, de l'apoptose et de plusieurs autres mécanismes cellulaires impliqués dans la carcinogenèse. Les variations génétiques (telles que les SNP pour « Single Nucleotide Polymorphisms ») des gènes qui codent pour les diverses protéines impliquées tout au long de la voie de signalisation de la vitamine D sont susceptibles d'influencer les effets de la vitamine D. Dans cette thèse seront examinés trois groupes d'associations : 1) les associations entre deux SNP du VDR et le risque de cancer du sein; 2) les associations entre plusieurs SNP situées tout au long de la voie de signalisation de la vitamine D et la densité mammaire à la mammographie, celle-ci étant un important marqueur intermédiaire du risque de cancer du sein; 3) les associations entre deux SNP du gène de la protéine de transport de la vitamine D (DBP) et la concentration circulante de vitamine D, le niveau circulant de 25-hydroxyvitamine D (25(OH)D) étant le meilleur marqueur du statut global en vitamine D. Méthodes : L'association entre deux SNP du VDR (Fokl et Bsml) et le risque de cancer du sein a été étudiée dans deux études cas-témoins indépendantes réalisées chez des femmes de la grande région de Québec (totalisant 937 cas et 1500 témoins ). Les associations entre 13 SNP de la voie de signalisation de la vitamine D et la densité mammaire ont été étudiées chez 741 femmes préménopausées ayant eu une mammographie de dépistage dans une clinique radiologique de Québec. Dans cette dernière population la relation entre deux SNP du gène de la protéine de transport de la vitamine D {DBP-1 et DBP-2) et le niveau sanguin de 25(OH)D a aussi été étudiée. Résultats : Les génotypes ff (homozygotes rares) du polymorphisme VDR Fokl sont associés à un risque de cancer du sein plus élevé (étude 1: RC=1,22, IC95%=0,76-1,95, étude 2: RC=1,44, IC95%= 1,05-1,99, études combinées: RC=1,33, IC95%= 1,03-1,73). Cette relation est modifiée par l'histoire familiale de cancer du sein dans les deux études tout comme dans leur analyse combinée (Pinteraction^O^l, 0,050, et 0,0059 respectivement). Les rapports de cotes parmi les femmes sans histoire familiale étaient de 1,00, 1,27 (IC95%=1,02-1,58) et 1,57 (IC95%=1,18-2,10) respectivement pour les porteuses de FF, Ff et ff (Ptendance=0,0013). Dans le cas du polymorphisme VDR Bsml, les génotypes Bb+bb étaient associés à une légère augmentation non significative du risque dans les deux études (RC combiné =1,22, IC95%=0,95-1,57) comparativement aux femmes avec le génotype BB, sans interaction avec l'histoire familiale. L'étude de l'association entre 13 polymorphismes situés sur les gènes vitamin D receptor (VDR), cytochrome P450, family 27, subfamily B, polypeptide 1 (CYP27B1) et vitamin Dbinding protein (DBP) n'a pas permis de détecter d'associations statistiquement significatives entre ces derniers et la densité mammaire (Ptendance>0,15) chez les femmes préménopausées. Les deux polymorphismes DBP-l et DBP-2 sont associés aux niveaux de 25(OH)D. Chaque copie additionnelle de l'allèle rare de DBP-l ou DBP-2 est associée à une baisse des niveaux de 25(OH)D (P=-3,29, Pte„dance=0,0003; p=-4,22, Ptendance=<,0001, respectivement). Ces associations semblent plus apparentes lorsqu'il y a beaucoup de vitamine D à transporter (P=-3,78 vs p=-l,74 pour DBP-l et B=-5,73 vs p=-3,03 pour DBP-2, respectivement en été/automne vs en hiver/printemps), l'effet modifiant n'étant cependant pas significatif (Pinteraction=0,27 et 0,16 respectivement). Enfin, ces deux SNP expliquent autant de variation des concentrations de 25(OH)D que les apports totaux en vitamine D (iM.3% pour DBP-l et r2 =2,0% pour DBP-2 vs r^l^/ o pour les apports en vitamine D). Conclusion : Dans leur ensemble les résultats présentés dans cette thèse supportent l'idée que la vitamine D et plusieurs polymorphismes de sa voie de signalisation sont susceptibles de jouer un rôle non négligeable dans l'étiologie du cancer du sein. On a en effet mis en évidence que les porteuses de certains polymorphismes du récepteur à la vitamine D sont plus à risque de cancer du sein. On a également démontré que des variations génétiques du gène de la protéine de transport de la vitamine D sont associées à un faible niveau sanguin de 25-hydroxyvitamine D (25(OH)D). Dans le contexte où les suppléments en vitamine D sont pressentis comme moyen pour réduire l'incidence du cancer du sein, ces résultats sont particulièrement importants puisqu'ils suggèrent que certains sous-groupes de la population pourraient bénéficier différemment d'un apport de cette vitamine. Cette hypothèse devrait faire l'objet de recherches ultérieures.

Les variations génétiques entre les individus peuvent expliquer plusieurs différences interindividuelles dans la présentation et la progression de certaines maladies. La parodontite apicale est une maladie causée par la réponse immunitaire de l'hôte en réponse à des pathogènes dans la pulpe dentaire. La reconnaissance decertains patrons moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) localisés sur les cellules pulpaires mène à l'activation de la voie de signalisation des récepteurs de type *Toll Like récepteur 4* (TLR4), menant à l'activation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Ceci se traduit en la production d'une multitude de médiateurs inflammatoires, comme l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Ces molécules jouent un rôle clé dans la pathogenèse de la parodontite apicale en altérant le mécanisme de remodelage osseux en faveur de la lyse osseuse. Le projet de recherche présenté vise à évaluer l'impact de certains polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) de la voie de signalisation des TLR4 sur la parodontite apicale. Les participants ont été recrutés dans les cliniques dentaires de la faculté de médecine dentaire de l'Université Laval. 52 participants avec une parodontite apicale ont été recrutés dans le groupe expérimental et 88 participants avec une santé bucco-dentaire optimale ont été recrutés pour le groupe contrôle. 3mL de salive de chaque participant ont été récoltés dans des tubes de collecte le jour de l'examen. Ces échantillons étaient ensuite utilisés pour en extraire l'ADN et effectuer un génotypage pour identifier les SNP visés par le projet de recherche. Deux SNPs du gène de TLR4 ont été sélectionnés (rs2770150 et rs4986790) ainsi que deux SNPs du gène de MYD88 (rs7744 et rs8177374). Une analyse statistique globale des participants ainsi que celles se basant sur l'âge et le sexe de deux groupes de participants ont été effectuées dans le but d'identifier une potentielle association entre ces SNPs de la voie de signalisation de TLR4 et la parodontite apicale. L'analyse statistique n'a révélé aucune association significative entre les génotypes et la prévalence de la parodontite apicale dans l'ensemble des données ou dans les analyses en sous-groupes. Selon les données disponibles dans ce projet de recherche, les SNPs rs2770150 et rs4986790 de TLR4 ainsi que rs7744 et rs8177374 de MYD88 n'ont pas d'impact sur la prévalence de laparodontite apicale ou la présence de symptômes cliniques dans la population québécoise.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le type de leucémie le plus commun chez l'adulte en occident. L'évolution clinique des patients est hétérogène et difficile à prédire. Notre groupe a mis en évidence que la LLC est plus agressive chez les patients ayant une expression élevée de la voie glycosyltransférase UGT2B17 au niveau des cellules B leucémiques. En effet, UGT2B17 est associé à une survie sans progression et une survie globale réduite des patients LLC, et constitue ainsi un marqueur pronostique indépendant de ceux utilisés en clinique actuellement. UGT2B17 est également associée à de la pharmacorésistance accrue de certains antileucémiques tel que l'ibrutinib, une molécule inhibitrice de la tyrosine kinase de Bruton (BTK) de la voie pro-survie du récepteur des cellules B (BCR). La résistance aux médicaments demeure un obstacle important à la guérison des patients atteints de LLC. Mon projet avait pour objectif de se pencher sur le ou les mécanismes impliqué(s) par lequel ou lesquels UGT2B17 affecte la progression et la réponse au traitement de la LLC en étudiant la voie du BCR. Nos données révèlent une modification significative de l'expression en ARNm et au niveau protéique d'effecteurs de la voie du BCR lors de la surexpression d'UGT2B17. Ceci suggère un effet transcriptionnel d'UGT2B17 par un mécanisme encore inconnu. De plus, la modification du statut phosphorylé de protéines de la voie du BCR appuie une influence d'UGT2B17 sur la transduction du signal de ce récepteur. De plus, une interaction protéine-protéine entre UGT2B17 et BTK de la voie du BCR, a pu être observée, suggérant l'implication d'un réseau d'interaction complexe dans les cellules B leucémiques impliquant UGT2B17. Ces résultats indiquent une influence d'UGT2B17 sur la voie de signalisation du BCR. UGT2B17 pourrait promouvoir des phénotypes oncogéniques et une réponse réduite aux traitements anticancéreux en favorisant la signalisation du BCR. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in adults in the western world. Patient outcomes are heterogenous and can be difficult to predict. Our group evidenced that CLL is more aggressive in patients with high expression of the glycosyltransferase pathway UGT2B17 in leukemic B cells. UGT2B17 is associated with shorter treatment-free survival and global survival of CLL patients, providing novel information for risk assessment independent of known prognostics markers used in clinic. UGT2B17 also affects B-cells sensitivity to drugs such as ibrutinib, an emerging therapy inhibiting the pro-survival B cell receptor (BCR)-associated Bruton's tyrosine kinase (BTK). Drug's resistances remain a clinic obstacle to CLL patients' recovery. My project's objectives were to study UGT2B17 mechanisms that affects progression and treatment response in CLL by investigating the BCR signaling pathway. Our results reveal a significative modulation of the expression in mRNA and in protein of effectors of the BCR pathway with UGT2B17 surexpression. That suggests a transcriptional effect of UGT2B17 via an unknown mechanism. Moreover, the modification of the phosphorylation status of downstream proteins supports an influence of UGT2B17 on the signal transduction of this receptor. A protein-protein interaction between UGT2B17 and the Bruton's tyrosine kinase (BTK) of the BCR pathway has been observed. This interaction suggests the implication of a complex interaction network in the leukemic B cells that involves UGT2B17. Those results indicate an influence of UGT2B17 on the BCR signaling pathway. UGT2B17 could promote oncogenic phenotypes and an altered anticancer treatment response favoring the BCR signaling pathway.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes au Canada et demeure la troisième cause de mortalité par cancer. Le récepteur aux androgènes (AR) est un récepteur nucléaire qui appartient à la superfamille des récepteurs stéroïdiens. AR est un facteur de transcription, dont ses gènes cibles sont impliqués dans la prolifération et la survie des cellules prostatiques. La signalisation androgénique, via les androgènes et le AR, joue donc un rôle central dans le développement normal et pathologique de la prostate. Les patients métastatiques sont d’abord castrés puis traités par des anti-androgènes. Cependant, la majorité des CaP deviendront résistants à la castration (CRPC). Bien que de nouvelles thérapies, telles que l’Enzalutamide (Enza), aient été développées, les patients développeront des résistances et décèderont invariablement de leur maladie à court terme. L’objectif de nos études était de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation de la signalisation du AR dans les CRPC, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de prédire la réponse des patients à l’Enza. Nous avons utilisé deux techniques innovantes de protéomique. D’abord par une approche de biotinylation de proximité (BioID), nous avons identifiés 32 partenaires du AR dans des cellules de CaP non stimulées, dont 17 ne sont pas recensés à ce jour dans la littérature. De plus, après stimulation androgénique, le réseau du AR est étendu à 262 protéines, incluant 215 nouveaux interacteurs. De façon intéressante, nous avons démontré que la protéine Krüppel-like factor 4 (KLF4), un nouvel interacteur du AR après stimulation, réprime l’activité transcriptionnelle de celui-ci. Par ailleurs, via une approche de phosphoprotéomique quantitative, nous avons mis en évidence 26 protéines (42 phosphosites distincts) qui présentent des changements de phosphorylation dans des lignées de CaP résistantes à l’Enza par rapport à une lignée sensible. De plus, nous avons identifié six protéines (pour sept sites de phosphorylation) dont la phosphorylation est augmentée à la fois chez un patient ayant un CaP de score de Gleason 9 et dans une lignée résistante à l’Enza, en tant que biomarqueurs potentiels. Nos travaux nous ont ainsi permis de mettre en évidence des protéines qui sont impliquées dans la régulation des réseaux de signalisation du AR après stimulation androgénique ou dans la résistance à l’Enza. Par conséquent, ces candidats pourraient devenir des cibles thérapeutiques alternatives pour le traitement du CRPC et participer à l’amélioration de la prise en charge des patients. / Prostate cancer (PCa) is the most frequently diagnosed cancer in Canadian men and is the third cause of cancer mortality. The Androgen Receptor (AR) is activated by androgens, leading to prostatic cell proliferation and survival. The primary treatment for advanced PCa is thus androgen-deprivation therapy, which may be achieved via surgical or chemical castration. Nevertheless, most PCas become castration-resistant (CRPC). Although new anti-androgens (e.g. Enzalutamide) were developed to improve patients’ survival, their efficacy remains very limited and most CRPC patients die from the disease within a few years. We postulated that by gaining insights into AR signalling networks in the context of CRPC, we could better direct patients towards the best-suited therapy and propose new therapeutic targets. To achieve this, we took advantage of two innovative proteomic approaches to characterize global AR signalling networks. First, using proximitylabeling assay (BioID), we identified 32 AR-associated proteins in non-stimulated cells, 17 of which were not previously reported. Upon androgenic stimulation, the AR signalling network increased to 262 proteins, including 215 previously unreported partners. Interestingly, we identified the transcription factor KLF4 and found that it acts as a repressor of AR target genes transcription. Second, using quantitative phosphoproteomic analyses, we observed 26 phosphoproteins (from 42 peptides) whose phosphorylation is modulated in Enza-resistant PCa cells. Moreover, we identified 7 phosphosites (on 6 proteins) that are more abundant in high grade cancer biopsies and in Enza-resistant cells. These proteins could become potential biomarkers. Taken together, our data highlight new potential drug targets that may be relevant for the acquisition or the prediction of Enza resistance. These studies will lead to the development of new predictive tools as well as to the discovery of alternative therapeutic targets for CRPC.

La plupart des fonctions des epitheliums simples, tel que le transport vectoriel, l'absorption et la sécrétion, sont possibles grâce à la polarité épithéliale. La polarité épithéliale est caractérisée par la distribution asymétrique des composants cellulaires selon un axe apico-basal. L'altération de la polarité épithéliale est observée dans la plupart des cancers d'origine épithéliale. Lors de la polarisation épithéliale, la protéine CRB3 joue un rôle prépondérant. En effet, en absence de CRB3, les cellules épithéliales possèdent une polarité défectueuse et les jonctions cellulaires sont altérées, tel qu'observé lors de la tumorigénèse. De plus, l'augmentation de la prolifération, de même qu'une meilleure survie cellulaire sont également observés lors de la tumorigénèse. Selon notre hypothèse, la perte de la protéine de polarité CRB3, qui permet le maintien du domaine apical, serait capable de favoriser la prolifération et la survie cellulaire. Dans le but de vérifier notre hypothèse, nous avons d'abord généré des lignées cellulaires exprimant myc-CRB3 et un mutant de deletion de myc-CRB3, myc-CRB3[delta]ERLI, et nous avons testé par xénogreffes la tumorigénicité de ces celles-ci. Les résultats obtenus ont montrés la capacité de CRB3 à restreindre la croissance tumorale. Le taux de prolifération a été testé in vitro et a montré que CRB3 est capable de moduler à la baisse le taux de prolifération cellulaire. Pour mieux comprendre comment CRB3 est capable de moduler la prolifération, les voie Wnt, MAPK-ERK1/2 et PI(3)K-AKT, toutes trois connues pour leur rôle dans la prolifération cellulaire, ont été étudiées. Dans un premier temps, l'implication de la voie Wnt a été vérifiée par essais luciférases dans un contexte de surexpression de la protéine CRB3. Les résultats ont montrés que CRB3 est incapable de réprimer la voie Wnt. Dans un deuxième temps, l'activité de la voie MAPK-ERK1/2 a été testée par le niveau de phosphorylation de ERK1/2. CRB3 n'a pas eu d'effet sur cette voie. Finalement, l'activité de la voie PI(3)K-AKT a été testée par le degré de phosphorylation de AKT. Les résultats obtenus à partir d'extraits de tumeurs montrent que l'expression de CRB3 atténue grandement le niveau de phosphorylation de AKT. De plus, l'expression de CRB3 a permis de diminuer le taux de prolifération cellulaire et de sensibiliser les cellules à l'apoptose, deux fonctions cellulaires contrôlées par la voie PI(3)K-AKT. La modulation de cette voie par CRB3 a été confirmée par les résultats obtenus dans des tests de prolifération en présence de LY294002, un inhibiteur de la PI(3)K. Cet inhibiteur a permis de ramener le taux de prolifération de CRB3[Delta]ERLI, la forme dominante négative de CRB3, au niveau de la prolifération des cellules n'exprimant pas myc-CRB3 ou myc-CRB3[delta]ERLI.Dans l'ensemble, les résultats obtenus montrent le rôle potentiel de CRB3 dans la régulation de la prolifération et de la survie cellulaires via la voie PI(3)K-AKT. Ceci amène une compréhension supplémentaire du rôle des régulateurs de la polarité épithéliale dans la suppression de cancers.

L’hypoxie est un processus physiopathologique impliqué dans l’embryogenèse et le développement de maladies cardiovasculaires, mais également dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Au niveau cellulaire, la réponse hypoxique est médiée par une activité transcriptionnelle adaptative hautement régulée via le facteur de transcription induit en hypoxie, HIF-1(Hypoxia inducible factor-1). L’activité de ce facteur de transcription est dépendante de la stabilisation de sa sous-unité HIF-1α en fonction des niveaux d’oxygène. Dans des travaux récents, nous avons identifié un nouveau répresseur de l’expression de HIF-1α, soit la protéine arginine méthyltransférase 1 (PRMT1). En inhibant l’activité des facteurs de transcription Sp1 et Sp3 (Sp1/3) au promoteur de HIF-1α, PRMT1 module la disponibilité de la sous-unité HIF-1α et l’activité du facteur de transcription HIF-1. Dans ces mêmes travaux, nous avons montré que PRMT1 inhibe l’activité de Sp1/3 en empêchant leur phosphorylation via la répression de la voie de signalisation mitogénique MAPK (mitogen-activated protein kinases) composée entre autres des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases) et de la kinase MEK (MAPK/ERK kinase) qui peut elle-même être activée par la kinase PAK1 (p21-activated kinase). Nous avons également identifié le facteur d’échange de nucléotides guanyliques DOCK6 comme partenaire de PRMT1 et comme intermédiaire dans la régulation de la voie MAPK. Le but de cette étude est donc de mieux caractériser le rôle de DOCK6 dans le contrôle de l’expression de HIF-1α et dans la régulation de la voie MAPK modulés par PRMT1. Nos résultats montrent que la méthylation de DOCK6 par PRMT1 inhibe son activité GEF(guanine exchange factor) ce qui résulte en l’inactivation de la signalisation PAK1/MEK/ERK1/2 en aval. De manière intéressante, nos résultats montrent également que l’expression protéique de DOCK6 est modulée en hypoxie de manière HIF-1 dépendante. Enfin, nous montrons queHIF-1α est nécessaire pour l’activation de la voie MAPK en hypoxie. Ces travaux permettent de mieux comprendre le mécanisme de rétrocontrôle régulant les protéines HIF-1, PRMT1, DOCK6 et la voie MAPK. Ce projet souligne ainsi l’importance et la complexité de la régulation du facteur de transcription HIF-1 lors de contextes cellulaires hypoxiques particuliers. / Conditions of low oxygen, or hypoxia, are involved in various pathophysiological situations including cancer and cardiovascular diseases. Hypoxic responses are mediated through a highly regulated transcriptional response in which hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) plays an important role. HIF-1transcriptional activity relies on hypoxia-dependent stabilization of HIF-1α, an essential HIF-1 subunit. In previous work, we identified protein-arginine methyltransferase 1 (PRMT1) as a novel repressor of HIF-1αexpression. By inhibiting the activity of specificity proteins 1 and 3 (Sp1, Sp3; Sp1/3) transcription factors, PRMT1 regulates HIF-1α subunit availability and HIF-1 activity. PRMT1 blocks Sp1/3 activity by preventing phosphorylation through the inhibition of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway. MAPK pathway iscomposed of ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases) and MEK (MAPK/ERK kinase), which can itself be activated by PAK1 (p21-activated kinases). In addition, we identified the guanine nucleotide exchange factor (GEF) DOCK6 as a novel PRMT1 binding partner and as an intermediate for the regulation of MAPK pathway. Therefore, the aim of this study is to better characterize the role of DOCK6 in HIF-1α expression and MAPK regulation. Our results show that DOCK6 is directly methylated by PRMT1. PRMT1 methylation of DOCK6 alters its GEF activity and results in the inactivation of downstream PAK1/MEK/ERK1/2signaling. Interestingly, our results indicate that DOCK6 levels are increased by hypoxia in a HIF-1 dependent manner. Finally, we show that HIF-1αis required for MAPK pathway activation in hypoxic conditions. These studies demonstrate the intricate feedback mechanism that can regulate HIF-1, highlight the complexity of HIF-1 regulation under hypoxic conditions and identify novel targets for potential intervention.

Les cellules s'acclimatent à leur environnement en décodant les signaux extracellulaires et en formant des complexes protéiques spécifiques afin d'entamer une réponse biologique adéquate. Par exemple, la liaison des récepteurs tyrosines kinases (RTK) à leurs ligands extracellulaires active de nombreuses voies de signalisation en créant des sites phosphotyrosines (pTyr) pouvant servir de points d'ancrage pour des protéines cytoplasmiques. Le recrutement de protéines adaptatrices, qui sont constituées uniquement de domaines modulaires médiant des interactions protéiques et qui ne contiennent aucune activité catalytique, au niveau de RTK activés favorise l'assemblage de complexes protéiques spécifiques. La formation de ces complexes permet le réarrangement des réseaux d'interactions protéine-protéine (IPP), ce qui est un processus essentiel pour l'homéostasie cellulaire. Néanmoins, les mécanismes moléculaires permettant la régulation des fonctions des protéines adaptatrices restent peu caractérisés à ce jour. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons identifié une nouvelle boucle d'autorégulation négative existante entre des RTK et des protéines adaptatrices constituées de domaines d'homologie à SRC 3 (SH3). Cette famille de domaines cible des peptides riches en proline et est fréquemment retrouvée dans les protéines impliquées dans la transduction de signaux. Nous avons déterminé que le RTK EPHA4 phosphoryle directement une tyrosine située dans les poches de liaisons des trois domaines SH3 des protéines adaptatrices NCK1 et NCK2, ce qui inhibe leur capacité à interagir avec leurs partenaires protéiques. De plus, nous avons observé que ce résidu tyrosine est conservé à cette position dans plus de la moitié des 300 SH3 humains. Nos résultats suggèrent que plusieurs RTK pourraient phosphoryler des domaines SH3, et donc inhiber la transduction de signaux directement au niveau du récepteur activé à la membrane plasmique. Les modules SH3 représentent une des familles de domaines les plus répandus et médient une proportion importante des IPP des cellules eucaryotes. Les domaines modulaires ciblant des motifs peptidiques précis tels les SH3 possèdent leur propre structure tridimensionnelle qui est supposée être indépendante de leur protéine hôte. Ils sont donc généralement considérés comme étant des modules d'IPP autonome médiant des interactions via leur spécificité intrinsèque. C'est pourquoi de nombreux SH3 ont été étudiés in vitro, isolés de leur protéine hôte, au cours des deux dernières décennies. Cependant, nous ne savons pas si ces domaines sont nécessaires et suffisants pour dicter des IPP dans leur contexte protéique naturel in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons délété systématiquement les domaines SH3 de la levure Saccharomyces cerevisiae dans le but d'identifier les interactions SH3-dépendantes in vivo. Afin de déterminer si les SH3 sont suffisants pour médier des IPP dans des cellules vivantes, nous avons échangé le domaine SH3 de la protéine liant l'actine Abp1 par tous les autres SH3 de la levure ainsi que par ceux de ses orthologues humains. Ces expériences ont mis en évidence que les domaines SH3 dictent rarement des interactions indépendamment de leur protéine hôte. De plus, nous avons observé que les modules SH3 peuvent affecter les IPP de leur protéine hôte, possiblement via des interactions allostériques. Finalement, nous avons déterminé que même le positionnement de ces domaines est critique pour les IPP et les fonctions de leur protéine hôte, par exemple l'endocytose et la séparation de phases, chez la levure et l'humain. Nos travaux démontrent clairement l'importance du contexte protéique des domaines SH3 et que les fonctions de ceux-ci dépendent de leur protéine hôte. Ces résultats améliorent considérablement notre compréhension du fonctionnement des domaines SH3 dans des cellules saines et lors de pathologies. / Cells adapt to their environment by decoding extracellular signals and forming specific protein complexes to initiate the correct biological response. For example, the activation of receptor tyrosine kinases (RTKs) following binding to their extracellular ligands regulates numerous signaling pathways by creating phosphotyrosine (pTyr) sites that can serve as binding motifs for cytoplasmic proteins. The recruitment of adaptor proteins, consisting only of modular protein interaction domains and containing no catalytic activity, at activated RTKs promotes the assembly of specific protein complexes. The formation of these complexes allows the rearrangement of protein-protein interaction (PPI) networks, which is an essential process for homeostasis. However, the molecular mechanisms regulating the functions of adaptor proteins remain poorly characterized. We identified a negative autoregulatory loop existing between RTKs and adaptor proteins containing SRC homology 3 (SH3) domains. This family of modules targets proline-rich peptides and is enriched in proteins involved in signal transduction. We have determined that the RTK EPHA4 directly phosphorylates a tyrosine located in the binding pocket of the three SH3 domains of the adaptor proteins NCK1 and NCK2, and that this inhibits their ability to interact with their protein partners via SH3-dependent associations. In addition, we observed that this tyrosine residue is conserved at this position in more than half of the 300 human SH3s. Our results suggest that several RTKs may phosphorylate SH3 domains, and therefore inhibit signal transduction directly at the sites of activated receptors at the plasma membrane. SH3s modules represent one of the most widespread families of domains and mediate a significant proportion of all PPIs in eukaryotic cells. Modular domains targeting precise peptide motifs such as SH3s have their own three-dimensional structure, which is independent of their host protein. They are therefore generally considered to be autonomous PPI modules mediating interactions via a domain-intrinsic specificity. Based on this, many SH3s have been studied in vitro isolated from their host protein, over the past two decades. However, we still do not know whether these domains are necessary and sufficient to dictate PPIs in their natural protein context in vivo. To answer this question, we systematically deleted SH3 domains of the yeast Saccharomyces cerevisiae to identify SH3-dependent interactions in vivo. In order to determine whether SH3 domains are sufficient to mediate PPIs in living cells, we exchanged the SH3 domain of the actin-binding protein Abp1 with all the other yeast SH3s as well as those of its human orthologs. These experiments demonstrated that SH3 domains rarely dictate interactions independently of their host protein. In addition, we observed that SH3s can affect their host's PPIs according to the domain sequence, possibly via allosteric interactions. Ultimately, we determined that even the positioning of these domains is critical for the PPIs and the functions, for example endocytosis and phase separation, of their host protein in yeast and humans. Our work clearly demonstrates the importance of the protein context of SH3 domains and that their functions depend on their host protein. These results considerably improve our understanding of the functions of SH3 domains in normal cells and in the context of pathologies.

Les prions sont des agrégats amyloïdes infectieux. Le prion [Het-s] de Podospora anserina est un des prions le mieux caractérisé. Le prion [Het-s] est impliqué dans l’incompatibilité végétative – un processus biologique qui a lieu au cours des anastomoses entre des souches génétiquement différentes. Quand une souche [Het-s] fusionne avec une souche exprimant l’allèle alternatif du gène het-s – l’allèle het-S – une réaction de mort cellulaire programmée est déclenchée. Les deux protéines diffèrent de 13 acides aminés et partagent une architecture en deux domaines ; un domaine globulaire en N-terminal nommé HeLo et un domaine PFD (Prion Forming Domain) en C-terminal. Il a été établi qu’en présence des fibres amyloïdes de [Het-s], la protéine HET-S agit en ‘pore-forming’ toxine : la transconformation du PFD de HET-S par les fibres amyloïdes du [Het-s] active le domaine HeLo de HET-S et entraîne la mort cellulaire. Afin de mieux caractériser les propriétés du repliement β-solénoïde du prion [Het-s], nous avons entrepris l’exploration in vivo des relations structure-fonction de ce repliement par une approche d’alanine scanning. Au cours de nos recherches pour des homologues de HET-S/s, nous avons identifié un partenaire fonctionnel de HET-S – une protéine appelée NWD2. NWD2 est une protéine STAND et partage une séquence homologue (3-23) au PFD de HET-S/s. Les protéines STAND, après la reconnaissance d’un ligand, forment des plateformes oligomériques pour transduire le signal. Des analyses génomiques in silico réalisées dans plusieurs génomes fongiques nous ont amené à proposer que la transduction du signal via une protéine STAND à repliement amyloïde est un mécanisme ancien et conservé chez les champignons. Dans ce contexte nous avons identifié deux nouveaux motifs PFD putatifs – σ et PP. En soumettant à l’épreuve notre hypothèse, nous avons d’abord démontré que NWD2 interagit avec HET-S/s en fonction d’un ligand spécifique in vivo et l’interaction est dépendante de la séquence NWD2(3-23) homologue au PFD de HET-S/s. Nous avons ensuite exploré le motif PP associé à un domaine HeLo-like (HELL) dans le génome de Chaetomium globosum. En démontrant la nature amyloïde et prion-like du motif PP ainsi que l’analogie fonctionnelle entre ce motif et le PFD de HET-S/s in vivo nous avons apporté des arguments supplémentaires en faveur de l’implication des repliements amyloïdes dans la transduction du signal chez les champignons filamenteux. / Prions are infectious amyloid aggregates. Podospora anserina’s [Het-s] is one of the best characterized fungal prions with a remarkably high prevalence in wild populations. [Het-s] functions in vegetative incompatibility - a biological process occurring during anastomosis between two genetically incompatible strains. When an [Het-s] prion infected strain fuses with a strain expressing the alternative allelic variant of the het-s locus – het-S – a cell death reaction of the heterokaryon occurs. Differing by 13 amino acids both proteins shares two domain architecture; a globular N-terminal domain called HeLo and a C-terminal Prion Forming Domain (PFD). It has been demonstrated that in presence of [Het-s] amyloid fibers HET-S turns into a pore-forming toxin: transconformation of the HET-S PFD by [Het-s] fibers triggers the refolding of the HET-S HeLo domain, inducing the cell death reaction. In an attempt to better characterize the conserved features of the [Het-s] β-solenoid fold we have used a mutational alanine scanning approach and explored in vivo the existing relations between structure and prion functions of [Het-s]. During our quest for new distant homologues of HET-S/s, we have identified a functional partner of HET-S toxin called NWD2. NWD2 is a STAND protein and shares a homology sequence (3-23) in the HET-S/s PFD. STAND proteins form signal transducing hubs through oligomerization upon ligand recognition. Several in silico analysis in various fungal genomes led us to propose that signal transduction via a STAND protein using an amyloid prion-like fold is a general widespread mechanism in fungi. In that context, we have proposed two novel putative PFD motifs called σ and PP. Testing experimentally our hypothesis, we have first demonstrated that NWD2 interacts with HET-S/s upon ligand recognition in vivo and the interaction is dependant of the NWD2(3-23) region. We have then explored the newly identified putative prion domain PP, associated to a Helo-like domain (termed HELL) from the filamentous fungus Chaetomium globosum. By demonstrating the amyloid, prion-like nature of the PP motif and the functional analogy between PP and HET-S/s PFD domain in vivo, we expose further evidences supporting the implication of amyloid folds in signal transduction in filamentous fungi.