Annuellement, la vie de millions de personnes est bouleversée suite à un diagnostic de cancer. Cette maladie est caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un tissu ou d'un organe au point de menacer la vie du patient. Une multitude de gènes sont connus pour leur implication dans le cancer. Toutefois les protéines régulatrices du cycle cellulaire, les cyclines, sont les principaux responsables du dérèglement cellulaire. Les cyclines D contrôlent l'entrée et la progression de la cellule en phase G1. La découverte d'un site commun d'intégration du rétrovirus murin Graffi en amont du gène de la cycline D2 (D2) a révélé l'existence d'un nouvel isoforme, la cycline D2 tronquée (D2Trc). La D2Trc se distingue par l'utilisation d'un site donneur d'épissage alternatif localisé dans le second intron. Il en résulte un exon 2 allongé et l'apparition d'un codon stop après le 156e acide aminé. Par rapport à la D2, 133 acides aminés sont manquants dont les 21 derniers de la boîte cycline. Les 20 acides aminés terminaux diffèrent de la D2. L'altération de la séquence génère une protéine cytosolique contrairement à la D2 qui est nucléaire. Il a été démontré que la D2Trc détient un pouvoir immortalisant supérieur à la D2. Cette étude vise à identifier les principaux partenaires d'interaction de la D2Trc chez la souris par co-immunoprécipitation. Des fibroblastes de souris (NIH/3T3) ont été transfectés par le vecteur pCMV contenant l'ADNc murin de la D2 ou la D2Trc en phase avec l'épitope Myc à l'extrémité N-terminale. La D2 et la D2Trc ont été co-immunoprécipitées à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'épitope Myc associé à de billes de protéine G sépharose. Les complexes protéiques ont été dissociés de l'anticorps par compétition avec le peptide Myc. Les extraits ont été séparés sur un gel de polyacrylamide puis colorés au nitrate d'argent. Les interactions entre l'anticorps et la forme native de la D2 et la D2Trc ont été observées in situ par colocalisation. Les résultats indiquent que l'anticorps peut se lier à l'étiquette Myc des protéines tant dans la forme native que linéaire, toutefois cette liaison serait faible. Les lavages s'avèrent suffisants pour briser le lien entre la protéine et l'anticorps. L'étiquette serait difficilement accessible dû à une congestion engendrée par les partenaires d'interaction et/ou une nouvelle conformation causée par des interactions entre l'étiquette et la protéine. L'utilisation d'une méthode alternative telle que le double hybride chez la levure ou l'utilisation du vecteur TAP serait à envisager. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Colocalisation, Co-immunoprécipitation, Cycle cellulaire, Cycline D2, Cycline D2 tronquée, Interactions protéine-protéine.

Thèse de doctorat : Biomécanique : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie : Lyon 1 : 2004. / Titre provenant de l'écran titre. 792 Réf. bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [112]-136. Publié aussi en version électronique.

Les récepteurs NMDA sont essentiels à la fonction synaptique. Ils activent diverses cascades de signalisation, dont celle de la calpaïne. Cette protéase peut cliver la sous-unité GluN2B du récepteur NMDA (rNMDA), mais les conséquences d'une telle coupure ne sont pas encore connues. L'objectif de cette étude est de détecter le fragment C-terminal ainsi généré par la calpaϊne et d'étudier ses possibles interactions avec d'autres protéines, telles que la CaMKII, et, par le fait même, son rôle dans la modulation de cascades de signalisation impliquées dans la fonction synaptique. J'ai donc procédé à des études biochimiques par Western Blot sur différentes fractions (nucléaire, cytosolique, densité post-synaptique (PSD), non-PSD) de neurones corticaux en culture âgée de 12 à 15 jours et j'ai observé le clivage de la sous-unité GluN2B en appliquant une stimulation excitotoxique composée de 100µM de glutamate et 10 µM de glycine, qui est reconnue pour activer tous les récepteurs NMDA (synaptique et extrasynaptique) (Papouin et al., 2012). Cette stimulation a généré un fragment de 60 kDa dans la fraction PSD spécifique à la sous-unité GluN2B. J'ai également démontré, par des expériences d'immunoprécipitation, l'interaction de ce fragment C-terminal avec la CaMKII et la PSD95, ce qui n'a jamais été dévoilé par le passé. Enfin, ce fragment pourrait possiblement être en mesure de maintenir l'activité de la CaMKII lors des processus d'excitotoxicité, ce qui engendrerait la mort neuronale et plusieurs pathologies. / NMDA receptors are essential for synaptic function. They activate various signaling cascades, including that of calpain. This protease can cleave the C-terminal tail of the GluN2B subunit of the NMDA receptor (NMDAr), but the consequences of this cleavage, in neuronal functions, is not yet known. The objective of this study is to detect the C-terminal fragment induced by calpain and to study its possible interactions with other proteins, such as CaMKII, and also, its role in the modulation of signaling cascades involved in synaptic function. I therefore performed biochemical studies by Western blot on different fractions (nuclear, cytosolic, postsynaptic density (PSD), non-PSD) of cortical neurons in culture aged 12 to 15 days and observed the cleavage of the GluN2B subunit by applying an excitotoxic stimulation composed of 100 μM glutamate and 10 μM glycine, which is known to activate all NMDA receptors (synaptic and extrasynaptic) (Papouin et al., 2012). This stimulation generated a fragment at 60 kDa in the PSD fraction specific to the GluN2B subunit. I have also demonstrated, through immunoprecipitation experiments, the interactions of this C-terminal fragment with CaMKII and PSD95, which has never been observed in the past. Finally, this fragment could possibly be able to maintain the activity of CaMKII during the excitotoxicity processes and to induce the neuronal death and several pathologies.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est l’une des maladies auto-immunes qui atteint les articulations. Les symptômes principaux de la PR incluent une inflammation chronique de la synoviale dépendante de diverses cytokines et chimiokines inflammatoires, ainsi que de nombreux médiateurs de caractère lipidique, sécrétés par les cellules immunitaires et par les synoviocytes. L’acide lysophosphatidique (LPA) et son enzyme productrice, l’autotaxine (ATX) ont été détectés dans le liquide synovial. Les niveaux des ARNm de deux des six récepteurs du LPA, soit LPA1 et LPA3, sont aussi plus élevés dans les fibroblastes synoviaux des patients PR comparé à ceux d’arthrose ou suite avec une incubation avec le TNFα. Le LPA est aussi reconnu pour sa capacité à induire une production de cytokines et de chimiokines par des synoviocytes de type B (RAFLS) provenant de patients PR, ainsi que dans le modèle murin de poche d’air. D’ailleurs, la pré-incubation avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) in vitro ou bien in vivo rehaussa cette sécrétion de cytokines et de chimiokines induite par la LPA. Dans le cadre de cette étude, nous avons démontré qu’une chimiokine appelée CXCL13 est impliquée dans le recrutement lymphocytaire induit par le LPA après une pré-incubation au TNFα, dans le modèle de poche d’air. Le mécanisme par lequel le LPA peut faire sécréter des cytokines et des chimiokines et par lequel la TNFα peut contribuer à une superproduction de cytokines et de chimiokines dépendante du LPA a aussi été investigué. Nos résultats indiquent que la p38MAPK, la cascade signalétique ERK-MSK-CREB, la Rho kinase, et la PI3K sont toutes des voies de signalisation stimulées par le LPA qui modulent une sécrétion de l’interleukine-8 (IL-8) chez les synoviocytes de type B. En revanche, nous avons remarqué que la sécrétion de l’IL-8 par les synoviocytes stimulés par le LPA devenait insensible aux inhibiteurs des dites kinases lorsque traités au préalable au TNFα. Il n’en demeure pas moins qu’une inhibition simultanée de la p38MAPK et d’ ERK a mené à une diminution efficace de la sécrétion de l’IL-6 et de l’IL-8. Cette étude a permis de mieux comprendre le mécanisme de la réponse inflammatoire déclenchée par le LPA et d’identifier les principales voies de signalisation intracellulaire contribuant à la sécrétion de cytokines et de chimiokines en présence ou en absence de TNFα. Le travail pourrait avoir des retombées majeures en ce qui concerne les stratégies pour développer des drogues ciblant l’axe ATX-LPA et les kinases mentionnées ci-dessus pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. / Rheumatoid Arthritis (RA) is one of the most severe inflammatory arthritides. The main features of RA include chronic inflammation in the synovium mediated by inflammatory cytokines and chemokines as well as lipid mediators, secreted by immune cells and synoviocytes. Lysophosphatidic acid (LPA), a monoacyl phospholipid mediator, and its producing enzyme autotaxin (ATX) were detected in synovial fluid. LPA1 and LPA3 receptor mRNA levels were also higher in synovium from RA patients than from normal individuals. LPA was previously reported to induce cytokine and chemokine production in RA fibroblast-like synoviocytes (RAFLS) and in a mouse air pouch model. In addition, TNFα pretreatment in vivo or in vitro enhanced this cytokine and chemokine secretion induced by LPA. In this study, we demonstrated that an LPA-induced chemokine named CXCL13 is also involved in LPA-induced leukocyte recruitment in the mouse air pouch model after TNFα pretreatment. The mechanism whereby LPA induces cytokine/chemokine secretion and whereby TNFα pretreatment induces cytokine/chemokine super-production mediated by LPA was also investigated in this study. Our data demonstrated that p38MAPK, the ERK-MSK-CREB axis, Rho kinase, and PI3K were all involved in the LPA signaling resulting in IL-8 secretion in RAFLS. However, we found that, after pretreatment with TNFα, LPA-induced IL-8 secretion became insensitive to inhibitors of those kinases mentioned above. Notwithstanding, blocking both the p38MAPK and ERK pathways could effectively decrease IL-8 and IL-6 secretion. This study allowed a deeper understanding of the mechanism of the LPA-induced inflammatory response, including the signal pathways regulating cytokine/chemokine secretion with or without the exacerbating effect of TNFα. The study may have important implications for the development of drugs targeting ATX-LPA axis and the aforementioned signaling pathways for the treatment of RA.

Les épithéliums recouvrent l’ensemble des surfaces et des cavités internes du corps humain. Le fonctionnement des cellules épithéliales repose sur la répartition des constituants cellulaires au sein de compartiments distincts : un compartiment apical, un compartiment latéral, et un compartiment basal : c’est ce que l’on appelle la polarité apico-basale. Plus de 80 % des cancers proviennent d’un dérèglement des cellules épithéliales. De plus, la polarité épithéliale est perdue lors des stades avancés du cancer, suggérant qu’elle contribue activement à la progression tumorale. C’est pourquoi il apparaît crucial de mieux comprendre les mécanismes qui régulent la polarité épithéliale. La polarité est assurée par un ensemble de protéines réparties au sein des différents compartiments et agissant sous forme de modules très dynamiques. Un de ces modules est articulé autour de la protéine CRB3, qui agit comme un déterminant apical essentiel des cellules épithéliales. L’expression de CRB3 est perdue dans de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses en culture, suggérant que CRB3 pourrait détenir des fonctions inhibitrices de certains processus liés à l’avancement tumoral. Cependant, l’impact fonctionnel de la perte de CRB3 dans ces lignées cancéreuses reste encore peu connu, tout comme les mécanismes signalétiques agissant en aval de CRB3. Les travaux présentés dans cette thèse mettent en lumière de nouvelles évidences concernant le rôle fonctionnel de la perte de CRB3 dans différentes lignées cellulaires cancéreuses. Plus précisément, nous montrons que CRB3 détient un rôle signalétique important lui conférant une fonction à la fois dans la morphogenèse épithéliale, mais également dans le maintien de l’intégrité épithéliale. Dans un premier temps, nous montrons que la ré-expression de CRB3 dans des cellules cancéreuses d’origine épithéliale permet le rétablissement d’une morphologie de type épithéliale, en lien avec l’organisation d’un réseau circonférentiel d’acto-myosine. Nous identifions également le sentier signalétique activé en aval de CRB3 et menant à l’activation de la petite GTPase RhoA, nécessaire au remodelage de la morphologie et du réseau d’acto-myosine des cellules cancéreuses. Ce sentier semble notamment jouer un rôle important en aval de CRB3 pour limiter la migration cellulaire. Ensuite, nous montrons que CRB3 contrôle différents sentiers signalétiques, et notamment la voie ERK MAP Kinase, une voie de signalisation fortement dérégulée dans le cancer. Bien que le rôle fonctionnel de cette régulation soit encore inconnu, elle pourrait contribuer à limiter la progression tumorale en aval de CRB3. Enfin, nous montrons que la perte d’expression de Crb3 chez la souris induit une mortalité périnatale associée à des défauts de morphogenèse épithéliale, indiquant que Crb3 est requise pour la viabilité des souris et le développement des structures épithéliales. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes liant la perte de la polarité épithéliale à l’avancement du processus tumoral, et vise à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre le développement de cancers.

La survie d'un individu repose essentiellement sur sa capacité d’adaptation à des conditions de vie en constante évolution. Il existe une grande variabilité entre les individus concernant leur réponse au stress chronique, définissant le concept de résilience. Il s’agit d’un mécanisme d'adaptation actif correspondant à la capacité d'un individu à éviter les conséquences négatives sociales, psychologiques et biologiques d'un stress extrême, qui compromettraient son bien-être psychologique ou physique. Le phénomène est complexe et fait intervenir de nombreuses structures cérébrales et de nombreux neurotransmetteurs. Parmi les systèmes neuropeptidergiques, les opioïdes endogènes, comme les enképhalines (ENKs), seraient des cibles potentiellement impliquées dans ces variations naturelles et pourraient ainsi, être un élément déterminant de la capacité d'adaptation individuelle, au cours de l'exposition au stress chronique. Dans une précédente étude de l’équipe du Dr Guy Drolet, il avait été démontré que les niveaux d'expression de l'ARNm des ENKs étaient diminués dans le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) chez les rats vulnérables après un stress chronique de défaite sociale (SCDS). De plus, l’inhibition des ENKs dans la BLA permettait de reproduire un phénotype de vulnérabilité chez le rat, démontrant ainsi le rôle prépondérant de la circuiterie des ENKs dans le développement de la résilience. Cette thèse a pour objectif principal de comprendre la contribution dans la résilience au stress chronique du circuit des ENKs via les récepteurs opioïdergiques Delta (DOPr), tant au niveau neuroanatomique que fonctionnel. Nous avons, tout d’abord, examiné par hybridation in situ, les niveaux d’expression des ENKs dans la BLA chez la souris après un SCDS : comme chez le rat, les souris vulnérables présentaient une diminution de l’ARNm des ENKs dans la BLA par rapport aux animaux résilients et contrôles. Ce résultat confirme une conservation entre les rongeurs concernant l’implication des ENKs dans la résilience. Par la suite, nous avons évalué les niveaux d’expression de DOPr dans les structures cibles de la BLA. Nous avons spécifiquement ciblé l’hippocampe qui entretient un dialogue privilégié avec l’amygdale dans la réponse au stress et dans lequel, DOPr est fortement exprimé. L’expression de l’ARNm de DOPr était réduite dans la région CA1 de l'hippocampe ventral (CA1-vHPC) chez les souris vulnérables tandis que le niveau était maintenu chez les animaux résilients comme chez les témoins. Afin de disséquer l’importance de la signalisation DOPr dans le développement de la résilience, une activation pharmacologique a été effectuée : l’administration d’un agoniste de DOPr, le SNC80, dans la circulation systémique, a augmenté la proportion de souris résilientes après le SCDS. Dans un second temps, nous avons fait l’hypothèse que le maintien du niveau d’expression de DOPr au niveau du CA1-vHPC permettait de maintenir un statut oxydatif contrôlé dans les neurones, conduisant au phénotype de résilience. En effet, le rôle neuroprotecteur de l’activation de DOPr contre les dommages oxydatifs cellulaires (i.e. stress oxydatif, SO) a été démontré dans différents contextes, notamment chez le rat ischémique. Nous avons ainsi observé des marqueurs du SO - comme les neurones « sombres » ou la dilatation du réticulum endoplasmique - par microscopie électronique à transmission (MET) après un SCDS, avec ou sans traitement au SNC80. Nous avons spécifiquement ciblé les neurones excitateurs et inhibiteurs du CA1-vHPC. Nous avons pu mettre en évidence que le SNC80 diminuait la proportion de certains marqueurs du SO, autant chez les animaux résilients que vulnérables, tandis que pour d’autres marqueurs, il restaurait les dommages oxydatifs induits par le SCDS, uniquement chez les vulnérables. Enfin, une étude ultrastructurelle des mitochondries - comme leur nombre et leur taille - par MET, a confirmé ces résultats où le SNC80 restaure les effets délétères du stress uniquement chez les souris vulnérables. Ces résultats ont permis de démontrer que l’activation de la signalisation DOPr est responsable de la résilience en maintenant un statut oxydatif contrôlé dans les neurones excitateurs et inhibiteurs du CA1-vHPC. Pour finir, une étude moléculaire a été effectuée par western blot, dans l’hippocampe total, afin de déterminer la cible moléculaire de DOPr impliquée dans le SO permettant la résilience. Les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et des enzymes antioxydantes ont été ciblés. L’activation de DOPr a résulté en une diminution de l’expression de certains complexes sans dévoiler la cible moléculaire exacte de DOPr permettant la résilience au stress chronique. Collectivement, ces études proposent un nouveau mécanisme par lequel la signalisation ENK-DOPr permettrait le développement de la résilience au stress chronique en favorisant un état oxydatif contrôlé dans les neurones de l'hippocampe. / The survival of an individual is essentially based on his ability to adapt to ever-changing living conditions. There is a great variability among individuals regarding their response to chronic stress, defining the concept of resilience. Resilience is an active coping mechanism corresponding to an individual's ability to avoid the negative social, psychological and biological consequences of extreme stress that would compromise their psychological or physical well-being. The phenomenon is complex and recruits many brain structures and several neurotransmitters. Among the neuropeptidergic systems, endogenous opioids, such as enkephalins (ENKs), could be potential targets involved in the occurrence of these natural variations and could thus be a crucial determinant of an individual’s capacity to adapt to chronic stress. In a previous study by Dr Guy Drolet's team, ENK mRNA expression levels were shown to be decreased in the nucleus of basolateral amygdala (BLA) in vulnerable rats after chronic social defeat stress (CSDS). In addition, the inhibition of ENKs in the BLA reproduced this vulnerability phenotype in rats, thus demonstrating the preponderant role of the ENK circuitry in the development of resilience. The main objective of this thesis was to investigate the contribution of the ENKs circuit via the Delta opioid receptors (DOPr) in the chronic stress resilience, both at the neuroanatomical and functional levels. We first examined, by in situ hybridization, the expression levels of ENKs in BLA in mice after CSDS: as in rats, susceptible mice showed a decrease in ENK mRNA in BLA compared to resilient and controls animals. This result confirmed the implication of the ENKs in resilience in rodents. Subsequently, we evaluated the expression levels of DOPr in the target structures of the BLA. We specifically targeted the hippocampus, which maintains a privileged dialogue with the amygdala in the response to stress and in which DOPr is strongly expressed. DOPr mRNA expression was reduced in the ventral hippocampal CA1 region (CA1-vHPC) in vulnerable mice while the level was preserved in both resilient and control animals. In order to dissect the importance of DOPr signaling in the development of resilience, pharmacological activation was performed: the administration of a DOPr agonist, SNC80, into the systemic circulation, increased the proportion of resilient mice after the CSDS. In a second step, we hypothesized that the maintenance of DOPr mRNA expression in CA1-vHPC allowed the preservation of a controlled oxidative status in neurons, leading to the phenotype of resilience. Indeed, the neuroprotective role of DOPr activation against cellular oxidative damages (i.e. oxidative stress, OS) was demonstrated in different contexts, particularly in ischemic rats. Thus, we observed markers of OS - such as dark neurons and endoplasmic reticulum dilation - by transmission electron microscopy (TEM) after CSDS, with or without SNC80 treatment. We specifically targeted excitatory and inhibitory neurons of CA1-vHPC. We were able to demonstrate that the SNC80 decreased the proportion of some OS markers in both resilient and vulnerable animals, while for other markers, it restored CSDS-induced oxidative damages only in vulnerable mice. Finally, an ultrastructural study of mitochondria by TEM, confirmed these results where the SNC80 restored the deleterious effects of stress only in vulnerable mice. These results demonstrated that activation of DOPr signaling is responsible for resilience by the preservation of a controlled oxidative status in excitatory and inhibitory neurons of CA1- vHPC. Finally, a molecular study was performed by western blot, in the total hippocampus, to determine the molecular target of DOPr involved in OS, allowing stress resilience. Complexes of the mitochondrial respiratory chain and antioxidant enzymes were measured. The activation of DOPr showed a decrease in the expression of certain complexes without revealing the exact molecular target of DOPr allowing resilience to chronic stress. Overall, these studies propose a novel mechanism by which ENK-DOPr signaling promotes resilience to chronic stress by enhancing a controlled oxidative status in hippocampal neurons.

La protéine mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin), lorsque dérégulée, favorise le développement tumoral par ses fonctions dans la prolifération et la survie cellulaire. Son activité est contrôlée principalement par les facteurs de sa voie d'activation canonique (PTEN/PI3K/AKT) qui sont souvent mutés dans les cancers. Cependant, certains cancers ne présentent pas d'altérations dans cette voie canonique bien que mTOR soit constitutivement active, suggérant ainsi un mécanisme différent. C'est le cas des gliomes de bas grade dont une grande partie présente des mutations hétérozygotes de l'enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH1 et IDH2) menant à un gain de fonction de celles-ci. En effet, l'α-cétoglutarate (αKG) produite par les formes sauvages sera rapidement transformé en 2-Hydroxyglutarate (2HG) par les formes mutées. De plus, ces gliomes présentent très tôt une activité accrue de mTOR et ce, de façon PTEN indépendante. Un criblage par ARN d'interférence ciblant des enzymes αKG dépendantes a permis l'identification de KDM4A, une lysine déméthylase, comme un nouveau régulateur de mTOR. La régulation de KDM4A sur mTOR n'est pas transcriptionnelle, mais semble due à son interaction avec DEPTOR. En effet, sa stabilité, en absence de KDM4A, est grandement diminuée, ce qui favorise l'activité de mTOR. Ainsi, l'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR s'avère être un nouveau mode de régulation de la protéine mTOR. Nous avons également découvert que DEPTOR peut être phosphorylé sur sa tyrosine 289, ce qui favorise l'activité de mTOR. Cette tyrosine, située près de sérines connues pour réguler la dégradation de DEPTOR, permet une meilleure stabilité de la protéine. De plus, la phosphorylation favorise une réorganisation rapide du cytosquelette d'actine par l'activation de mTORC2. Nous avons par la suite montré qu'elle diminue l'affinité de DEPTOR pour mTOR amenant une activation accrue de cette voie. Un criblage avec différents inhibiteurs de tyrosines kinases de même qu'une analyse par spectrométrie de masse nous a permis d'identifier les kinases SYK (Spleen Tyrosine Kinase) et EPHB2 comme régulateurs de la phosphorylation tyrosine de DEPTOR. En effet, nous avons démontré que la phosphorylation de SYK sur DEPTOR était dépendante de l'activation de SYK par EPHB2. En plus de cette phosphorylation tyrosine, DEPTOR possède également de nombreuses autres modifications post-traductionnelles. En effet, il peut être ubiquitinilé par des chaînes d'ubiquitine de type K48 promouvant sa dégradation par le protéasome, mais également par des chaînes d'ubiquitine K63 dont leur fonction est encore inconnue. L'absence de modification post-traductionnelles sur les 5 dernières lysines de DEPTOR augmente drastiquement la phosphorylation de la tyrosine 289 suggérant que la méthylation ou l'ubiquitination affecte cette modification. Nous avons également trouvé que DEPTOR pouvait être NEDDylée dans sa portion N-terminale au niveau de ses domaines DEP. Une analyse de spectrométrie de masse après des expériences de marquage de proximité par biotinilation a permis d'identifier de multiples enzymes pouvant potentiellement moduler ces modifications. Toutes ces modifications ouvrent la porte à de nouvelles avenues de régulation de l'activité de DEPTOR sur mTOR. L'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR de même que la phosphorylation de la tyrosine 289 de DEPTOR se révèlent comme de nouveaux mécanismes régulant l'activité de mTOR pouvant expliquer l'augmentation de l'activité de mTOR dans les cancers où la voie canonique n'est pas affectée. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques qui, combinées à celles déjà existantes, permettra d'offrir des traitements prometteurs lorsque cette voie est dérégulée, notamment dans les gliomes de bas grade. / Dysregulated mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin) is a potent tumor growth inducer known to promote cancer cell proliferation and survival. Its activity can be regulated by numerous factors composing the PTEN/PI3K/AKT canonical pathway, which are often mutated in cancer. However, in a subset of cancer showing a constitutively activated mTOR, there is no alteration within the canonical activation pathway, suggesting different activation mechanisms. Low-grade gliomas harbor mutation on Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1/2) conferring gain-of-function by the production of 2-Hydroxyglutarate (2HG) from α Ketoglutarate (αKG). This leads to a constitutive mTOR activation in a canonical independent manner. An RNAi screen led us to identify KDM4A, a αKG dependant lysine demethylase as a new regulator of mTOR activity. KDM4A interacts with DEPTOR, an endogenous inhibitor of mTOR and member of both mTOR complex. Depletion or inhibition of KDM4A by 2HG decreases DEPTOR stability and thereby increases mTOR activity. We also discovered a new post-translational modification (PTM) on DEPTOR, corresponding to a single phosphorylation event on tyrosine 289. While this modification increases DEPTOR stability, it also promotes its dissociation from mTORC1&2, leading to a rapid and sustain increase in mTORC1&2 activity. To identify the upstream signaling pathway(s) leading to tyrosine 289 phosphorylation, we performed mass spectrometry analysis, as well as a small drug screen of different tyrosine kinase inhibitors. Using these combined methods, we identify SYK (Spleen tyrosine kinase), whose expression levels correlate with levels of tyrosine 289 phosphorylation. We also found that SYK-induced phosphorylation of DEPTOR was regulated by the EPHB2 receptor. We have shown that DEPTOR harbors many other PTM like ubiquitination conjugated on lysine 48 promoting proteasomal degradation and ubiquitination conjugated on lysine 63 whose function is still unknown. The absence of PTM on the last 5 lysines of DEPTOR drastically increases the phosphorylation of tyrosine 289 suggesting that methylation and/or ubiquitination affect this modification. We also found that DEPTOR can be NEDDylated in its N-terminal part on its DEP domains. Mass spectrometry analysis after proximity biotinilation assays led us to discover multiple enzymes that could potentially modulate all these modifications. This open new insight on DEPTOR regulation and function on mTOR. Our findings uncovered new mechanisms regulating DEPTOR activity, which can explain the increased mTOR activity in cancer with unaffected PTEN/PI3K/AKT regulatory pathways. Better understanding of this mTOR/DEPTOR regulatory pathway could allow the development of a new therapeutic approach to inhibit mTOR associated cancer progression.

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes au Canada. La curiethérapie HDR combinée à la radiothérapie externe (EBRT) et l'hormonothérapie (ADT) constitue une excellente approche thérapeutique pour traiter le CaP à risque intermédiaire et élevé. Le traitement par irradiation ciblée (HDR-BT ou EBRT) livre une dose suffisamment élevée de radiations vers les cellules cancéreuses pour les éradiquer en entraînant des cassures dans l'ADN. Ces dommages mènent les cellules à activer les voies de réparation d'ADN. Cependant, lorsque les dommages sont excessifs et irréparables, les cellules arrêtent le processus de réparation. Elles se dirigent vers la mort cellulaire en activant les voies apoptotiques. D'autre part, la suppression androgénique (ADT) peut activer l'apoptose ou la sénescence cellulaire dépendamment de durée de traitement. Il y a donc plusieurs voies de signalisation qui peuvent être possiblement activées à la suite du traitement HDR-BT/ EBRT avec ou sans hormonothérapie (ADT) Le but de ce projet est de comprendre la réponse cellulaire au traitement par HDR/ EBRT, ainsi qu'illustrer l'impact de l'ajout l'ADT sur cette réponse. Notre approche expérimentale consiste à évaluer l'expression et l'activation des marqueurs liés aux dommages et de réparation d'ADN γ-H2AX, DNA-PKcs et la recombinase Rad51, et mesurer aussi l'expression de Ki67 et p53, ainsi que les marqueurs apoptotiques Bax et PUMA, et le marqueur de senescence p16[exposant INK4] dans les biopsies de 22 patients avant, et après traitement avec HDR/ EBRT (avec ou sans ADT) en utilisant les techniques d'immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF). Nos résultats montrent que le traitement par radiations (HDR-BT/ EBRT) a permis d'activer la voie de réparation c-NHEJ. Cependant, cette voie est bloquée probablement à cause de l'activation de l'apoptose. En outre, il a été constaté que l'hormonothérapie additionnelle a induit la sénescence cellulaire après avoir inhibé la voie de réparation c-NHEJ.