Annuellement, la vie de millions de personnes est bouleversée suite à un diagnostic de cancer. Cette maladie est caractérisée par une prolifération cellulaire anormale au sein d'un tissu ou d'un organe au point de menacer la vie du patient. Une multitude de gènes sont connus pour leur implication dans le cancer. Toutefois les protéines régulatrices du cycle cellulaire, les cyclines, sont les principaux responsables du dérèglement cellulaire. Les cyclines D contrôlent l'entrée et la progression de la cellule en phase G1. La découverte d'un site commun d'intégration du rétrovirus murin Graffi en amont du gène de la cycline D2 (D2) a révélé l'existence d'un nouvel isoforme, la cycline D2 tronquée (D2Trc). La D2Trc se distingue par l'utilisation d'un site donneur d'épissage alternatif localisé dans le second intron. Il en résulte un exon 2 allongé et l'apparition d'un codon stop après le 156e acide aminé. Par rapport à la D2, 133 acides aminés sont manquants dont les 21 derniers de la boîte cycline. Les 20 acides aminés terminaux diffèrent de la D2. L'altération de la séquence génère une protéine cytosolique contrairement à la D2 qui est nucléaire. Il a été démontré que la D2Trc détient un pouvoir immortalisant supérieur à la D2. Cette étude vise à identifier les principaux partenaires d'interaction de la D2Trc chez la souris par co-immunoprécipitation. Des fibroblastes de souris (NIH/3T3) ont été transfectés par le vecteur pCMV contenant l'ADNc murin de la D2 ou la D2Trc en phase avec l'épitope Myc à l'extrémité N-terminale. La D2 et la D2Trc ont été co-immunoprécipitées à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'épitope Myc associé à de billes de protéine G sépharose. Les complexes protéiques ont été dissociés de l'anticorps par compétition avec le peptide Myc. Les extraits ont été séparés sur un gel de polyacrylamide puis colorés au nitrate d'argent. Les interactions entre l'anticorps et la forme native de la D2 et la D2Trc ont été observées in situ par colocalisation. Les résultats indiquent que l'anticorps peut se lier à l'étiquette Myc des protéines tant dans la forme native que linéaire, toutefois cette liaison serait faible. Les lavages s'avèrent suffisants pour briser le lien entre la protéine et l'anticorps. L'étiquette serait difficilement accessible dû à une congestion engendrée par les partenaires d'interaction et/ou une nouvelle conformation causée par des interactions entre l'étiquette et la protéine. L'utilisation d'une méthode alternative telle que le double hybride chez la levure ou l'utilisation du vecteur TAP serait à envisager. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Colocalisation, Co-immunoprécipitation, Cycle cellulaire, Cycline D2, Cycline D2 tronquée, Interactions protéine-protéine.

Thèse de doctorat : Biomécanique : Paris 12 : 2004. / Titre provenant de l'écran-titre.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie : Lyon 1 : 2004. / Titre provenant de l'écran titre. 792 Réf. bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [112]-136. Publié aussi en version électronique.

La survie d'un individu repose essentiellement sur sa capacité d’adaptation à des conditions de vie en constante évolution. Il existe une grande variabilité entre les individus concernant leur réponse au stress chronique, définissant le concept de résilience. Il s’agit d’un mécanisme d'adaptation actif correspondant à la capacité d'un individu à éviter les conséquences négatives sociales, psychologiques et biologiques d'un stress extrême, qui compromettraient son bien-être psychologique ou physique. Le phénomène est complexe et fait intervenir de nombreuses structures cérébrales et de nombreux neurotransmetteurs. Parmi les systèmes neuropeptidergiques, les opioïdes endogènes, comme les enképhalines (ENKs), seraient des cibles potentiellement impliquées dans ces variations naturelles et pourraient ainsi, être un élément déterminant de la capacité d'adaptation individuelle, au cours de l'exposition au stress chronique. Dans une précédente étude de l’équipe du Dr Guy Drolet, il avait été démontré que les niveaux d'expression de l'ARNm des ENKs étaient diminués dans le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) chez les rats vulnérables après un stress chronique de défaite sociale (SCDS). De plus, l’inhibition des ENKs dans la BLA permettait de reproduire un phénotype de vulnérabilité chez le rat, démontrant ainsi le rôle prépondérant de la circuiterie des ENKs dans le développement de la résilience. Cette thèse a pour objectif principal de comprendre la contribution dans la résilience au stress chronique du circuit des ENKs via les récepteurs opioïdergiques Delta (DOPr), tant au niveau neuroanatomique que fonctionnel. Nous avons, tout d’abord, examiné par hybridation in situ, les niveaux d’expression des ENKs dans la BLA chez la souris après un SCDS : comme chez le rat, les souris vulnérables présentaient une diminution de l’ARNm des ENKs dans la BLA par rapport aux animaux résilients et contrôles. Ce résultat confirme une conservation entre les rongeurs concernant l’implication des ENKs dans la résilience. Par la suite, nous avons évalué les niveaux d’expression de DOPr dans les structures cibles de la BLA. Nous avons spécifiquement ciblé l’hippocampe qui entretient un dialogue privilégié avec l’amygdale dans la réponse au stress et dans lequel, DOPr est fortement exprimé. L’expression de l’ARNm de DOPr était réduite dans la région CA1 de l'hippocampe ventral (CA1-vHPC) chez les souris vulnérables tandis que le niveau était maintenu chez les animaux résilients comme chez les témoins. Afin de disséquer l’importance de la signalisation DOPr dans le développement de la résilience, une activation pharmacologique a été effectuée : l’administration d’un agoniste de DOPr, le SNC80, dans la circulation systémique, a augmenté la proportion de souris résilientes après le SCDS. Dans un second temps, nous avons fait l’hypothèse que le maintien du niveau d’expression de DOPr au niveau du CA1-vHPC permettait de maintenir un statut oxydatif contrôlé dans les neurones, conduisant au phénotype de résilience. En effet, le rôle neuroprotecteur de l’activation de DOPr contre les dommages oxydatifs cellulaires (i.e. stress oxydatif, SO) a été démontré dans différents contextes, notamment chez le rat ischémique. Nous avons ainsi observé des marqueurs du SO - comme les neurones « sombres » ou la dilatation du réticulum endoplasmique - par microscopie électronique à transmission (MET) après un SCDS, avec ou sans traitement au SNC80. Nous avons spécifiquement ciblé les neurones excitateurs et inhibiteurs du CA1-vHPC. Nous avons pu mettre en évidence que le SNC80 diminuait la proportion de certains marqueurs du SO, autant chez les animaux résilients que vulnérables, tandis que pour d’autres marqueurs, il restaurait les dommages oxydatifs induits par le SCDS, uniquement chez les vulnérables. Enfin, une étude ultrastructurelle des mitochondries - comme leur nombre et leur taille - par MET, a confirmé ces résultats où le SNC80 restaure les effets délétères du stress uniquement chez les souris vulnérables. Ces résultats ont permis de démontrer que l’activation de la signalisation DOPr est responsable de la résilience en maintenant un statut oxydatif contrôlé dans les neurones excitateurs et inhibiteurs du CA1-vHPC. Pour finir, une étude moléculaire a été effectuée par western blot, dans l’hippocampe total, afin de déterminer la cible moléculaire de DOPr impliquée dans le SO permettant la résilience. Les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et des enzymes antioxydantes ont été ciblés. L’activation de DOPr a résulté en une diminution de l’expression de certains complexes sans dévoiler la cible moléculaire exacte de DOPr permettant la résilience au stress chronique. Collectivement, ces études proposent un nouveau mécanisme par lequel la signalisation ENK-DOPr permettrait le développement de la résilience au stress chronique en favorisant un état oxydatif contrôlé dans les neurones de l'hippocampe. / The survival of an individual is essentially based on his ability to adapt to ever-changing living conditions. There is a great variability among individuals regarding their response to chronic stress, defining the concept of resilience. Resilience is an active coping mechanism corresponding to an individual's ability to avoid the negative social, psychological and biological consequences of extreme stress that would compromise their psychological or physical well-being. The phenomenon is complex and recruits many brain structures and several neurotransmitters. Among the neuropeptidergic systems, endogenous opioids, such as enkephalins (ENKs), could be potential targets involved in the occurrence of these natural variations and could thus be a crucial determinant of an individual’s capacity to adapt to chronic stress. In a previous study by Dr Guy Drolet's team, ENK mRNA expression levels were shown to be decreased in the nucleus of basolateral amygdala (BLA) in vulnerable rats after chronic social defeat stress (CSDS). In addition, the inhibition of ENKs in the BLA reproduced this vulnerability phenotype in rats, thus demonstrating the preponderant role of the ENK circuitry in the development of resilience. The main objective of this thesis was to investigate the contribution of the ENKs circuit via the Delta opioid receptors (DOPr) in the chronic stress resilience, both at the neuroanatomical and functional levels. We first examined, by in situ hybridization, the expression levels of ENKs in BLA in mice after CSDS: as in rats, susceptible mice showed a decrease in ENK mRNA in BLA compared to resilient and controls animals. This result confirmed the implication of the ENKs in resilience in rodents. Subsequently, we evaluated the expression levels of DOPr in the target structures of the BLA. We specifically targeted the hippocampus, which maintains a privileged dialogue with the amygdala in the response to stress and in which DOPr is strongly expressed. DOPr mRNA expression was reduced in the ventral hippocampal CA1 region (CA1-vHPC) in vulnerable mice while the level was preserved in both resilient and control animals. In order to dissect the importance of DOPr signaling in the development of resilience, pharmacological activation was performed: the administration of a DOPr agonist, SNC80, into the systemic circulation, increased the proportion of resilient mice after the CSDS. In a second step, we hypothesized that the maintenance of DOPr mRNA expression in CA1-vHPC allowed the preservation of a controlled oxidative status in neurons, leading to the phenotype of resilience. Indeed, the neuroprotective role of DOPr activation against cellular oxidative damages (i.e. oxidative stress, OS) was demonstrated in different contexts, particularly in ischemic rats. Thus, we observed markers of OS - such as dark neurons and endoplasmic reticulum dilation - by transmission electron microscopy (TEM) after CSDS, with or without SNC80 treatment. We specifically targeted excitatory and inhibitory neurons of CA1-vHPC. We were able to demonstrate that the SNC80 decreased the proportion of some OS markers in both resilient and vulnerable animals, while for other markers, it restored CSDS-induced oxidative damages only in vulnerable mice. Finally, an ultrastructural study of mitochondria by TEM, confirmed these results where the SNC80 restored the deleterious effects of stress only in vulnerable mice. These results demonstrated that activation of DOPr signaling is responsible for resilience by the preservation of a controlled oxidative status in excitatory and inhibitory neurons of CA1- vHPC. Finally, a molecular study was performed by western blot, in the total hippocampus, to determine the molecular target of DOPr involved in OS, allowing stress resilience. Complexes of the mitochondrial respiratory chain and antioxidant enzymes were measured. The activation of DOPr showed a decrease in the expression of certain complexes without revealing the exact molecular target of DOPr allowing resilience to chronic stress. Overall, these studies propose a novel mechanism by which ENK-DOPr signaling promotes resilience to chronic stress by enhancing a controlled oxidative status in hippocampal neurons.

Le psoriasis est une maladie cutanée inflammatoire multifactorielle chronique qui affecte 2 à 3 % de la population mondiale. Le mécanisme d'entrée en jeu de la pathologie est encore inconnu. De même, aucun traitement curatif n'existe sur le marché pharmaceutique menant à un rétablissement complet du phénotype des lésions psoriasiques. Certaines voies signalétiques ont été montrées comme étant dérégulées au niveau des kératinocytes de l'épiderme suite à l'infiltration de cellules immunitaires et de cytokines, mais certaines sont encore peu étudiées. L'objectif de ce projet a été d'étudier les trois principales voies de la famille des MAPKS dans la pathologie du psoriasis, soit ERK1/2, JNK et p38, en les inhibant, afin d'en observer les effets soit sur le modèle de peaux psoriasiques 3D reconstruites par génie tissulaire ou sur un modèle de monocouche. Il a été intéressant d'étudier le mécanisme d'action des inhibiteurs aux niveaux cytosolique et nucléaire, au regard du niveau d'expression de différentes protéines et de différents facteurs de transcription. Celles-ci ont été identifiées comme étant surexprimées chez les patients psoriasiques. Des substituts cutanés sains et psoriasiques ont été préparés selon la méthode d'auto-assemblage en présence de cytokines et de différents traitements visant les voies signalétiques ERK 1/2, JNK et p38. Des monocouches ont été préparées dans le but d'obtenir des extraits nucléaires permettant de déterminer le niveau d'activation de certains facteurs de transcription par retard sur gel (EMSA). Des analyses histologiques et protéiques ont été effectuées sur des substituts lésionnels et sains. Les résultats démontrent que le traitement des substituts avec les différents inhibiteurs tend vers un rétablissement partiel du phénotype des lésions psoriasiques vers un phénotype sain suite à une diminution de l'épaisseur de l'épiderme chez les substituts cutanés psoriasiques. La régulation de l'expression de différents marqueurs de prolifération et de différenciation est également observée. Les inhibiteurs introduits en monocouche montrent un rétablissement de l'expression de certains facteurs de transcription potentiellement impliqués dans le psoriasis. En conclusion, une meilleure compréhension des voies signalétiques affectées dans le psoriasis permettra le développement efficace et plus ciblé des traitements envisagés pour soigner cette pathologie. / Psoriasis is a chronic multifactorial inflammatory skin disease that affects 2-3% of the world's population. The mechanism of the onset of the disease is still unknown. Also, no curative treatment exists on the pharmaceutical market that leads to a complete recovery of the psoriatic lesion phenotype. Some signaling pathways have been shown to be deregulated in epidermal keratinocytes following infiltration of immune cells and cytokines, but many are still poorly studied. The objective of this project was to study the three main pathways of the MAPKS family in psoriasis pathology, ERK1/2, JNK and p38, by inhibiting them, to observe their effects on the 3D psoriatic skin model reconstructed by tissue engineering and on a monolayer model. It was interesting to study the mechanism of action of the inhibitors at the cytosolic and nuclear levels, with regard to the expression level of different proteins and transcription factors. These pathways were identified as being overexpressed in psoriatic patients. Healthy and psoriatic skin substitutes were prepared using the self-assembly method in the presence of cytokines and different treatments targeting the s6 ribosomal kinase (RSK) of the ERK 1/2 pathway kinase, JNK and p38. Monolayers were prepared to obtain nuclear extracts to determine the level of activation of certain transcription factors by gel electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Histologic and protein analyses were performed for the study of lesional and healthy substitutes. The results show that treatment of the substitutes with the different inhibitors leads to a tendency of partial recovery of the psoriatic lesion phenotype towards a healthy phenotype following a decrease in epidermal thickness in psoriatic skin substitutes. Variations in the expression of different proliferation and differentiation markers were also observed. Inhibitors introduced in monolayers show a restoration of the expression of some transcription factors potentially involved in psoriasis. In conclusion, a better understanding of the signaling pathways affected in psoriasis will allow for the efficient and more targeted development of treatments envisaged to treat this pathology.

La plupart des mutations qui ont lieu sur la séquence protéique de FUS et qui lie la protéine à la SLA se trouvent dans le signal de localisation nucléaire (NLS), ce qui rend la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d'autres observations, il est suggéré qu'un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l'origine de la neurodégénérescence. Alors que FUS est principalement une protéine nucléaire impliquée dans les processus de transcriptions, il possède également plusieurs fonctions cytoplasmiques. FUS est impliqué dans l'activité traductionnelle. Son rôle dans la traduction n'est pas encore entièrement compris. Il a été rapporté que FUS à la capacité de se lier au polyribosome pour avoir une action répressive sur la synthèse des protéines. La voie de signalisation mTOR impacte l'association de FUS avec les polyribosomes dans des cellules HEK293T. La SLA étant une maladie qui impacte les neurones du système nerveux central, nous voulons savoir si FUS y sera régulé par cette voie de signalisation. Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont connues pour être impliquées dans l'interaction entre les protéines. L'une des hypothèses est que les PTMs et interactions protéines-protéines sont impliqués dans l'association entre FUS et les polyribosomes. Ainsi, l'objectif de mon étude est de déterminer comment la répression de l'activité traductionnelle par les FUS est régulée en étudiant les PTMs, les protéines et les voies de signalisation provoquant l'association de FUS aux polyribosomes. Mes résultats ont montré que la statut phosphorylation de FUS est impliquée dans sa localisation cytoplasmique et est en corrélation avec l'inhibition de la synthèse protéique. De plus, la voie de signalisation mTOR joue un rôle dans la localisation cytoplasmique de FUS en corrélation avec l'inhibition de la synthèse des protéines montrant le rôle de mTOR sur la modulation de FUS face à l'inhibition traductionnelle. De plus, mes résultats ont montré que le rôle de FUS dans la régulation de la traduction dans les régions éloignées telles que les synapses est influencée par la voie de signalisation mTOR. Par conséquent, des composants protéiques de mTOR serait impliqué dans l'association de FUS et son rôle d'inhibiteur traductionnel. / Most of the mutations that take place on the protein sequence of FUS that links the protein to ALS are in the nuclear localization signal (NLS), which makes the protein abnormally abundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it is suggested that a toxic gain-of-function of FUS in the cytoplasm is the cause of neurodegeneration. While FUS is primarily a nuclear protein involved in transcription processes, it also has several cytoplasmic functions. FUS is involved in translational regulation. Its role in translation is not yet fully understood. FUS has been reported to have the ability to bind to the polyribosome to have a repressive action on protein synthesis. The mTOR signaling pathway impacts the association of FUS with polyribosomes in HEK293T cells. Since ALS is a disease that impacts the neurons of the central nervous system, we want to know if FUS will be regulated by thissignaling pathway. Post-translational modifications (PTMs) are known to be involved in the interaction between proteins. One of the hypotheses is that PTMs and protein-protein interactions are coordinating the association between FUS and polyribosomes. Thus, the objective of my study is to determine how the repression of translational activity by FUS is regulated by studying the PTMs, FUS protein interactions and signaling pathways causing the association of FUS with polyribosomes. My results showed that the phosphorylation status of FUS is involved in its cytoplasmic localization. Moreover, the cytoplasmic localization of FUS correlates with inhibition of protein synthesis. Moreover, the mTOR signaling pathway plays a role in the cytoplasmic localization of FUS correlating with the inhibition of protein synthesis showing the role of mTOR on the modulation of FUS to translational inhibition. Furthermore, my results showed that the role of FUS in regulating translation in remote regions such as the synapse is influenced by the mTOR signaling pathway.

La protéine mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin), lorsque dérégulée, favorise le développement tumoral par ses fonctions dans la prolifération et la survie cellulaire. Son activité est contrôlée principalement par les facteurs de sa voie d'activation canonique (PTEN/PI3K/AKT) qui sont souvent mutés dans les cancers. Cependant, certains cancers ne présentent pas d'altérations dans cette voie canonique bien que mTOR soit constitutivement active, suggérant ainsi un mécanisme différent. C'est le cas des gliomes de bas grade dont une grande partie présente des mutations hétérozygotes de l'enzyme Isocitrate déshydrogénase (IDH1 et IDH2) menant à un gain de fonction de celles-ci. En effet, l'α-cétoglutarate (αKG) produite par les formes sauvages sera rapidement transformé en 2-Hydroxyglutarate (2HG) par les formes mutées. De plus, ces gliomes présentent très tôt une activité accrue de mTOR et ce, de façon PTEN indépendante. Un criblage par ARN d'interférence ciblant des enzymes αKG dépendantes a permis l'identification de KDM4A, une lysine déméthylase, comme un nouveau régulateur de mTOR. La régulation de KDM4A sur mTOR n'est pas transcriptionnelle, mais semble due à son interaction avec DEPTOR. En effet, sa stabilité, en absence de KDM4A, est grandement diminuée, ce qui favorise l'activité de mTOR. Ainsi, l'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR s'avère être un nouveau mode de régulation de la protéine mTOR. Nous avons également découvert que DEPTOR peut être phosphorylé sur sa tyrosine 289, ce qui favorise l'activité de mTOR. Cette tyrosine, située près de sérines connues pour réguler la dégradation de DEPTOR, permet une meilleure stabilité de la protéine. De plus, la phosphorylation favorise une réorganisation rapide du cytosquelette d'actine par l'activation de mTORC2. Nous avons par la suite montré qu'elle diminue l'affinité de DEPTOR pour mTOR amenant une activation accrue de cette voie. Un criblage avec différents inhibiteurs de tyrosines kinases de même qu'une analyse par spectrométrie de masse nous a permis d'identifier les kinases SYK (Spleen Tyrosine Kinase) et EPHB2 comme régulateurs de la phosphorylation tyrosine de DEPTOR. En effet, nous avons démontré que la phosphorylation de SYK sur DEPTOR était dépendante de l'activation de SYK par EPHB2. En plus de cette phosphorylation tyrosine, DEPTOR possède également de nombreuses autres modifications post-traductionnelles. En effet, il peut être ubiquitinilé par des chaînes d'ubiquitine de type K48 promouvant sa dégradation par le protéasome, mais également par des chaînes d'ubiquitine K63 dont leur fonction est encore inconnue. L'absence de modification post-traductionnelles sur les 5 dernières lysines de DEPTOR augmente drastiquement la phosphorylation de la tyrosine 289 suggérant que la méthylation ou l'ubiquitination affecte cette modification. Nous avons également trouvé que DEPTOR pouvait être NEDDylée dans sa portion N-terminale au niveau de ses domaines DEP. Une analyse de spectrométrie de masse après des expériences de marquage de proximité par biotinilation a permis d'identifier de multiples enzymes pouvant potentiellement moduler ces modifications. Toutes ces modifications ouvrent la porte à de nouvelles avenues de régulation de l'activité de DEPTOR sur mTOR. L'implication de KDM4A sur l'activité de DEPTOR de même que la phosphorylation de la tyrosine 289 de DEPTOR se révèlent comme de nouveaux mécanismes régulant l'activité de mTOR pouvant expliquer l'augmentation de l'activité de mTOR dans les cancers où la voie canonique n'est pas affectée. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques qui, combinées à celles déjà existantes, permettra d'offrir des traitements prometteurs lorsque cette voie est dérégulée, notamment dans les gliomes de bas grade. / Dysregulated mTOR (mechanistic Target Of Rapamycin) is a potent tumor growth inducer known to promote cancer cell proliferation and survival. Its activity can be regulated by numerous factors composing the PTEN/PI3K/AKT canonical pathway, which are often mutated in cancer. However, in a subset of cancer showing a constitutively activated mTOR, there is no alteration within the canonical activation pathway, suggesting different activation mechanisms. Low-grade gliomas harbor mutation on Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1/2) conferring gain-of-function by the production of 2-Hydroxyglutarate (2HG) from α Ketoglutarate (αKG). This leads to a constitutive mTOR activation in a canonical independent manner. An RNAi screen led us to identify KDM4A, a αKG dependant lysine demethylase as a new regulator of mTOR activity. KDM4A interacts with DEPTOR, an endogenous inhibitor of mTOR and member of both mTOR complex. Depletion or inhibition of KDM4A by 2HG decreases DEPTOR stability and thereby increases mTOR activity. We also discovered a new post-translational modification (PTM) on DEPTOR, corresponding to a single phosphorylation event on tyrosine 289. While this modification increases DEPTOR stability, it also promotes its dissociation from mTORC1&2, leading to a rapid and sustain increase in mTORC1&2 activity. To identify the upstream signaling pathway(s) leading to tyrosine 289 phosphorylation, we performed mass spectrometry analysis, as well as a small drug screen of different tyrosine kinase inhibitors. Using these combined methods, we identify SYK (Spleen tyrosine kinase), whose expression levels correlate with levels of tyrosine 289 phosphorylation. We also found that SYK-induced phosphorylation of DEPTOR was regulated by the EPHB2 receptor. We have shown that DEPTOR harbors many other PTM like ubiquitination conjugated on lysine 48 promoting proteasomal degradation and ubiquitination conjugated on lysine 63 whose function is still unknown. The absence of PTM on the last 5 lysines of DEPTOR drastically increases the phosphorylation of tyrosine 289 suggesting that methylation and/or ubiquitination affect this modification. We also found that DEPTOR can be NEDDylated in its N-terminal part on its DEP domains. Mass spectrometry analysis after proximity biotinilation assays led us to discover multiple enzymes that could potentially modulate all these modifications. This open new insight on DEPTOR regulation and function on mTOR. Our findings uncovered new mechanisms regulating DEPTOR activity, which can explain the increased mTOR activity in cancer with unaffected PTEN/PI3K/AKT regulatory pathways. Better understanding of this mTOR/DEPTOR regulatory pathway could allow the development of a new therapeutic approach to inhibit mTOR associated cancer progression.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 avril 2024) / Dans le cerveau adulte, la voie canonique Wnt est requise pour maintenir les fonctions neurovasculaires, incluant le débit sanguin cérébral (DSC), l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), la stabilité vasculaire, l'activité neuronale, et la réponse immunitaire. Les maladies cérébro-vasculaires et les démences, notamment la maladie d'Alzheimer (MA), sont associées à une altération des fonctions neurovasculaires et à une dérégulation de la voie canonique Wnt. Des découvertes récentes suggèrent que des taux élevés de Dickkopf-1 (DKK1), un inhibiteur endogène de la voie canonique Wnt, corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patients atteints par un accident vasculaire cérébral (AVC) ou la maladie d'Alzheimer (MA). Toutefois, la dynamique de DKK1 et sa contribution à la pathobiologie des AVC et de la MA, ainsi que son potentiel comme cible thérapeutique, restent méconnue. En utilisant un modèle expérimental d'AVC ischémique chez la souris, nous avons trouvé dans la première étude que DKK1 est *de novo* exprimé dans le cerveau lésé, mais absent dans le tissu sain. En utilisant une approche génétique qui permet une induction conditionnelle de DKK1, combinée au remplacement des cellules de la moelle osseuse, nous avons découvert que les cellules immunitaires seraient à l'origine du DKK1 dans le cerveau lésé. L'expression de DKK1 par des cellules immunitaires dérivées de moelle osseuse est suffisante pour déréguler la voie canonique Wnt au site de la lésion, traduit par une réduction de l'expression de la β-caténine. L'induction de DKK1 avant un AVC aggrave le dysfonctionnement et la perte neuronale, et exacerbe les déficits neurologiques. Ceci est associé à la dérégulation de la perfusion sanguine ainsi que la vascularisation du tissu endommagé, et à la désorganisation de la cicatrice astrogliale. L'induction de DKK1 après un AVC entrave le confinement de la lésion, causant une inflammation chronique. Ceci est associé à une infiltration importante des lymphocytes B et à une émergence des comportements de type anxiogène. La neutralisation pharmacologique de DKK1 limite la progression des dommages cérébraux et améliore la récupération neurologique. Dans la deuxième étude, nous avons souligné une désactivation progressive de la voie canonique Wnt dans le cerveau des patients atteints de la MA, traduite par une réduction de l'expression de la β-caténine. Cette désactivation corrèle avec la durée des symptômes et elle est plus importante chez les patients porteurs de l'apolipoprotéine E4 (ApoE4). En utilisant un modèle expérimental appartenant à la forme tardive de la MA, la souris transgénique APP$_\textup{swe}$/PS1, nous avons démontré que la présence de la protéine DKK1 augmente dans le cerveau en présence de la pathologie amyloïde-β (Aβ), associée à une diminution de l'expression de la β-caténine. L'inhibition pharmacologique de DKK1 restore l'activité de la voie canonique Wnt dans le cerveau et atténue la pathologie Aβ, tout en améliorant la mémoire et l'état de vigilance des animaux. Ceci est accompagné par une amélioration de la vascularisation, de l'intégrité de la BHE et de la plasticité synaptique. L'ensemble de nos résultats a permis d'identifier l'origine de DKK1 dans le cerveau lésé et d'élucider son rôle dans la pathobiologie et la thérapie des maladies cérébro-vasculaires et les démences. / In the adult brain, the canonical Wnt pathway is required to maintain neurovascular functions, including cerebral blood flow (CBF), blood-brain barrier (BBB) integrity, vascular stability, neuronal activity, and immune response. Cerebrovascular disease and dementia, notably Alzheimer's disease (AD), are associated with impaired neurovascular function and deregulation of the canonical Wnt pathway. Recent findings suggest that elevated levels of Dickkopf-1 (DKK1), an endogenous inhibitor of the canonical Wnt pathway, correlate with a poor prognosis in patients suffering of stroke or Alzheimer's disease (AD). However, the dynamics of DKK1 and its contribution to the pathobiology of stroke and AD, as well as its potential as a therapeutic target, remain poorly understood. Using an experimental mouse model of ischemic stroke, we found in the first study that DKK1 is *de novo* expressed in injured brain but absent in healthy tissue. Using a genetic approach that allows conditional induction of DKK1, combined with bone marrow cell replacement, we found that immune cells would be the main source of DKK1 in the injured brain. Expression of DKK1 by bone marrow-derived immune cells is sufficient to deregulate the canonical Wnt pathway at the injury site, translated by reduced β-catenin expression. Pre-stroke induction of DKK1 exacerbates neuronal dysfunction and exacerbates neurological deficits. This is associated with deregulation of blood perfusion and vascularization of damaged tissue, and disorganization of the astroglial scar. DKK1 induction after stroke impaired lesion enclosure, causing chronic inflammation. This is associated with extensive B-cell infiltration and the emergence of anxiety-like behaviors. Pharmacological neutralization of DKK1 limits the progression of brain damage and improves neurological recovery. In the second study, we highlighted a progressive deactivation of the canonical Wnt pathway in the brains of AD patients, reflected by a reduction in β-catenin expression. This deactivation correlates with the duration of symptoms and is higher in patients carrying apolipoprotein E4 (ApoE4). Using an experimental model belonging to the late form of AD in APP$_\textup{swe}$/PS1 transgenic mice, we demonstrated that the presence of DKK1 protein increases in the brain in the presence of amyloid-β (Aβ) pathology, associated with a decrease in β-catenin expression. Pharmacological inhibition of DKK1 restores the activity of the canonical Wnt pathway in the brain and attenuates Aβ pathology, while improving the memory and awareness of the animals. This is accompanied by improvements of vascularization, BBB integrity and synaptic plasticity. Taken together, our findings have identified the origin of DKK1 in the damaged brain and elucidated its role in the pathobiology and therapy of cerebrovascular disease and dementia.

Des conditions hypoxiques surviennent lors de situations environnementales et physiologiques spécifiques, ainsi que dans le contexte de diverses pathologies. En raison de la place cruciale de l’oxygène dans les fonctions biologiques vitales, des mécanismes complexes ont évolué afin d’assurer une adaptation cellulaire adéquate à tout stress hypoxique. Cette adaptation est induite par une réponse transcriptionnelle rapide et hautement contrôlée. L’étude des mécanismes impliqués dans cette réponse est essentielle à la compréhension de ses conséquences, notamment dans le cadre de pathologies associées à des conditions hypoxiques, tel que la progression tumorale. Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF ; hypoxia-inducible factors) sont les médiateurs centraux et essentiels à la réponse transcriptionnelle adaptative à l’hypoxie. Ils sont responsables de l’induction de nombreux gènes régulant les processus physiologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires à cette adaptation. HIF-1 et HIF-2 sont les principaux membres de cette famille de facteurs de transcription, partageant des fonctions communes, distinctes et complémentaires. Leur activité dépend de leur sous-unité HIF-α respective, HIF-1α et HIF-2α. Divers mécanismes convergent afin d’assurer une modulation précise des HIF-α en fonction du niveau d’hypoxie et du contexte cellulaire. Ceci implique autant des mécanismes inducteurs que répresseurs, intervenant de manière coordonnée. L’étude de ces mécanismes est donc d’un intérêt considérable pour la compréhension de l’adaptation cellulaire en conditions hypoxiques. Des évidences suggèrent un rôle de la méthylation d’arginines dans la réponse cellulaire à l’hypoxie. Ainsi, cette thèse se penche sur l’implication de l’arginine méthyltransférase PRMT1 dans la régulation des HIF-α. Nous caractérisons PRMT1 en tant que nouveau répresseur de la transcription des gènes HIF1A et HIF2A. Cette répression résulte de l’inhibition des facteurs de transcription Sp1/3, des régulateurs connus de ces gènes. L’étude du mécanisme impliqué nous permet alors de décrire un nouveau rôle de PRMT1 dans la cascade de signalisation ERK. En effet, nous montrons que PRMT1 interagit avec la GEF DOCK6, réprimant ainsi l’activation des kinases ERK1/2 en aval. Ceci a pour conséquence de réduire la phosphorylation et l’activité de Sp1/3. Finalement, nous révélons une dynamique hypoxique intéressante, où une répression temporellement distincte de HIF1A et HIF2A par PRMT1 survient en hypoxie. Ainsi, cette thèse met en lumière un nouveau mécanisme de régulation des HIF-α et souligne l’importance de la répression de leur transcription dans l’adaptation cellulaire à l’hypoxie. Cette thèse contribue ainsi aux connaissances sur le contexte hautement dynamique et complexe de la régulation des facteurs de transcription HIF, des médiateurs essentiels de l’homéostasie cellulaire. / Hypoxic conditions occur under specific environmental et physiological situations, as well as in different pathological contexts. Due to the crucial requirement of oxygen for vital biological functions, complex mechanisms have evolved to ensure adequate cellular adaptation to hypoxic stress. Such adaptation is induced by a rapid and highly controlled transcriptional response. The study of this response is essential for the comprehension of its consequences, particularly in the context of pathologies associated with hypoxic conditions, such as tumor progression. Hypoxia-inducible factors (HIFs), are central and essential mediators of the adaptive transcriptional response to hypoxic stress. They are responsible for the induction of numerous genes regulating the physiological, cellular and molecular processes necessary for this adaptation. HIF-1 and HIF-2 are the main members of this family of transcription factors and share common, as well as distinct and complementary, fonctions. Their activities are dependent on their respective HIF-α subunits, HIF-1α and HIF-2α. Diverse mechanisms converge in order to allow precise modulation of HIF-α subunits in accordance to hypoxic and cellular contexts. This implicates positive as well as negative regulators, acting in a coordinated fashion. The study of these mechanisms is of considerable interest for the comprehension of cellular adaptation to hypoxia. Studies suggest a role for arginine methylation in the hypoxic stress reponse. Therefore, this thesis aims at evaluating the role of the protein arginine methyltransferase PRMT1 in HIF-α regulation. We characterize PRMT1 as a novel repressor of HIF1A and HIF2A gene transcription. This repression is caused by the inhibition of Sp1/3 transcription factors, known HIF1A and HIF2A gene regulators. The investigation of the underlining mechanism allowed us to describe a new role for PRMT1 in the ERK signaling cascade. Indeed, we demonstrate that PRMT1 interacts with the Rho GEF DOCK6, repressing downstream ERK1/2 kinases. This results in reduced Sp1/3 phosphorylation and activity. Finally, we reveal an interesting hypoxia-related dynamic, where a distinct temporal repression of HIF1A and HIF2A occurs under hypoxic conditions. This thesis higlights a new regulatory mechanism of HIF-α subunits and underlines the importance of their transcriptional repression in cellular adaptation to hypoxia. This thesis therefore contributes to the knowlegde surrounding the highly dynamic and complex regulation of HIF transcription factors, essential mediators of cellular homeostasis.