L’épididyme est un organe complexe impliqué dans la maturation des spermatozoïdes et l’acquisition de leur pouvoir fécondant. Il possède plusieurs régions présentant toutes, différents profils d’expression génique. Le gène de la DCXR (Dicarbonyle L-xylulose réductase) retrouvé chez plusieurs espèces est fortement conservé au cours de l’évolution. Il code pour une protéine impliquée dans différents processus biologiques dont la voie métabolique énergétique de dégradation de l’inositol. DCXR est exprimée dans l’épididyme chez certaines espèces étudiées (souris, hamster, singe, humain). Chez l’homme, la protéine présente sur les spermatozoïdes est impliquée dans leur liaison à l’ovocyte et son absence sur les spermatozoïdes a été corrélée avec des cas d’infertilité idiopathique. Nous avons émis l’hypothèse que, d’une part la conservation de la séquence du gène de la DCXR entre les espèces permet un maintien de son rôle dans l’interaction entre les gamètes chez ces différentes espèces. D’autre part, la séquence de la protéine DCXR contient des domaines qui lui confèrent ses différentes fonctions. Nous avons basé nos recherches sur les modèles murin, humain et bovin. La possibilité de quantifier l’infertilité du taureau, en fait un modèle de choix pour l’étude des protéines impliquées dans la fécondation. Nous rapportons ici, l’identification de la DCXR dans l’épididyme de taureau. La protéine bovine est fortement exprimée dans l’épididyme, mais présente des différences d’expression et de localisation par rapport au modèle humain. Nous démontrons, dans l’épididyme, l’expression des gènes des enzymes de la voie de dégradation de l’inositol. L’activité enzymatique xylitol déshydrogénase mesurable en présence de la DCXR recombinante ou du fluide épididymaire, suggère un rôle de la DCXR dans le maintien du bilan énergétique via la voie de dégradation de l’inositol. Par induction de mutations ponctuelles dans la DCXR d’origine humaine nous avons mis en évidence les régions impliquées dans le pouvoir enzymatique de la protéine, mais l’impact sur la propriété de liaison à la zone pellucide de l’ovocyte n’a pas pu être vérifié. De même, l’incidence de la délétion génique de DCXR n’a pu être étudiée. Nos résultats suggèrent une différence dans le rôle de la DCXR en fonction de l’espèce malgré la présence d’une forte homologie de séquence. / The epididymis is a complex organ involved in spermatozoa maturation and acquisition of their fertilization abilities. The epididymis is segmented in different regions with specific gene expression patterns. DCXR gene, found in many species, is highly conserved during the evolution. The DCXR protein is involved in different biological processes of which, the inositol degradation energetic pathway. DCXR is highly expressed in the epididymis of studied species (mouse, hamster, monkey, human). In human, DCXR protein is found on the spermatozoa and is important for the binding of spermatozoa to the oocyte. The lack of this protein has been correlated with idiopathic infertility cases. We hypothesized that the high sequence homology of DCXR between species is associated with functionally conserved properties of the protein in mediating sperm-oocyte binding. We further hypothesized that the DCXR protein sequence contains specific functional domains that permit its multiple biological roles. We used the murine, human and bovine models for our studies. Bovine is a model in which the fertility can be quantified, what makes it interesting for the study of protein involved in fertilization. We report here the identification of DCXR in bull epididymis. The protein is highly expressed in the epididymis but shows expression and localization differences with the human counterpart. In the bovine epididymis, we identify the gene expression of enzymes involved in the inositol degradation metabolic pathway. The recombinant DCXR protein and the epididymis fluids xylitol dehydrogenase enzymatic activity, suggest the involvement of the protein in energy production by means of the inositol degradations pathway. By point mutations induction in the human DCXR, we revealed the protein domains involved in its enzymatic properties. Preliminary experiments did not conclusively demonstrate a role for DCXR during sperm-zona pellucida binding and a pilot test to create a DCXR-null animal model was unsatisfactory. Therefore, future research should focus on elucidating the function of this protein on male reproductive function. All together our results suggest a difference in the role of DCXR depending on the species studied.

Ce travail a consisté en l'étude de protéines de spermatozoïdes de différentes, avec l'objectif de contrôler leur pouvoir fécondant. Dans un premier temps une protéine antioxydante du tractus génital mâle, et acquise au cours de la maturation épididymaire, la glutathion peroxydase 5 (GPX5), a été étudiée dans deux espèces d'intérêt agronomique : l'étalon et le taureau. Les semences de ces animaux sont fréquemment conservées pour des inséminations artificielles. Or lors de la conservation, les spermatozoïdes subissent entre autres un stress oxydant. L'ajout de cette protéine antioxydante dans le milieu de conservation pourrait limiter les dommages subis par les spermatozoïdes. Les séquences spécifiques de cette protéine dans chaque espèce ont été obtenues. Les ARNm ont ensuite été localisés dans les canaux efférents et la tête de l'épididyme équine, ainsi que dans la tête et le corps de l'epididyme bovin. Par ailleurs la protéine bovine a été localisée dans la tête et le corps epididymaire. La seconde partie de ce travail a consisté a analyser les antigènes spermatiques spécifiques d'un rongeur fouisseur , le campagnol terrestre Arvicola terrestris Scherman dans le but de les utiliser pour une immunocontraception de cet animal nuisible. La détermination de protéines spermatiques suscepyibles d'être immunogènes a été entreprise.

Les cils primaires (CP) sont des antennes de signalisation présentes en un seul exemplaire à la surface de la plupart des cellules. Ils jouent un rôle de mécano/chimio-senseur pour le développement et le maintien de l’homéostasie des tissus, en réponse aux stimuli et à la voie de signalisation Hedgehog (Hh). En 2013, l’ultrastructure des CP a été mise en évidence au niveau de l’épithélium épididymaire d’équidés. L’épididyme, organe du système reproducteur masculin, est composé d’un épithélium pseudo-stratifié qui se différencie au cours du développement postnatal jusqu’à la maturité sexuelle. Les principaux types cellulaires qui composent cet organe au stade adulte, assurent des rôles distincts et bien orchestrés afin de contrôler la composition du micro environnement spermatique. Bien que la mutation de gènes codants pour les constituants majeurs des CP entraine une infertilité masculine, peu de choses sont connues concernant leur rôle au niveau du système reproducteur. Nous émettons donc l’hypothèse que les CP de l’épididyme joueraient un rôle dans le contrôle des fonctions épididymaires. Nos objectifs se définissent en deux points 1) la caractérisation spatiotemporelle de cette organelle le long de l’épididyme, 2) l’étude fonctionnelle des CP de l’épididyme dans la voie de signalisation Hh. Grâce à une souris double transgénique Ar13b/mCherry- EGFP/CETN2, nous avons révélé une évolution spatio-temporelle des CP au cours du développement postnatal. En effet, à la naissance, les CP sont localisés au pôle apical des cellules épithéliales alors que chez l’adulte, les CP sont exclusivement associés aux cellules basales cytokératine-V positives. De plus, par une approche pharmacologique nous avons évalué l’implication des CP de l’épididyme murin dans la voie de signalisation Hh. Bien que les fonctions des CP, au niveau de l’épididyme, restent à déterminer, notre étude préliminaire ouvre la porte à une meilleure compréhension du contrôle et maintien des fonctions épididymaires et de la fertilité masculine. / Primary cilia (PC) are signaling antennas present in a single copy on the surface of most cells. They play a mechano / chemo-sensory role for the development and maintenance of tissue homeostasis, in response to extracellular stimuli. In 2013, the ultrastructure of PC was demonstrated in equine epididymal epithelium. The epididymis, an organ of the male reproductive system, is composed of a pseudo-stratified epithelium that differentiates during postnatal development until puberty. The different cell types populating this epithelium control discrete and well-orchestrated role in order to monitor the composition of the spermatic microenvironment. Although the mutation of genes coding for the major constituents of PC leads to male infertility, little is known regarding their role in the male reproductive system. Our hypothesis is that PC play a role in the control of the functions important to epididymis development and homeostasis. Our objectives are defined in two points: 1) to define the spatio-temporal localization of this organelle along the epididymis, and 2) to determine the function of PC in the transduction of the Hh signaling pathway, which is known to be important for proper sperm maturation. Using an Arl13b / mCherry- Cetn2 / GFP transgenic mouse model, we revealed for the first time a spatio-temporal change of PC cell-specificity during epididymis postnatal development, from birth to adulthood. After birth, PC are localized at the apical pole of undifferentiated cells whereas in the adult, elongated PC are exclusively associated with cytokeratin-V positive basal cells. In addition, we evaluated the involvement of epididymal PC in the transduction of the Hh signaling pathway through a pharmacological approach. Although the functions of PC in the epididymis remains to be determined, our preliminary in vitro studies open the door to a better understanding of the control and maintenance of epididymal functions and male fertility.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans la majeure partie des communications intercellulaires. Un grand nombre de RCPG ont été découverts en comparant la séquence des récepteurs connus avec les données fournies par le séquençage du génome humain. Pour plus d'une centaine de ces récepteurs, le ligand activateur ou agoniste est inconnu. Ces récepteurs sont dès lors qualifiés d'orphelins. Les LGR forment une sous-famille de RCPG structurellement proches de la rhodopsine qui comprend les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, hCG, FSH) et à la relaxine. LGR4 est un membre de cette famille dont ni la fonction précise, ni l'agoniste ne sont connus. Dans un premier temps, une cartographie détaillée de l'expression de Lgr4 chez la souris a été obtenue. Nous avons tiré parti de l'existence d'une lignée de souris transgéniques dont le gène Lgr4 a été interrompu par l'introduction d'une cassette comportant deux marqueurs histologiques. L'activité beta-galactosidase d'un de ces marqueurs a été analysée chez les souris hétérozygotes. Ces dernières ne présentent pas de phénotype particulier, ce qui permet d'estimer que l'expression des marqueurs rend effectivement compte de l'expression normale du gène Lgr4. Lgr4 est exprimé dans un grand nombre de structures, notamment dans le cartilage, le rein, les appareils reproducteurs mâle et femelle et certaines cellules du système nerveux. Ensuite, le phénotype des souris homozygotes pour l'inactivation de Lgr4 (LGR4KO) a été exploré. Ces souris présentent à la naissance un poids inférieur à leurs congénères des autres phénotypes. Les mâles sont stériles à cause d'une malformation des tubules efférents et de l'épididyme. Un blocage au niveau des tubules efférents reliant le testicule à l'épididyme contraint les spermatozoïdes à s'accumuler à la sortie du testicule, dans la région du rete testis. De plus, les tubes de l'épididyme, pourtant normaux à la naissance, ne s'allongent pas pour former la structure convolutée habituelle. L'épithélium de ces tubes est aplati et est entouré d'une quantité anormalement élevée de mésenchyme. Dans un troisième temps, des outils nécessaires aux futures tentatives d'identification de l'agoniste naturel de LGR4 ont été réalisés. Il s'agit : (1) d'anticorps monoclonaux dirigés contre la partie extracellulaire du récepteur humain. (2) d'un appât moléculaire pour la ‘pêche au ligand’. Cet appât est constitué du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à un marqueur histologique. (3) d'une construction peptidique constituée du domaine extracellulaire du récepteur humain couplé à une queue poly-histidine. Cette construction est destinée à servir de greffon lors de chromatographies d'affinités devant permettre de purifier le ligand. (4) de lignées cellulaires exprimant le récepteur LGR4 humain ainsi que le système æquorine devant permettre de détecter l'activation de ce récepteur. Les données apportées par ce travail montrent un rôle important du récepteur LGR4 au cours du développement et permettent de circonscrire le champ des recherches futures. Ceci, ainsi que les outils moléculaires développés, constitue une base pour l'identification future de l'agoniste et la détermination précise de la fonction de LGR4.

La maturation épididymaire est un élément clé dans le développement de l'aptitude du gamète mâle à féconder l'ovocyte. Parmi, les nombreux composants impliqués dans ce processus, les espèces oxygénées réactives (EOR) sont essentielles car bénéfiques par certains aspects, cependant elles sont toxiques en excès. GPx5, une forme épididymaire de la glutathion peroxydase, pourrait jouer un rôle dans le contrôle redox de l'environnement spermatique. Une production in vitro de GPx5 par un baculovirus recombinant a été réalisée, mais le virus s'est révélé très instable et n'a donc pas permis d'analyser biochimiquement cette protéine. Une approche in vivo initiée par immunisation passive n'a pas montré d'altération de la fertilité des souris. Elle a été complétée par le dévelopement d'une étude plus générale basée sur la production de souris inactivées pour le gène gpx5. Ces dernières ont une fertilité normale, toutefois, des altérations développementales sont observées dans la descendance de mâles âgés. Des perturbations sont associées à des changements de l'expression de nombreuses enzymes antioxydantes comme les GPxs et la catalase, mais seulement dans la queue de l'épididyme. De plus, un accroissement des dommages oxydatifs à l'ADN est visualisé dans l'épithélium de la queue de l'épididyme et dans les spermatozoïdes de cette région. Une carence en sélénium a été initiée pour contrecarrer une éventuellle compensation fonctionnelle provenant des autres GPx épididymaires. Une initiation des voies apoptotiques est observée chez les animaux KO pour gpx5 et carencés dans la queue de l'épididyme. De façon surprenante, des perturbations redox sont aussi visualisées dans d'autres organes comme le foie et le testicule.

En utilisant des approches moléculaires variées, nous avons montré que le gène gpx5 possède au moins trois transcrits dans l'épididyme de souris adulte. A coté d'un messager long codant pour la protéine GPX5 mature, existent en effet deux transcrits tronqués. Les variants de la protéine GPx5, qui correspondent à ces transcrits courts, subissent dans l'épididyme de souris, une maturation post-transcriptionnelle qui repose essentiellement sur des processus de O-glycosylation. Ce travail a aussi permis de préciser que l'expression du gène gpx5 dépasse le territoire épididymaire puisque les transcrits gpx5 peuvent détectés à des niveaux faibles dans d'autres tissus de la sphère génitale chez la souris adulte. C'est le cas par exemple au niveau du testicule ou de la prostate. L'obtention, par des gestations datées, d'embryons de souris à différents stades, a permis de mettre en évidence une expression du gène gpx5 pendant les phases précoces du développement embryonnaire. Cette expression embryonnaire de gpx5 concerne un quatrième variant dont la séquence 3' UTR n'a pu être précisée. Des analyses immunohistochimiques complémentaires sont nécessaires pour confirmer la détection de la protéine GPx5 dans l'embryon précoce de souris et sa localisation dans l'endoderme pariétal.

Chez les mammifères, l'épithélium épididymaire, via ses activités de sécrétion et de réabsorption, participe à la maturation post-testiculaire des spermatozoïdes en créant un environnement luminal particulier, tout au long du trajet épididymaire. Les études visant à caractériser les activités de sécrétion de cet organe et à analyser la régulation des gènes impliqués, ont été freinées par l'absence de cellules en culture pour cet épithelium très différencié. Malgré de nombreuses tentatives, les systèmes de cellules en culture développés jusqu'à présent ne reflètent pas l'état de différenciation des cellules épididymaires in vivo. En particulier, des gènes, que l'on peut considérer comme des marqueurs terminaux de la différenciation épididymaire, ne sont pas exprimés dans les cellules en culture. gpx5, gène modèle du laboratoire, codant pour une protéine sécrétée de la famille des glutathion peroxydases est un bon exemple de gène épididyme-spécifique, que l'on ne retrouve pas dans les systèmes de cellules en culture disponibles à ce jour. Dans cette étude, nous avons utilisé gpx5, PEA3 et l'indoleamine 2, 3-dioxygénase (IDO) et divers autres gènes, exprimés dans l'épididyme des mammifères, comme indicateurs de l'état de différenciation de lignées cellulaires établies de tête d'épididyme murin. Ces dernières sont issues de cultures primaires, qui se sont naturellement immortalisées par accumulation de mutations aléatoires. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d'optimiser les conditions de culture de ces cellules afin d'améliorer le niveau d'expression de certains gènes épididymaires, en particulier gpx5, pris comme référence.

Seulement 30% des cas d'infertilité masculine peuvent être diagnostiqués grâce à un spermogramme. Comme l'épididyme joue un rôle important dans la maturation posttesticulaire spermatique, le dysfonctionnement de cet organe peut être à l'origine de cas d'infertilité non expliquée. Ainsi, puisque la communication intercellulaire au niveau du tractus reproducteur mâle est différente lorsqu’il y a un problème de fertilité, nous avons émis l’hypothèse qu’une signature moléculaire précise pourrait aider à mieux comprendre et diagnostiquer une plus large population. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle murin génétiquement modifié ayant une délétion conditionnelle (cKO) pour une enzyme impliquée dans la biogenèse des microARNs (miARNs) au niveau proximal de l’épididyme. Nous avons comparé le profil d’expression des miARNs et des gènes au sein de l’épididyme avec un modèle de souris témoin. Cent cinquante-quatre miARNs ont illustrés une forte diminution d’expression chez la souris génétiquement modifiée, dont miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Notons également la variation d’expression des protéines AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) et PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) qui ont particulièrement attiré notre attention, car elles sont directement impliquées dans le pouvoir fécondant masculin. Deuxièmement, comme ces molécules se sont avérées être relarguées dans le milieu extracellulaire, nous avons décidé d’investiguer leur mode de sécrétion dans le liquide épididymaire afin d’évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs pour un certain type d’infertilité masculine. En nous référant aux critères de l’Organisation Mondial de la santé (OMS), j’ai créé une biobanque contenant 43 échantillons humains. J’ai pu mettre également en pratique une méthode plus actuelle d’isolement de vésicules membranaire à partir de fluide séminal. Finalement, j’ai validé l’association de 4 molécules (miR-672, miR- 191 and miR-204 et AZGP1) avec les exosomes. Tous ces résultats suggèrent donc qu’il existe un profil moléculaire associé au phénotype de fertilité et que ces nouvelles molécules extracellulaires pourraient aider à représenter des sous-types d’infertilité masculine. / Only 30% cases of male infertility can be diagnosed with a spermogram. As the epididymis plays an important role in spermatic post-testicular maturation, the dysfunction of this organ may be at the origin of unexplained infertility. Thus, since intercellular communication in the male reproductive tract is different when there is a fertility problem, we hypothesized that a precise molecular signature could help to better understand and diagnose a larger population. To do this, we used a genetically modified murine model with a conditional kockout (cKO) for an enzyme involved in the biogenesis of microRNAs (miRNAs) at the proximal level of the epididymis. We compared the epididymal miRNAs and genes expression pattern between a control and cKO mouse model. One hundred and fifty-four miRNAs showed a strong expression decrease in the genetically modified mice, including miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Note also the variation in expression of the proteins AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) and PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) which have particularly attracted our attention, because they are directly involved in the male fertility. Secondly, since these molecules were found to be released into the extracellular environment, we decided to investigate their secretion pattern in the epididymal fluid in order to evaluate their potential as biomarkers for a certain type of male infertility. Referring to the criteria of the World Health Organization (WHO), I was able to create a biobank containing 43 human samples. I was also able to practice a more current method of isolating membrane vesicles from seminal fluid. Finally, I validated the association of 4 molecules (miR-672, miR-191 and miR-204 and AZGP1) with exosomes. All these results therefore suggest that there is a molecular profile associated with the fertility phenotype and that these new extracellular molecules might help to represent subtypes of male infertility.

Les spermatozoïdes subissent la maturation lors de leur passage dans l'épididyme sous l'influence de plusieurs facteurs et protéines encore méconnus. Le présent projet concerne l'étude des protéines induites par la présence des spermatozoïdes. Pour y arriver, des cellules épithéliales épididymaires immortalisées de souris ont été misent en co-culture pour étudier l'expression des protéines induites. Par ce procédé, une protéine a été identifiée comme étant sécrétée par les cellules épithéliales. La protéine en question est la fibuline-2 qui est exprimée entre autres, dans les membranes basales et au cours du développement embryonnaire. De plus, le transcriptome des cellules en culture a été étudié par macro-array ce qui a permis l'identification de plusieurs ARNm induits par les spermatozoïdes dont le CD49c qui est exprimé dans des conditions similaires à la fibuline2. En résumé, nos résultats semblent indiquer que la présence de spermatozoïdes pourrait effectivement influencer l'expression de gènes ainsi que la synthèse et la sécrétion de protéines par les cellules épididymaires. / When passing through the epididymis, the spermatozoon becomes mature by acquiring forward motility and fertilizing capacity. This maturation process is under influence of several unknown factors and proteins. Experiments were done to study the modification of transcriptom and proteome modulate by spermatozoa. Cell culture was done with epithelial epididymal cell lines which origined from transgenic mice in coculture with mouse spermatozoa. Experiment allows us to find a protein expressed only in co-incubation conditions named fibulin-2 which is found in basement membrane and during embryonic development. Also, study of transcriptom of PC-1 in presence of spermatozoa by Macro-array determines several mRNA induced by spermatozoa such as CD49c. This protein is expressed in same condition that fibulin-2. Together, these results strongly suggest that spermatozoa can modulate gene expression and de novo protein synthesis and secretion of epididymal cell. This novel finding provides new concept and working hypothesis to clarify how testicular factors, such as spermatozoa itself, initiate the activation and differentiation of epididymal epithelium during the sperm maturation process.

La maturation épididymaire est un processus essentiel à l'acquisition du pouvoir fécondant et de la motilité des spermatozoïdes. Ce processus implique, entre autres, l'acquisition de nouvelles protéines dans des structures fonctionnelles spécifiques des spermatozoïdes. Chez le bovin, les protéines P25b et MlF sont acquises au cours du transit épididymaire à partir des vésicules membranaires nommées épididymosomes, sécrétées dans la lumière de l'épididyme. La P25b, impliquée dans la liaison à la zone pellucide, est une protéine GPIancrée localisée dans la région acrosomale de la membrane plasmique du spermatozoïde. MIF est une protéine associée aux fibres denses du flagelle et impliquée dans la motilité du spermatozoïde. Bien que la compartimentation spécifique de ces protéines assure les différentes fonctions des spermatozoïdes, les mécanismes à la base de cette compartimentation sont encore inconnus. Dans différents modèles cellulaires, la compartimentation des protéines de la membrane plasmique est assurée par la formation de domaines rafts enrichis en cholestérol et en sphingolipides. À partir du fait que les rafts sont présents dans les membranes plasmiques des spermatozoïdes, nous avons établi que P25b s'associe et s'accumule dans ces domaines au cours du transit épididymaire. Par contre, les protéines MIF sont toutefois exclues des rafts. Dans les spermatozoïdes éjaculés, P25b se dissocie complètement des rafts mais reste liée à la membrane plasmique. Nous avons déterminé que la dissociation de P25b est causée par une déstabilisation des structures des rafts à la suite d'une perte de cholestérol induite par la protéine NiemannPick C2. Puisque les épididymosomes sont à la fois riches en cholestérol et en sphingolipides et transportent des protéines portant un groupement GPI, nos études ont permis d'établir que les épididymosomes comportent aussi des rafts. La P25b présente dans les rafts des épididymosomes est transférée dans les rafts des spermatozoïdes épididymaires, alors que MIF se retrouve dans le compartiment cytosoluble. L'identification systématique du protéome des épididymosomes révèle la présence de certains membres de la famille des rabs et des SNARE, impliqués dans le traffic et la fusion vésiculaires, et associés aux rafts des spermatozoïdes. L'ensemble de ces résultats suggère que les rafts sont impliqués dans le transfert et la compartimentation des protéines des épididymosomes vers les différentes structures fonctionnelles des spermatozoïdes.