Titre de l'écran-titre (visionné le 5 septembre 2023) / La voie de signalisation Hedgehog est impliquée dans de nombreux processus nécessaires au bon développement et maintien des organes. Elle a lieu par fixation de ses ligands sur un récepteur qui se trouve soit à la surface membranaire des cellules, soit à la surface des cils. Les cils sont des extensions cellulaires, motiles ou non, se trouvant à la surface des cellules. Chez les mammifères, la voie de signalisation Hedgehog a principalement été identifiée à la surface des cils non motiles, appelés cils primaires. En leur sein, de nombreuses protéines, dont des récepteurs, se concentrent, permettant une amplification des différents signaux reçus. Cela permet aux cils primaires d'avoir une fonction d'antenne de signalisation, captant les signaux et les transmettant à la cellule. Bien que les cils primaires soient le lieu privilégié de la voie de signalisation Hedgehog, il a été montré que d'autres types de cils, des cils motiles, étaient également capables de la transduire. En cas de dysfonctionnement de cette voie de signalisation, ou bien des cils en eux-mêmes, plusieurs pathologies peuvent en découler, regroupées sous le nom de ciliopathies. Parmi la multitude de symptômes, des cas d'infertilité masculine sont décrits. Plusieurs études ont montré que cette voie de signalisation existe dans le système reproducteur mâle et femelle, tel dans l'épididyme ou l'endomètre. Dans cette étude, nous avons tenté d'élucider le rôle de la voie de signalisation Hedgehog dans le contrôle de la fertilité mâle de la maturation des spermatozoïdes. Nous avons tout d'abord étudié la voie Hedgehog au sein de l'épididyme. C'est l'organe en charge de la maturation des spermatozoïdes, ils y acquièrent une motilité primaire et d'autres modifications, nécessaires à la fertilité. Dans cet organe, les cellules susceptibles de répondre à la voie Hedgehog sont les cellules basales, car elles sont les seules cellules de l'épithélium à posséder un cil. La première partie de ce projet a été d'étudier le rôle in vitro de la voie de signalisation Hedgehog dans des cellules épididymaires immortalisées. Nous avons pu montrer grâce à ce modèle que la voie de signalisation Hedgehog dépendait bien de la présence du cil primaire. Après traitement pharmacologique, les cellules épithéliales répondent à la voie Hedgehog contrôlant ainsi l'expression de nombreux gènes, régulant la réponse immunitaire et la prolifération cellulaire. Nous avons dans un deuxième temps voulu comprendre in vivo le rôle de la voie Hedgehog, dépendante des cils primaires, dans les cellules basales de l'épididyme. Pour cela, nous avons créé un modèle murin présentant une délétion d'un facteur nécessaire à la voie Hedgehog spécifiquement dans les cellules basales, et comparé son phénotype à celui des souris contrôles. Nous avons pu montrer que la voie Hedgehog permettait de réguler l'homéostasie du tissu et plus particulièrement les propriétés des cellules basales. Ces dernières auraient de multiples fonctions dont le rôle de cellule souche épithéliale. Dans notre modèle, l'ablation d'une protéine ciliaire a empêché la régénération du tissu après dommages (ligation des canaux efférents). La voie Hedgehog pourrait donc être primordiale dans la réponse immunitaire après blessure ou inflammation, en régulant la prolifération cellulaire et la régénération tissulaire. Ces phénomènes pourraient donc avoir un lien indirect avec la maturation des spermatozoïdes dans l'épididyme, et donc dans le contrôle de la fertilité. Dans un troisième temps, nous avons voulu explorer pour la première fois le rôle direct de la voie Hedgehog sur les spermatozoïdes. En effet, ces cellules possèdent pareillement un cil : le flagelle. Nous avons donc posé l'hypothèse que les spermatozoïdes pourraient également être capable d'y répondre. En travaillant avec des spermatozoïdes de trois espèces mammifères différentes, nous avons pu montrer la présence des facteurs de la voie Hedgehog dans les spermatozoïdes. Les spermatozoïdes étaient également capables de répondre à cette voie, induisant un changement dans leur capacitation (motilité ; réaction acrosomique) et dans leur capacité à féconder un ovocyte. La voie Hedgehog pourrait donc avoir également un effet direct sur la maturation des spermatozoïdes. En conclusion, l'ensemble de ces travaux de thèse contribue à une meilleure compréhension du contrôle de la fertilité mâle par la voie Hedgehog et ouvre la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. / The Hedgehog signaling pathway is involved in many processes necessary for the proper development and maintenance of organs. Signalling takes place by binding of ligands to a receptor, which is either on the membrane surface of the cells, or on the surface of a cilium. Cilia are cellular extensions, motile or non-motile, found on the surface of cells. In mammals, the Hedgehog signaling pathway has primarily been identified on the surface of nonmotile cilia, called primary cilia. Within them, many proteins, including receptors, are concentrated, allowing amplification of the various signals received. This allows the primary cilia to act as a signalling antenna, picking up extracellular signals and transmitting them to the cell. Although the primary cilia are the main site of the Hedgehog signaling pathway, it has been shown that other types of cilia, motile cilia, are also able to transduce Hedgehog signalling. In case of dysfunctions of this signaling pathway, or of cilia themselves, several pathologies can result, grouped under the name of ciliopathies. Among the multitude of symptoms, cases of male infertility are described. Several studies have shown that this signaling pathway exists in the male and female reproductive system, such as in the epididymis or the endometrium. In this study, we attempted to elucidate the role of Hedgehog signaling pathway in male fertility and more specifically in the control of sperm maturation. We first studied the Hedgehog pathway within the epididymis. It is the organ in charge of the maturation of spermatozoa, there they acquire primary motility and other changes, necessary for fertility. In this organ, the cells likely to respond to the Hedgehog pathway are the basal cells, because they are the only cells of the epithelium to possess a cilia. The first part of this project was to study the in vitro role of the Hedgehog signaling pathway in immortalized epididymal cells. We were able to show, thanks to this in vitro model, that the Hedgehog signaling pathway did indeed depend on the presence of the primary cilium. After pharmacological treatment, the epithelial cells respond to the Hedgehog pathway thus controlling the expression of many genes, regulating the immune response and cell proliferation. Secondly, we wanted to better understand in vivo the role of the Hedgehog pathway, dependent on primary cilia, in the basal cells of the epididymis. For this, we created a mouse model presenting a deletion of a factor necessary for the Hedgehog pathway specifically in the basal cells and compared it with control mice. We have been able to show that the Hedgehog pathway regulates tissue homeostasis and more particularly the properties of basal cells in the epididymis. Basal cells have multiple functions including the role of epithelial stem cell. In our model, the ablation of a ciliary protein prevented tissue regeneration after efferent duct ligation. The Hedgehog pathway could therefore be essential in the immune response after injury or inflammation, by regulating cell proliferation and tissue regeneration. These phenomena could consequently have an indirect link with the maturation of spermatozoa in the epididymis, and thus in the control of male fertility. Thirdly, we wanted to explore for the first time the direct role of the Hedgehog pathway on spermatozoa. Indeed, these cells also have a cilium, the flagellum, and we therefore hypothesized that they could also be able to respond to it. By working with spermatozoa from three different mammalian species, we were able to show the presence of Hedgehog pathway factors in spermatozoa. Sperm cells were also able to respond to this pathway inducing a change in vitro in their capacitation (motility; acrosomal reaction) and in their ability to fertilize an oocyte. The Hedgehog pathway could therefore also have a direct impact on sperm maturation. In conclusion, this thesis research contributes to a better understanding of the control of male fertility by Hedgehog signalling and could open the way to the identification of new therapeutic targets.

Titre de l'écran-titre (visionné le 7 septembre 2023) / Les cellules épithéliales qui tapissent la lumière de l'épididyme travaillent de manière concertée afin d'établir un microenvironnement propice pour la maturation et le stockage des spermatozoïdes. Nous avons précédemment démontré que l'ATP, qui est sécrétée par les cellules principales de l'épididyme, fait partie d'un réseau de communication extracellulaire qui mène ultimement à la sécrétion de protons par les cellules claires avoisinantes. Le processus d'acidification luminale est nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes dans un état de dormance pendant leur transit dans l'épididyme. Nos travaux visent à étudier la régulation autocrine des cellules principales, en identifiant les transporteurs impliqués dans le processus de sécrétion d'ATP ainsi que leur réponse à l'ATP extracellulaire. Nous avons observé une sécrétion d'ATP constitutive par la lignée de cellules principales épididymaires (DC2) qui était inhibée de façon significative par le Probénécide (PBN), un inhibiteur de la pannexine-1 (PANX-1), et par l'antagoniste de P2X7, A438079. Nous avons aussi confirmé que CFTR est un modulateur de la sécrétion d'ATP. De plus, lorsque les inhibiteurs étaient utilisés en combinaison (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN et CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), aucune inhibition additionnelle de la sécrétion basale d'ATP n'a été détectée, ce qui suggère que PANX-1, P2X7 et CFTR moduleraient un mécanisme commun de sécrétion d'ATP par les cellules DC2. Par ailleurs, l'ajout d'ATPɣS (analogue non-hydrolysable de l'ATP) a induit une augmentation significative des niveaux de calcium intracellulaire (Ca²⁺ᵢ), qui était réduite sans être complètement abolie en absence de calcium dans le milieu extracellulaire. Ces résultats suggèrent une régulation autocrine des cellules principales via l'activation de voies dépendantes du Ca²⁺ᵢ qui impliquerait à la fois les récepteurs P2X et P2Y. Nous procédons actuellement à l'identification des sous-types de récepteurs P2 responsables de l'augmentation du Ca²⁺ᵢ induit par l'ATP dans les cellules DC2. / Epithelial cells lining the epididymis work in a concerted manner to establish an optimal luminal environment for the maturation and storage of spermatozoa. We previously showed that ATP, secreted from principal cells (PCs), is part of a complex extracellular communication network that ultimately leads to activation of neighboring clear cells (CCs). In particular, ATP and its hydrolysis product adenosine stimulate proton secretion by CCs via apical accumulation of the proton pump V-ATPase. Luminal acidification maintains sperm in a quiescent state during their transit in the epididymis. Here we explored the autocrine regulation of PCs by dissecting the transporters involved in ATP secretion, as well as their response to extracellular ATP. Constitutive ATP secretion by the epididymal principal cell line (DC2) was observed, which was significantly inhibited by the pannexin-1 (PANX-1) inhibitor, probenecid (PBN), and the P2X7 antagonist A438079. We also confirmed that CFTR is a modulator of ATP secretion by using the CFTRᵢₙₕ₁₇₂. When inhibitors were applied together (CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + PBN, A438079 + PBN, and CFTRᵢₙₕ₁₇₂ + A438079), no additional inhibition was detected on basal levels of ATP release. Furthermore, our results showed that addition of ATPɣS (non-hydrolysable form of ATP) significantly increased intracellular calcium (Ca²⁺ᵢ) levels, indicating that PCs are regulated in an autocrine manner through ATP signaling. Our results also indicate the participation of both P2X receptors and P2Y receptors subtypes in this response to luminal ATP. Our study suggests that P2X7, PANX-1 and CFTR modulate a common ATP release mechanism in the epididymis, and that ATP participates in PCs autocrine regulation via activation of Ca²⁺⁻dependent pathways. We are currently examining the participation of P2 receptor subtypes in the ATP-induced Ca²⁺ᵢ increase.

Les homéoprotéines sont des régulateurs transcriptionnels impliqués dans le développement, l'embryogenèse et la différenciation cellulaire chez plusieurs espèces. Les homéoprotéines sont les produits des homéogènes et elles sont exprimées dans une pléiade de tissus au cours du développement. Dans le but d'approfondir nos connaissances sur les contrôles transcriptionnels qui régissent le développement et la différenciation des organes reproducteurs, je me suis intéressée à l'expression des homéoprotéines dans les cellules de Leydig dû à l'importance de ces facteurs dans les processus développementaux. Nous avons nouvellement identifiés dans les cellules de Leydig, le gène Lbx2 et l'homéoprotéine PBX1. Il n'existe actuellement pas de données sur l'expression de ces gènes au cours de la différenciation du système reproducteur et ce faisant des cellules de Leydig. Cette thèse présente donc l'expression de Lbx2 et PBX1 au cours de la différenciation du système reproducteur dans le testicule, l'épididyme, l'ovaire et les cellules de Leydig. J'ai précisé le profil d'expression du gène Lbx2 au cours du développement testiculaire, épididymaire et ovarien. J'ai déterminé que les transcrits de Lbx2 sont présents durant le développement du testicule, de l'épididyme et de l'ovaire. De plus, mes analyses révèlent également que Lbx2 est un gène dont l'expression est sexuellement dimorphique dans les gonades embryonnaires. L'élaboration du profil d'expression de la protéine PBX1 révèle qu'elle est présente au cours du développement testiculaire et durant la vie adulte. Dans les cellules de Leydig, mes résultats démontrent que PBX1 est principalement exprimée à la puberté. L'expression de PBX1 est plus forte dans les cellules de Sertoli chez l'adulte et dans les cellules myoïdes péritubulaires au cours du développement embryonnaire et postnatal. Les travaux présents dans cette thèse auront également permis d'identifier d'autres nouvelles homéoprotéines, PRRX2, GBX1, MEIS1, PREP1 exprimées dans les organes reproducteurs. Ainsi, la caractérisation du profil d'expression des homéoprotéines au cours du développement du système reproducteur aura permis d'identifier de potentiels régulateurs transcriptionnels du développement et de la différenciation du système reproducteur.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins. / Infertility can affect as much as 15-20% of couples of reproductive age. Therefore, elucidating mechanisms occurring during fertilization is needed to resolve cases of infertility and optimize assisted reproductive technology procedures. Sperm capacitation is a maturation step that takes place in the female genital tract and is deemed to be essential for sperm to fertilize an oocyte. Our laboratory has demonstrated that proteins from bovine seminal plasma called Binder of SPerm (BSP) proteins bind to choline phospholipids on the sperm membrane upon ejaculation and promote capacitation. These proteins expressed in seminal vesicles are ubiquitous amongst mammals and have been studied in many species including stallion, boar, ram and goat. More recently, the expression of BSP-homologous genes has been discovered in the epididymis of humans (BSPH1) and in mice (Bsph1 and Bsph2). We hypothesized that the BSP homologs in these two species are added to sperm during epididymal maturation and play similar roles in sperm functions as bovine BSP proteins. BSP proteins in humans and mice constitute only a minute percentage of the seminal plasma proteins. Thus, to study their biochemical and functional characteristics recombinant proteins were produced. Recombinant proteins were expressed in Escherichia coli origami B(DE3)pLysS cells using a pET32a expression vector. Following cell lysis, proteins were denatured using urea and purified by immobilized metal ion affinity chromatography. Once bound to the resin, proteins were refolded using a decreasing urea gradient after which they were eluted. This method led to the production of three pure, functional recombinant proteins (human rec-BSPH1, mouse rec-BSPH1 and mouse rec-BSPH2). Using affinity chromatography and co-sedimentation experiments, we were able to demonstrate that all three recombinant proteins bind known ligands of BSP proteins including gelatin, heparin and have the ability to bind to sperm. Studies also revealed that both rec-BSPH1 proteins bind to phosphatidylcholine (PC) liposomes and promote sperm capacitation. However, rec-BSPH2 neither binds to PC liposomes nor stimulates capacitation. Recombinant proteins had no effect on acrosome reaction or sperm motility. In bovine, BSP proteins promote sperm capacitation through interactions with high-density lipoproteins (HDL) and glycosaminoglycans. Since in mice HDL is also a major factor implicated in capacitation, the role of the native murine BSPH1 protein in HDL-induced capacitation was investigated. Results obtained suggest that, in vivo, murine BSPH1 protein could act in capacitation via a direct interaction with HDL. As human and murine BSPH1 are orthologs, these results could possibly also apply to human fertility. The results presented in this thesis could lead to a better understanding of male fertility and help improve assisted reproduction technology procedures. They could also lead to the development of diagnostic tests as well male contraceptives.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l'épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d'espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l'ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l'épididyme parvient à assurer l'équilibre entre un déficit et un excès d'EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L'épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l'activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l'expression génique d'enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d'activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l'ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s'aggravent avec la diminution de l'activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l'ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s'il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d'une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l'un de nos modèles murins mutant.

Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l'épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d'espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l'ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l'épididyme parvient à assurer l'équilibre entre un déficit et un excès d'EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L'épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l'activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l'expression génique d'enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d'activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l'ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s'aggravent avec la diminution de l'activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l'ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s'il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d'une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l'un de nos modèles murins mutant.

Les spermatozoïdes acquièrent leur pouvoir fécondant et leur mobilité lors de leur transit le long de l’épididyme. Paradoxalement, cette maturation épididymaire nécessite la présence d’espèces oxygénées réactives (EOR) pour condenser la chromatine spermatique afin de mieux protéger l’ADN de ces mêmes molécules. Nous avons étudié la façon dont l’épididyme parvient à assurer l’équilibre entre un déficit et un excès d’EOR en caractérisant le phénotype épididymaire de souris dont la production de deux enzymes antioxydantes glutathion peroxydases a été invalidée, GPx5 et snGPx4. L’épididyme de ces souris génère une réponse antioxydante élevée et augmente l’activité de pontage disulfure sur les gamètes en modulant l’expression génique d’enzymes antioxydantes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) et de protéines disulfide isomérases (Pdia). Bien que ce sursaut d’activité soit efficace pour protéger les membranes du tissu et des spermatozoïdes, la chromatine des spermatozoïdes présente un défaut de condensation, laissant l’ADN spermatique vulnérable face aux EOR. Les gamètes présentent alors des dommages oxydants dans le noyau qui s’aggravent avec la diminution de l’activité antioxydante lors du vieillissement. Des approches immunologiques et biochimiques ont montré que les dommages oxydants se produisent préférentiellement sur l’ADN spermatique situé à la périphérie du noyau, qui est enrichi en nucléosomes persistants et qui est associé à la matrice nucléaire. Afin de déterminer s’il est possible de diminuer ces atteintes oxydantes sur les gamètes, nous avons étudié les effets d’une supplémentation orale antioxydante sur des souris sauvages et sur l’un de nos modèles murins mutant. / The spermatozoa acquire their fertilizing ability and their motility through the epididymis. Paradoxically, this epididymal maturation needs reactive oxygen species (ROS) to condense the sperm chromatin permitting to protect the DNA against these molecules. We studied how the epididymis ensure the equilibrium between deficit and excess of ROS by characterizing the epididymal phenotype of mice lacking two antioxidant activities of the glutathione peroxidase family, GPx5 & snGPx4. The epididymis of these mice produce a strong antioxidant response and also increase the disulfide bridging activity by adjusting the gene expression of antioxidant enzymes (Trx, Prx, GST, SOD3, catalase) and disulfide isomerase proteins (Pdia). This protection is efficient for tissue and sperm membranes but not for sperm chromatin which is susceptible to decondensation. The sperm cells show oxidative damage in the nucleus, which worsen with the decrease of the antioxidant activity upon aging. Immunological and biochemical approaches indicated that oxidative damage occurred only on the sperm DNA at the periphery of the nucleus, which is enriched with persisting nucleosomes and associated to the nuclear matrix. Finally, to determine if these oxidative damages on the spermatozoa can be lowered, we studied the effects of an oral antioxidant supplement on wild type and gpx5-/- mice (Chabory et al., 2009).

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