Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La régénération musculaire implique des interactions fonctionnelles entre différents types de cellules mononucléées. Parmi elles, citons les progéniteurs myogéniques (MPs), qui fusionnent pour générer de nouvelles myofibres en réponse à une blessure, et les cellules immunitaires qui envahissent les muscles endommagés. Des dépôts transitoires fibrotiques et d’adipocytes sont observés dans les muscles en régénération qui cependant persistent dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et au cours du vieillissement. Nous avons démontré que les progéniteurs fibro-adipogéniques (FAPs) exprimant le marqueur de surface PDGFRα, contribueraient au développement des dépôts non myogéniques dans les muscles sains. En effet, ces progéniteurs se différencient en adipocytes blancs fonctionnels, bien qu’étant insensibles à l’insuline, et génèrent des myofibroblastes. Quant à la fibrose des muscles DMD, elle se formerait à partir de la différenciation à la fois des MPs et des FAPs. Dans les muscles sains, les FAPs stimulent la myogenèse des MPs au cours de la régénération, alors que les myotubes et les macrophages pro-inflammatoires inhibent l’adipogenèse et la fibrogenèse des FAPs. Pour les progéniteurs âgés ou dystrophiques, les interactions cellulaires entre les FAPs et les MPs sont perturbées. De manière intéressante, la régulation des FAPs DMD ou âgés peut être restaurée en remplaçant les MPs DMD ou âgés par des MPs jeunes et sains. Nos résultats montrent que les muscles humains contiennent des progéniteurs fibro-adipogéniques qui jouent un rôle central dans la régulation de l’homéostasie musculaire en interagissant avec les progéniteurs myogéniques et les macrophages / Muscle regeneration involves functional interactions between different types of mononuclear cells including myogenic progenitors (MPs) and macrophages. Following injury, damaged muscles are invaded by immune cells and MPs fuse to generate new myofibres. Transient fibrotic and adipocyte deposits are observed in regenerating muscles, which however persist in Duchenne muscular dystrophy (DMD) and during aging. We demonstrated that fibro-adipogenic progenitors (FAPs) expressing the PDGFRα surface marker would contribute to the development of non-myogenic deposits in healthy muscles. Indeed, these progenitors differentiate into functional white adipocytes that have the feature to be insulino-resistant, and give rise to myofibroblastes. Intramuscular fibrosis in DMD patients could be formed from both FAPs and MPs differentiation. In healthy muscles, FAPs stimulate myogenesis of MPs during regeneration, while myotubes and pro-inflammatory macrophages inhibit the adipogenesis and fibrogenesis of FAPs. Cellular interactions between FAPs and MPs are disrupted for DMD or aged progenitors. Interestingly, they are restored if aged or DMD FAPs are replaced by healthy and young MPs. Our results show that the human muscles contain fibro-adipogenic progenitors that play a crucial role in the control of muscle homeostasis by interacting with myogenic progenitors and macrophages

Les concentrations d’oxygène (O2) dans la moelle osseuse hématopoïétique, sont très inférieures à celle de l’air (20% d’O2) puisqu’elles vont de 4% dans les zones juxta-vasculaires à 0,1% près de l’endoste, où siègent les cellules souches hématopoïétiques (CSH), essentiellement quiescentes. Ce paramètre physiologique, rarement pris en compte, est un élément important dans la régulation de l’hématopoïèse. Les effets bénéfiques des faibles concentrations d’oxygène sur le maintien des cellules souches hématopoïétiques sont maintenant bien établis. Par contre, la réponse du compartiment des progéniteurs aux faibles concentrations d’oxygène est moins examinée mais très discutée, certains montrant une différenciation associée à un blocage de la prolifération alors que d’autres montrent leur disparition de la culture probablement par apoptose. C’est dans ce contexte que se place ces travaux qui visent à approfondir les effets des faibles concentrations en oxygène (de 3 à 0,1%) sur ce compartiment. La culture pendant 72h à 0,1% O2 de la lignée murine de progéniteurs hématopoïétiques non leucémiques FDCP-Mix entraîne leur arrêt progressif en quiescence (Ki-67 négatif) de ces cellules sans induction d’apoptose. Cet arrêt est associé à la différenciation granulocytaire d’une majorité de la population. Dans ces mêmes conditions de culture persiste une population restreinte de cellules qui s¹auto-renouvellent lentement et qui sont capables après repiquage en culture à 20% d’O2 de repeupler une culture liquide et de former des colonies en milieu semi-solide. Ces changements fonctionnels sont associés aux modifications de protéines du cycle cellulaire impliquées dans la quiescence cellulaire : p27KIP1, pRb et CDK. Cette caractérisation permet désormais d’utiliser cette lignée comme modèle pour l’étude des équilibres fondamentaux au maintien de l’homéostasie hématopoïétique. / Oxygen concentrations (O2) in hematopoietic bone marrow vary from 4% in capillaries to less than 0.1% in subendosteum, where hematopoietic where mostly quiescent stem cells reside. This physiological factor, rarely investigated, is an essential piece of hematopoiesis regulation. The beneficial effects of low oxygen concentrations on the maintenance of hematopoietic stem cells are now well established. In contrast, the effects of low O2 concentration on the progenitors compartment, were much less explored and are then more controversial: some articles evidence a pro-differentiative effect related to a cell proliferation blockade while others observe their rapid disappearance from cultures probably due to apoptosis. In this particular context takes place this work which aims to investigate the low oxygen concentration effect (from 3% to 0.1%) on this precise compartment. Culture of the murine non-leukemic hematopoietic progenitor cell line FDCP-Mix line at 0.1% O2 during 72h induces a progressive G0 quiescence blockade (Ki-67 negative) without apoptosis increase. This G0 cell cycle arrest is correlated with the granulo-monocytic differentiation of most cells. In the mean time a minor population of self-renewing cells continues to cycle slowly as evidenced by their 5-FU sensitivity in primary culture and by their capacity to give rise to colonies and to repopulate liquid cultures when replated in cultures at 20% O2. G0 quiescence and granulocytic differentiation induced by low O2 concentrations is associated with cell cycle protein modifications: p27KIP1, pRb, CDK. This characterization allows FDCP-Mix usage as model to investigate fundamental balances responsible for hematopoietic long-term maintenance.

Pour maintenir l'architecture du tissue, les cellules épithéliales se divisent de manière planaire, perpendiculaire à leur axe principal de polarité. Du fait que le centrosome retrouve sa localisation apicale à l'interphase l'orientation du fuseau mitotique est réinitialisée à chaque cycle cellulaire. Nous utilisons de l'imagerie live en trois dimensions de centrosome marqués en GFP pour investiguer la dynamique de l'orientation du fuseau mitotique des cellules neuroépithéliales de l'embryon de poulet. Le fuseau mitotique présente des mouvements stéréotypiques pendant la métaphase, avec dans un premier temps une phase active de d'orientation planaire suivie par une phase de maintenance planaire jusqu'à l'anaphase. Nous décrivons la localisation des protéines NuMA et LGN formant un anneau au niveau du cortex latéral cellulaire au moment de l'orientation du fuseau. Enfin, nous montrons que le complexe protéique formé par LGN, NuMA et par la sous unité Gai localisé au cortex est nécessaire pour les mouvements du fuseau et pour réguler la dynamique de l'orientation du fuseau. La localisation restreinte de LGN et NuMA en anneau cortical est instructive pour l'alignement planaire du fuseau mitotique et est également requise pour sa maintenance planaire. / To maintain tissue architecture, epithelial cells divide in a planar fashion, perpendicular to their main polarity axis. As the centrosome resumes an apical localization in interphase, planar spindle orientation is reset at each cell cycle. We used three-dimensional live imaging of GFP-labeled centrosomes to investigate the dynamics of spindle orientation in chick neuroepithelial cells. The mitotic spindle displays stereotypic movements during metaphase, with an active phase of planar orientation and a subsequent phase of planar maintenance before anaphase. We describe the localization of the NuMA and LGN proteins in a belt at the lateral cell cortex during spindle orientation. Finally, we show that the complex formed of LGN, NuMA, and of cortically located Gái subunits is necessary for spindle movements and regulates the dynamics of spindle orientation. The restricted localization of LGN and NuMA in the lateral belt is instructive for the planar alignment of the mitotic spindle, and required for its planar maintenance.

La peau est un organe très exposé à l’environnement et fournit la première ligne de défense contre de nombreux pathogènes. Cette fonction est remplie dans l’épiderme murin par les cellules de Langerhans (LCs) et les cellules T dendritiques de l’épiderme (DETCs). Alors que le développement de ces cellules a bien été étudié, peu d’expériences ont été effectuées sur leur renouvellement en condition homéostatique chez des animaux adultes sans manipulations. Nous avons alors développé un système de traçage cellulaire par fluorescence multicolore pour étudier l’homéostasie des LCs et des DETCs. Cette approche de «fate mapping» m’a permis de mettre en évidence un modèle dans lequel le réseau adulte des LCs est formé d’unités prolifératives adjacentes composées de LCs en division et leurs cellules filles. Nous avons identifié que les cellules en division étaient majoritairement représentées par la fraction la plus immature des LCs, suggérant que ces LCs peuvent régénérer leur réseau grâce à une capacité de prolifération limitée. Lors d’une inflammation importante, les LCs sont renouvelées par des progéniteurs issus de la moelle osseuse et s’organisent également en unités de prolifération. Je me suis ensuite intéressé à l’homéostasie des DETCs. Ce réseau est formé de la même manière par des unités prolifératives de DETCs. Un modèle de greffe de peau nous a permis de montrer que les DETCs semblent renouveler les cellules disparues dans une zone restreinte. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de révéler les dynamiques cellulaires qui régissent l’homéostasie des cellules immunitaires de l’épiderme. / The skin is an organ very much exposed to the environment and supplies the primary line of defence against several pathogens. In the mouse model epidermis, this function is fulfilled by Langerhans’ cells (LCs) and dendritic T cells (DETCs). While LCs and DETCs development have thoroughly been studied, few experiences have been carried out concerning the renewal of these cells through homeostatic conditions in adult “nonmanipulated” animals. Then we have designed a new system of fate mapping, by way of multi-coloured fluorescence to study the LCs and DETCs homeostasis. This method of fate mapping allowed me to highlight a model in which the adult network of LCs is made up of adjacent proliferating units, made of dividing LCs and of their daughter cells. We have identified that the dividing cells were mainly represented by the most immature fraction of LCs, suggesting that these LCs can renew their network thanks to a limited ability to proliferate. During significant inflammation, LCs are renewed by progenitors coming from the bone marrow and organize themselves in proliferation units as well. I also took an interest in the homeostasis of DETCs. In the same way as for the LCs, this network seems to be made up of DETCs proliferating units. A model of skin graft led us to show that the DETCs seem to renew the missing cells in a restricted area. As a conclusion, my research work allowed me to reveal the cellular dynamism which governs the homeostasis of the epidermis’ immune cells.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par une atteinte progressive et chronique des vaisseaux pulmonaires entraînant une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires. Mes travaux de doctorat ont eu pour but de comprendre l'implication des progéniteurs vasculaires dans le remodelage et dans la néomuscularisation des vaisseaux pulmonaires, caractéristique de l'HTAP. Une nouvelle population de cellules progénitrices positives pour le marqueur PW1, récemment identifiée dans les tissus adultes, a la capacité de se différencier en cellules musculaires lisses (CMLs). Notre hypothèse a donc été que cette population progénitrice pourrait être recrutée, se différencierait en CMLs et participerait ainsi au remodelage vasculaire au cours de l'HTAP. Nous avons mis en évidence la présence de trois populations progénitrices PW1+ dans le poumon de souris, capables de se différencier en CMLs vasculaires. Les cellules PW1+ sont résidentes et sont mobilisées dans 2 modèles d'HTAP; leur recrutement est précoce, dès 4j d'hypoxie chronique chez la souris ; le nombre de cellules PW1+ est augmenté chez le rat traité à la monocrotaline. Des résultats préliminaires suggèrent une implication des macrophages et de la voie CXCR4 dans ce recrutement des progéniteurs PW1+. Chez le patient HTAP, les cellules PW1+ sont très nombreuses dans les lésions artérielles et nous avons commencé à les isoler par FACS. Cette meilleure compréhension des mécanismes de mobilisation des progéniteurs vasculaires permet d'identifier des pistes thérapeutiques potentielles, et d'encourager à poursuivre les recherches sur ce versant cellulaire encore peu exploité dans cette maladie. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by vascular remodeling and neomuscularization. PW1+ progenitor cells were identified in various adult tissues and can differentiate in smooth muscle cells (SMC) in vitro. Our hypothesis was that PW1+ progenitor cells are recruited to participate in the vascular remodeling during PAH. PW1+ cells are localized in the lung parenchyma and in the perivascular zone in rodent and human lungs. Three resident myogenic PW1+ populations were identified in the mouse lung. After 4 days of CH, two of these PW1+ populations were significantly increased. The number of pulmonary proliferating PW1+ cells and the proportion of vessel-associated SMC derived from PW1+ cells were also significantly increased, attesting a recruitment and a differentiation of PW1+ cells into pulmonary vascular SMC during early chronic hypoxia-induced neomuscularization. Moreover, in the MCT-injected rat lungs, a severe PH model, the number of PW1+ cells was also increased. Preliminary data suggest that macrophages and CXCR4 axis are involved in the mobilization of PW1+ progenitor cells. In the human PAH lung, PW1+ cells were observed in remodeled vascular structures and seem increased as compared to control lung. A better understanding of vascular progenitor cells mobilization mechanisms will help determining the pathological pathways involved in the disease and identifying new potential therapeutic avenues.

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives. / Vertebrate eye developement is the result of multiple perfectly executed biological process. This tight orchestration is principaly controled by transcription factors. Homeobox-containing transcription factors are expressed in the presumptive eye field and are required to initiate eye development and for final retinal cell differenciation. The genetic control of these transcription factors are poorly understood. We analysed Six6’s nearby genomic sequence to caracterise potential promoter regions. Chromatin immunoprecipitations and luciferase assays confirmed the binding and the in vitro synergic trans-activation of Six6 potential promoter by Lhx2 and Pax6. This study also demonstrate the contribution of Lhx2 for the establishment of presumptive retina field at the neural plate stage. The detailed knowledge of genetic networks regulating the formation of a fonctional retina by retinal progenitor is crucial. Indeed, when these mecanisms will be eluciated, we will be able to establish regenerative retinal cell therapy.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L'autorenouvellement est une propriété fondatrice du concept de cellule souche. Cependant, malgré l'avancée des connaissances actuelles, les mécanismes moléculaires sous-jacents restent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés à cette question, en étudiant l'équilibre entre autorenouvellement et différenciation dans des progéniteurs érythrocytaires primaires. D'une part, grâce à une étude combinant des approches pharmacologiques et de génétique fonctionnelle, nos résultats montrent que le contrôle de la synthèse cellulaire du cholestérol joue un rôle essentiel dans la régulation du basculement de l'autorenouvellement vers la différenciation. D'autre part, nous avons étudié la nature stochastique de l'expression génique au cours du passage de l'autorenouvellement vers la différenciation. En effet, contrairement au caractère déterministe initialement attribué à l'expression des gènes, les données accumulées au cours des dernières années démontrent que cette expression repose sur des processus stochastiques. Nous avons en particulier oeuvré à la conception et à la mise en place d'un dispositif permettant de suivre en temps réel l'expression génique dans des cellules individualisées, afin de pouvoir mesurer et évaluer cette stochasticité. Au final, l'ensemble de ces travaux participent à la compréhension des bases moléculaires de l'autorenouvellement et du contrôle des choix du devenir cellulaire.