Untersuchungen zum Kerntransport in Progeriezellen und neue Möglichkeiten der Quantifizierung nukleärer Transportprozesse / Nuclear transport in progeria cells and new possibilities to quantify nuclear transport

Zur Charakterisierung nukleärer Proteinexportvorgänge wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal ein System heterodimerisierender Fusionsproteine auf Basis des kommerziell verfügbaren ARGENT™ Regulated Heterodimerization Kit 2.0 von ARIAD verwendet. Die Expressionsvektoren wurden so verändert, dass ein CRM1 – vermittelter Proteinexport über die Zellkernhülle mittels Fluoreszenzmikroskopie in HeLa – Zellen und humanen Fibroblasten live oder nach Fixation dargestellt werden konnte. Der Export folgte in HeLa – zellen einer exponentiellen Kinetik, FN/C – Bestimmungen zwischen Wildtyp – und RD (Restriktive Dermopathie) – Fibroblasten ergaben keinen Unterschied im Proteinexport. Eine Inhibition der initialen CaaX - Prozessierung von trunkiertem Prälamin A (head/rod) durch Mevinolin ergab keine signifikante Akkumulationsveränderung des trunkierten Prälamins im Zellkern. Ergänzende subzelluläre Lokalisationsstudien unter Zuhilfenahme ausgewählter CaaX – Mutanten, um die gezeigte Unabhängigkeit der CaaX – Prozessierung zu verifizieren, stehen noch aus. FRAP – Untersuchungen in HeLa – Zellen zeigten für die episomal exprimierten trunkierten Fusionsproteine DsRed – Prälamin A Δ50 und DsRed – Prälamin A Δ90 keinen Unterschied in der lateralen Mobilität. Gegenüber dem Wildtyp – DsRed – Prälamin A ist die Beweglichkeit jedoch signifikant reduziert. Bei der Applikation von thermischem Stress (37°C – 51°C) auf Prälamin A, Prälamin A Δ50 oder Prälamin A Δ90 exprimierende HeLa – Zellen, konnte keine Veränderung hinsichtlich der subzellulären Verteilung des zusätzlich koexprimierten Markerproteins GFP – ß – Galaktosidase im Sinne nukleären Schrankenstörung festgestellt werden. Somit scheint die Kernhülle trotz der zu Zellkerndysmorphien und KPK – Fehllokalisationen führenden Prälamin A – Mutanten hinsichtlich ihrer Schrankenfunktion intakt zu bleiben. / Lamin A and truncated forms were investigated adressing nuclear export, caax processing and laminar integrity. Nuclear export processes were investigated in vivo and in vivo via a modified heterdimerization assay. No difference was seen in human fibroblasts from wildtype and restrictive dermopathy patients concerning crm1-mediated nuclear export truncated prelamin A showed no enhanced nuclear localisation after inhibition of farnesylsynthesis. HGPS- and RD lamin A showed significantly decreased lateral mobility after 30 seconds in FRAP experiments. Applying heat stress to HeLa-cells showed no increased influx of the marker protein gfp-ß-galactosidase after 60 minutes.

„Who Wants to live Forever“ ist nicht nur ein legendärer Queen-Song, sondern auch eine interessante philosophische Frage. Bei Umfragen zu der Thematik gibt jedoch die Mehrheit der Befragten an, dass sie eine „Unsterblichkeitspille“ die ihnen ermöglichen würde für immer in ihrem aktuellen Alter zu leben, nicht nehmen würden. Gleichzeitig hatten in anderen Umfragen 80% der befragten Personen Interesse dran, 120 Jahre oder älter zu werden, wenn gute Ge-sundheit garantiert wäre. Doch worin liegt der Schlüssel für den Erhalt der Gesundheit bis ins hohe Alter? Was bedeutet „erfolgreiches Altern“ auf genetischer Ebene? Durch die in dieser Dissertation durchgeführte jahrzehnteweise Analyse der Genexpression wird deutlich, dass es einige miteinander interagierende Gene gibt, deren Expression sich erst ab einem bestimmten Alter oder sogar erst im hohen Alter signifikant verändert. Interessanterweise sind diese Gene vor allem mit dem Zellzyklus assoziiert. Gleichzeitig werden nur wenige dieser Gene bei der seltenen, mit vorzeitiger Alterung einhergehenden, genetischen Erkrankung Progerie differentiell exprimiert, was auf eine mögliche Bedeutung dieser Gene für die chrono-logischen Alterung oder möglicherweise sogar die „erfolgreiche“ chronologische Alterung hinweisen könnte. Einige von ihnen interagieren unter anderem mit microRNAs die mit dem Renin-Angiotensin-System assoziiert werden und könnten daher möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Bluthochdruck und altersbedingten kardiovaskulären Erkrankungen spielen. Der technische Fortschritt und bioinformatische Methoden ermöglichen durch Analysen auf molekularer Ebene immer genauere Erkenntnisse, beispielsweise über die Veränderungen die im Rahmen der Alterung auftreten. Dazu gehören jedoch nicht nur die als „Omics“ bezeichneten Methoden, sondern auch die wachsende Menge und Verfügbarkeit dieser Daten. Um diese Da-ten zu analysieren werden auch neue Methoden entwickelt, wie die im Rahmen dieser Arbeit publizierte Principal Feature Analysis, die anschließend optimiert und in ein Analyseframework eingebaut wurde. Dadurch ist es möglich, die in einer Studie generierten Daten erneut zu analy-sieren oder sie zur Beantwortung von weiteren Forschungsfragen einzusetzen. In einem weite-ren Teil dieser Arbeit hat sich im Rahmen einer Kooperation mit Dr. Seema Dangwal und dem Ronglih Liao Lab aus dem Stanford Medicine Department zur Erforschung der Zusammenhän-ge zwischen COVID-19 und kardiovaskulären Erkrankungen bei der Analyse zwei verschiede-ner Datensätze aus zwei unterschiedlichen Publikationen, die in Zeitschriften mit hohem Impact Factor veröffentlicht wurden, gezeigt, dass bei Big Data die Datenintegrität eine entscheidende Rolle spielt und wie groß die Verantwortung der jeweiligen Forscher ist, korrekte Metadaten und Analysen zur Verfügung zu stellen. / “Who Wants to Live Forever” is not only an iconic Queen song but also represents a fascinating philosophical question. Surveys reveal that the majority would not consume an ‘immortality pill’ that would enable them to live forever at their current age. Contrastingly, 80% express a desire to live until 120 or beyond, granted they maintain good health. What, then, are the determinants of sustained health in old age? What defines ‘successful aging’ at the genetic level? This thesis aims to address the research question of whether and how the gene expression of healthy nonagenarians diverges from that of other age groups. A decade-wise analysis of gene expression conducted in this dissertation reveals several interacting genes. Their expression only changes significantly after a certain age or even not until old age. Intriguingly, these genes are predominantly associated with the cell cycle. Few of these genes show differential expression in the rare, premature aging-associated genetic disease, Progeria. This could potentially indicate these genes’ importance in chronological aging or perhaps even ‘successful’ chronological aging. Some of these genes interact with microRNAs associated with the Renin-Angiotensin System, potentially playing a vital role in the development of hypertension and age-related cardiovascular diseases. Technical advancements and bioinformatic methods enable increasingly accurate insights on the molecular level, including the changes occurring with aging. This includes not just ‘Omics’ techniques but also the growing amount and availability of data. New methods are being developed for analyzing these data, such as the Principal Feature Analysis published in the context of this work, which was subsequently optimized and integrated into an analysis framework. This allows for the re-analysis of data generated from a study or its use to answer further research questions. In another part of this work, during a collaboration with Dr. Seema Dangwal and the Ronglih Liao Lab from Stanford Medicine Department to explore the links between COVID-19 and cardiovascular diseases, analysis of two different datasets from two separate high-impact factor publications revealed the critical role of data integrity in big data research and the consequent responsibility researchers bear to provide accurate metadata and analyses.

Hallermann-Streiff syndrome (HSS) is a rare inherited disorder characterized by malformations of the cranium and facial bones, congenital cataracts, microphthalmia, skin atrophy, hypotrichosis, proportionate short stature, teeth abnormalities, and a typical facial appearance with prominent forehead, small pointed nose, and micrognathia. The genetic cause of this developmental disorder is presently unknown. Here we describe 8 new patients with a phenotype of HSS. Individuals with HSS present with clinical features overlapping with some progeroid syndromes that belong to the laminopathies, such as Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) and mandibuloacral dysplasia (MAD). HGPS is caused by de novo point mutations in the LMNA gene, coding for the nuclear lamina proteins lamin A and C. MAD with type A and B lipodystrophy are recessive disorders resulting from mutations in LMNA and ZMPSTE24 , respectively. ZMPSTE24 in addition to ICMT encode proteins involved in posttranslational processing of lamin A. We hypothesized that HSS is an allelic disorder to HGPS and MAD. As the nuclear shape is often irregular in patients with LMNA mutations, we first analyzed the nuclear morphology in skin fibroblasts of patients with HSS, but could not identify any abnormality. Sequencing of the genes LMNA, ZMPSTE24 and ICMT in the 8 patients with HSS revealed the heterozygous missense mutation c.1930C>T (p.R644C) in LMNA in 1 female. Extreme phenotypic diversity and low penetrance have been associated with the p.R644C mutation. In ZMPSTE24 and ICMT , no pathogenic sequence change was detected in patients with HSS. Together, we found no evidence that HSS is another laminopathy.