Existe um atraso no diagnóstico de endometriose de cerca de 8 anos, provavelmente devido ao fato de seu diagnóstico ser cirúrgico e seus sintomas inespecíficos e com vários graus de intensidade. Devido a isso a procura por marcadores de endometriose é de interesse de todos os ginecologistas. Já foi demonstrado que a prolactina está aumentada neste grupo de pacientes. O objetivo deste estudo é avaliar a prolactina e o CA 125 com marcadores no diagnóstico de endometriose. Conduzimos ao longo desta dissertação um estudo transversal com um total de 97 pacientes divididas em dois grupos: 1- Grupo de estudo: pacientes sintomáticas com endometriose (sintomas de infertilidade ou dor), 2- Grupo controle: grupo de pacientes assintomática sem endometriose (pacientes que realizaram laparoscopia para ligadura tubária). Foram coletados amostra de plasma em ciclos menstruais anteriores a cirurgia durante a fase secretora do ciclo menstrual sendo dosado a prolactina (poll de 3 amostras) e o CA 125. Encontramos que a prolactina está aumentada no grupo de pacientes com endometriose, seja em pacientes inférteis, pacientes com dor, estágios I e II ou estágios III e IV. Comparando os dois marcadores, a prolactina (sensibilidade de 21% e especificidade de 99%) e Ca 125 (sensibilidade de 27% e especificidade de 97%) apresentam sensibilidade e especificidade semelhantes (P=0.58). Quando utilizamos estes dois marcadores juntos a sensibilidade foi de 44% e especificidade de 99%. Quando utilizamos, com escolha através da curva ROC, os dois melhores pontos de corte para prolactina e Ca 125 com os seguintes critérios: melhor sensibilidade para uma especificidade maior que 90% endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I), obtivemos uma sensibilidade de 77% e especificidade 88% com os dois marcadores juntos. A prolactina é um marcador sérico semelhante ao CA 125 para diagnóstico de endometriose, e estes dois marcadores usados isoladamente possuem baixa sensibilidade. Entretanto, o uso destes dois marcadores juntos especialmente usando pontos de corte mais adequados para endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I) apresentam sensibilidade (77%) e especificidade (88%) aceitáveis.

La prolactina participa en la regulación de los ciclos de desarrollo del folículo piloso y puede modular directa o indirectamente los ciclos de su crecimiento, caída y muda en animales peludos. Los receptores de prolactina han sido localizados en queratinocitos epidermales y foliculares de rata por hibridación in situ (Ouhtit et al., 1993) y en queratinocitos foliculares y fibroblásticos de la papila dermal de la oveja con un ensayo de unión radioligando (Choy et al., 1995). Los lugares de unión de prolactina que exhiben gran afinidad por el ligando fueron identificados en preparaciones de la membrana de piel de visón, la más alta concentración de lugares de unión fue encontrado durante el ciclo de crecimiento del pelaje en invierno (Rose et al., 1995). La actividad de unión del receptor de prolactina y la expresión del gen del receptor de prolactina en piel de ovinos han sido definidos recientemente (Choy et al., 1997). La prolactina y la expresión del receptor de prolactina durante el ciclo piloso murino no estacional, el cual en contraste con la oveja en comparación con el cuero cabelludo del humano reportan que ambos, prolactina y receptor de prolactina son estrictamente restringidos al epitelio del folículo piloso y son fuertemente dependientes del ciclo del pelo (Foitzik et al., 2003). En ovejas los folículos pilosos productores de lana pueden ser inducidos a su crecimiento cíclico manipulando los niveles de prolactina circulante, la cual altera los patrones de expresión de genes relacionados a queratinas de la lana y además, esta prolactina es generada localmente en el folículo piloso y actúa directamente en forma autocrina y paracrina en las ovejas (Pearson et al., 1999). Por lo tanto, el lugar o lugares de acción de la prolactina en la regulación del crecimiento estacional de la fibra permanecen como una pregunta abierta. Es posible que los efectos diferentes de la prolactina sobre los folículos telógenos y anágenos puedan ser ejercidos por medio de diferentes células blanco (Choy et al., 1997). Todos estos estudios nos indican que existe una regulación en el crecimiento del pelo o lana de tipo endocrino hormonal, y que también debe existir este control en el crecimiento de la fibra de la alpaca. El presente trabajo tiene entonces por objetivo determinar mediante la técnica Inmunohistoquímica la presencia de receptores para prolactina (PRLRs) en células epiteliales de folículos pilosos primarios y secundarios de piel de alpaca (Lama pacos). / Tesis

No description available.

Existe um atraso no diagnóstico de endometriose de cerca de 8 anos, provavelmente devido ao fato de seu diagnóstico ser cirúrgico e seus sintomas inespecíficos e com vários graus de intensidade. Devido a isso a procura por marcadores de endometriose é de interesse de todos os ginecologistas. Já foi demonstrado que a prolactina está aumentada neste grupo de pacientes. O objetivo deste estudo é avaliar a prolactina e o CA 125 com marcadores no diagnóstico de endometriose. Conduzimos ao longo desta dissertação um estudo transversal com um total de 97 pacientes divididas em dois grupos: 1- Grupo de estudo: pacientes sintomáticas com endometriose (sintomas de infertilidade ou dor), 2- Grupo controle: grupo de pacientes assintomática sem endometriose (pacientes que realizaram laparoscopia para ligadura tubária). Foram coletados amostra de plasma em ciclos menstruais anteriores a cirurgia durante a fase secretora do ciclo menstrual sendo dosado a prolactina (poll de 3 amostras) e o CA 125. Encontramos que a prolactina está aumentada no grupo de pacientes com endometriose, seja em pacientes inférteis, pacientes com dor, estágios I e II ou estágios III e IV. Comparando os dois marcadores, a prolactina (sensibilidade de 21% e especificidade de 99%) e Ca 125 (sensibilidade de 27% e especificidade de 97%) apresentam sensibilidade e especificidade semelhantes (P=0.58). Quando utilizamos estes dois marcadores juntos a sensibilidade foi de 44% e especificidade de 99%. Quando utilizamos, com escolha através da curva ROC, os dois melhores pontos de corte para prolactina e Ca 125 com os seguintes critérios: melhor sensibilidade para uma especificidade maior que 90% endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I), obtivemos uma sensibilidade de 77% e especificidade 88% com os dois marcadores juntos. A prolactina é um marcador sérico semelhante ao CA 125 para diagnóstico de endometriose, e estes dois marcadores usados isoladamente possuem baixa sensibilidade. Entretanto, o uso destes dois marcadores juntos especialmente usando pontos de corte mais adequados para endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I) apresentam sensibilidade (77%) e especificidade (88%) aceitáveis.

Existe um atraso no diagnóstico de endometriose de cerca de 8 anos, provavelmente devido ao fato de seu diagnóstico ser cirúrgico e seus sintomas inespecíficos e com vários graus de intensidade. Devido a isso a procura por marcadores de endometriose é de interesse de todos os ginecologistas. Já foi demonstrado que a prolactina está aumentada neste grupo de pacientes. O objetivo deste estudo é avaliar a prolactina e o CA 125 com marcadores no diagnóstico de endometriose. Conduzimos ao longo desta dissertação um estudo transversal com um total de 97 pacientes divididas em dois grupos: 1- Grupo de estudo: pacientes sintomáticas com endometriose (sintomas de infertilidade ou dor), 2- Grupo controle: grupo de pacientes assintomática sem endometriose (pacientes que realizaram laparoscopia para ligadura tubária). Foram coletados amostra de plasma em ciclos menstruais anteriores a cirurgia durante a fase secretora do ciclo menstrual sendo dosado a prolactina (poll de 3 amostras) e o CA 125. Encontramos que a prolactina está aumentada no grupo de pacientes com endometriose, seja em pacientes inférteis, pacientes com dor, estágios I e II ou estágios III e IV. Comparando os dois marcadores, a prolactina (sensibilidade de 21% e especificidade de 99%) e Ca 125 (sensibilidade de 27% e especificidade de 97%) apresentam sensibilidade e especificidade semelhantes (P=0.58). Quando utilizamos estes dois marcadores juntos a sensibilidade foi de 44% e especificidade de 99%. Quando utilizamos, com escolha através da curva ROC, os dois melhores pontos de corte para prolactina e Ca 125 com os seguintes critérios: melhor sensibilidade para uma especificidade maior que 90% endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I), obtivemos uma sensibilidade de 77% e especificidade 88% com os dois marcadores juntos. A prolactina é um marcador sérico semelhante ao CA 125 para diagnóstico de endometriose, e estes dois marcadores usados isoladamente possuem baixa sensibilidade. Entretanto, o uso destes dois marcadores juntos especialmente usando pontos de corte mais adequados para endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I) apresentam sensibilidade (77%) e especificidade (88%) aceitáveis.

Orientador: Margaret de Castro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T05:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Durlo_FlaviaVendramini_M.pdf: 19565345 bytes, checksum: a3da028220c4dfb0874dae374182f135 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A prolactina (pRL) é um honnônio polipeptídico e sua regulação é influenciada .por um grande número de fatores que estimulam ou inibem a sua secreção. Em mamíferos, o controle exercido pelo hipotálamo sobre a secreção de PRL pela hipófise é predominantemente inibitório tendo como principal regulador a dopamina. Dentre as ações da PRL incluem a secreção de leite, regulação da reprodução e uma possível função no balanço de água e eletrólitos. Os efeitos da PRL sobre o equilíbrio hidroeletrolítico podem ser parcialmente mediados pela liberação de corticosterona (B), vasopressina (AVP), ou ainda serem dependentes de outros honnônios, como a ocitocina (OT) e o peptídeo natriurético atrial (ANP). O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da expansão de volume extracelular (EVEC), por meio da injeção endovenosa de solução salina isotônica (I) ou hipertônica (H) sobre a secreção de PRL, B, ANP e OT, em ratos. Avaliar, ainda, os efeitos de diferentes concentrações plasmáticas de PRL sobre a secreção de B, ANP e OT, induzidas pela EVEC 1 ou H, e a modulação destas respostas pelo eixo HHA. Foram utilizados ratos machos que, após ambientação, foram submetidos a diferentes manipulações experimentais: grupo controle, animais que não receberam nenhum tratamento; grupo tratado com bromocriptina; grupo tratado com sulpirida e grupo tratado com dexametasona. Após EVEC I, no grupo controle, houve um aumento significativo das concentrações plasmáticas de PRL, B, ANP e OT, o mesmo ocorrendo com EVEC H,porém com valores mais elevados de ANP e OT após EVEC H. Não houve modificação das respostas do ANP e OT após EVEC 1 e H nos grupos tratados com bromocriptina e dsulpirida. As elevações de PRL e OT foram bloqueadas no grupo tratado com rdexametasona, sendo que este tratamento não alterou a secreção de ANP induzida pela EVEC 1 e H. Em conjunto, os resultados obtidos indicam que a EVEC induzida pela injeção de salina isotônica ou hipertônica provocou elevações nas concentrações plasmáticas de PRL, B, ANP e OT. A elevação do ANP e OT frente ao estímulo da EVEC 1 e H foram independentes das concentrações plasmáticas de PRL. As elevações de PRL e OT foram bloqueadas pela inibição do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. Entretanto, o tratamento com dexametasona não modificou o aumento da secreção de ANP induzido pela EVEC 1 e H. Portanto, PRL pode participar na regulação do equilíbrio hidroeletrolítico dos mamíferos, porém, sem uma interação direta com os sistemas ANPérgico e ocitocinégico. Adicionalmente, a resposta da PRL a EVEC 1e H é modulada pelo eixo HHA / Abstract: Prolactin (pRL) regulation is influenced by a great number of factors that stimulate or inhibit its secretion. In mammals, the control of the PRL secretion is predominantlyinhibitory and is exerted by dopamine, which is released ITomthe hypothalamus. PRL acts on milk secretion, reproduction and probably on water and electrolyte balance. The effect of the PRL on the hydroeletrolitic balance can partially be mediated by corticosterone (B), vasopressin (AVP), oxytocin (OT) or atrial natriuretic peptide (ANP). The objective ofthis study was to evaluate the effect of the extracellular volume expansion (EVE) by endovenous injection of isotonic (I) or hypertonic (H) saline solution on the secretion of PRL, B, ANP and OT, in rats. We used Wistar male rats submitted to different experimental manipulations: control group, intact animais; group treated with bromocriptine; group treated with sulpiride and a group treated with dexamethasone. Afier EVE I, the control group presented a significant increase of the plasma concentrations of PRL, B, ANP and OT, the same results were observed afier EVE H. The increase of ANP and OT levels in response to EVE H was more pronounced than to EVE I. Bromocriptine and sulpiride treatment did not modifYB, ANP and OT responses to either EVE I and EVE H. The increase of PRL and OT observed afier EVE I and H were blocked in the group treated with dexamethasone, while, there was no modification in the ANP secretion. In conc1usion, these results indicate that the EVE I and EVE H induced by the injection of isotonic or hypertonic saline provoked an increased in PRL, B, ANP and OT plasma concentrations. The increase of ANP and OT by EVE I and EVE H were independent of PRL plasma concentrations. The increase ofPRL and OT were blocked by the inhibition of the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis by dexamethasone. However, dexamethasone did not modifYthe increase of the ANP secretion induced by EVE I and EVE H. Therefore, PRL might participate in the regulation of the hydroeletrolitic balance in mammals, however, there is no evidence for direct interaction with ANPergic and oxytocinergic systems. Additionally, the response ofthe PRL induced by EVE I and EVE H is modulated by HPA axis / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amaral_MariaEsmeriaCorezolado_D.pdf: 3942946 bytes, checksum: 8e4dd04c438e05bd4b43ba8e9eda71c1 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Durante a prenhez, as ilhotas de Langerhans dos mamíferos passam por modificações estruturais e funcionais em resposta a uma demanda maior de insulina. Essas modificações são orquestradas por diferentes hormônios, incluindo GIl, lactogênios placentários e prolactina (pRL). Muitas das alterações observadas durante a prenhez podem ser reproduzidas in vitro, especialmente se forem usadas ilhotas de Langerhans de neonatos como modelo biológico. O tratamento prolongado de ilhotas de ratos neonatos in vitro com prolactina (pRL) aumenta a síntese de insulina, a expressão do GLUT2, a atividade da glicoquinase, o metabolismo da glicose, a formação de ATP, a atividade iônica (representada por maior habilidade da glicose em reter K+ e Ca2+ pelas células insulares) e, finalmente, a secreção de insulina. Desta forma, considerando a ação pleiotrófica da PRL sobre as ilhotas pancreáticas e levando-se em conta que os efeitos da PRL nos tecidos se manifestam predominantemente através da via JAK2/STATs, este trabalho visou estudar outras possíveis vias de estimulação da PRL em ilhotas isoladas de ratos neonatos e de ratas prenhes. Além disso, diante da importância da insulina na manutenção da massa e funcionalidade das células f3 pancreáticas, buscou-se a existência de um possível cross-talk entre as vias de sinalização desses dois hormônios. O tratamento de ilhotas de ratos neonatos com PRL por 7 dias potencializou a secreção de insulina induzida por glicose, sendo este efeito abolido pela wortmannin, um bloqueador da PI 3 quinase. O tratamento com PRL também reduziu a apoptose em ilhotas de ratos neonatos. Este efeito foi acompanhado por aumento da fosforilação da Bad em serina 112 e foi abolido pela wortmannin. O tratamento com PRL não alterou a expressão do mRNA de proteínas apoptóticas tais como Bax, Bad, Bcl-XL. A exemplo do observado para a insulina, a exposição de ilhotas de ratos neonatos à PRL por 5 e 15 mino aumentou, de maneira dose-dependente, a fosforilação do IRS 1/2, a associação destes com a PI 3-quinase e a atividade desta enzima. Contudo, esses efeitos não foram aditivos aos da insulina. A PRL também estimulou a fosforilação da JAK2, SHC e ERK1/2 em ilhotas de neonatos. Em ilhotas isoladas de ratas prenhes (15°-18° dias de prenhez) houve aumento da fosforilação em tiro sina do IRS 1/2, SHC e ERK, em serina da AKT e em serina-treonina da p70 S6-quinase, quando comparado a ilhotas de ratas-controle. A administração nas ratas prenhes de oligonucleotídeo antisense (mas não do sense) para o receptor de PRL (pRLR) reduziu a expressão do PRLR no útero e nas ilhotas, a fosforilação em tiro sina de proteínas insulares com peso molecular entre 250-160, 160-105 e 105-75 kDa, a fosforilação da p70 S6 quinase e, finalmente, a secreção de insulina. Concluindo, esses resultados indicam que a PRL pode estimular as vias da PI 3-quinase e da MAPK em ilhotas de ratos neonatos e que essas vias estão mais ativas nas ilhotas de ratas prenhes. O fato de a PRL ter induzido fosforilação da Bad serina 112, um substrato da via da MAPK, e este efeito ter sido abolido pela wortmannin, sugere a existência de um possível cross-talk entre as cascatas da PI 3-quinase e da MAPK em ilhotas de ratos neonatos / Abstract: During pregnancy, panereatie islets undergo a number of structural and functional changes in response to an increased demand for insulin. These changes are orchestrated by several hormones including GH, plaeental lactogens, and prolactin (pRL). Many ofthe alterations observed during pregnancy ean be reproduced in vitro, especially if one uses neonatal islets as a model. The treatment of neonatal islets with PRL inereases: insulin synthesis, GLUT2 expression, glueokinase activity, glucose metabolism, eAMP metabolism, ATP produetion, ionic activity (represented by higher ability of the glueose in retaining K+ and Ca2+ inside the islet eells), and finally insulin secretion. Thus, taking into aeeount the pleiotropie effects of PRL on panereatie islets and reconsidering that PRL acts mainly via the JAK2/STATs pathways in most of the target tissues, we have studied here if PRL stimulates also the PI 3 kinase and MAPK pathways in islets ITom neonatal and ITom pregnant rats. Sinee insulin is important for the maintenance of the mass and functionality of adult islets, we have also analyzed a possible eross-talk between the signaling pathways of these two hormones. PRL signifieantly potentiated glueose-induced insulin secretion in islets cultured for 7 days. This effect was bloeked by the speeifie PI 3-kinase inhibitor, wortmannin. PRL treatment also reduced apoptosis that was accompanied by an inerease in Bad Ser 112 phosphorylation. These effects were abolished by wortmannin. PRL did not affeet mRNA expression of apoptotie protein sueh as Bad, Bax, and Bcl-XL. Similar to what was observed for insulin, the exposure of neonatal islets for short period of time (5 and 15 min) to PRL inereased, in a dose-dependent manner, IRS 1/2 tyrosine phosphorylation, their association with, and activation of PI 3-kinase. However, these effects were not additive to the effects of insulin. PRL also increased JAK2, SHC, ERK1/2 phosphoryIation in neonatal isIets. In pregnant rats (17th -19th days of pregnancy) higher IeveIs of tyrosine (IRS1, IRS2, SHC, ERK), serine (AKT), and serine-threonine (p70 S6-kinase) phosphorylation were found, compared to controIs. The treatment of pregnant rats with PRL receptor antisense (pRLR), but not sense oligonucIeotides, significantly reduced the expression of PRLR in uterus and islets, the expression of islet tyrosine phosphorylated proteins with molecu1ar masses of 250-160, 160-105 and 105-75 kDa, phosphorylation of the p70 S6-kinase and, finally, the glucose-induced insulin secretion. In conclusion, PRL treatment activates PI 3-kinase and MAPK pathways in neonatal islets. These pathways seem to be more active in islets ITom pregnant than controI rats. Since PRL induced phosphoryIation of Bad Ser 112, a preferential target for MAPK, was abolished by wortmannin, some earIy cross talk between the PI 3-kinase and MAPK cascades may occur during stimulation with PRL / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:16:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_DanielAndradeda_M.pdf: 2697533 bytes, checksum: d12b9062280cdcb4fda2b4e21d0f6529 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Muitas proteínas estão envolvidas no processo de extrusão de grânulos e fusão de membranas nas células ß pancreáticas, e entre estas se destacam as proteínas da família SNARE, composta pela sintaxina, VAMP, SNAP-25 e as sinaptotagminas. Durante a prenhez e o período pós-natal, a prolactina (PRL) e os lactogênios placentários induzem a maturação do processo secretório nas ilhotas pancreáticas por um mecanismo que não está totalmente conhecido. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar se o aumento na resposta secretória frente à glicose observado durante a prenhez envolve alterações na expressão das proteínas SNARE e das sinaptotagminas 1 e 4. Observamos aumento na expressão gênica e protéica da sintaxina 1A, SNAP-25, VAMP-2 e da sinaptotagmina 4 nas ilhotas de neonatos (1 ¿ 2 dias de vida) tratadas com PRL. Demonstramos também que ilhotas de ratas prenhes (17 ¿ 18 dias após cópula) apresentam maior expressão da sintaxina 1A, SNAP-25 e sinaptotagmina 4 que ilhotas controle. Além disso, a inibição das vias da PI3-cinase pela wortmanina ou da MAP-cinase pelo PD098059, não alterou a transcrição destes genes. Desta forma, podemos concluir que prolactina modula a expressão gênica e protéica de parte dos componentes ligados aos passos finais da extrusão dos grânulos de insulina e que este efeito não é mediado pelas vias da PI3- ou da MAPcinase / Abstract: The soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein receptor (SNARE) molecules SNAP-25, syntaxin and VAMP-2 as well as synaptotagmins participate in the extrusion of insulin containing granules in pancreatic ß-cells. During pregnancy and the perinatal periods of life, prolactin (PRL) and other lactogenic substances induce maturation of the stimulus-secretion coupling in the pancreatic islets by a mechanism that is still unclear. In the present study, we investigated whether the improvement in the secretory response to glucose during those periods involves alteration in the expression of syntaxin 1A, SNAP-25, VAMP-2 and synaptotagmins 1 and 4. In islets from pregnant rats (17th ¿ 18th days of pregnancy) and islets from neonatal rats (1-2 days old) treated with PRL for five days, the expression of syntaxin, SNAP-25 and synaptotagmin 4 genes and their encoded proteins was increased compared with controls. VAMP-2 gene and protein was increased in PRL treated-islets from neonatal rats but not in islets from pregnants rats. Wortmannin, a PI3-kinase inhibitor, and PD098059 (PD), a MAP-kinase inhibitor, failed to abrogate the effect of treatment with PRL on the expression of the above proteins. In conclusion, these data indicate that PRL modulates the final steps of insulin secretion by increasing the expression of proteins involved in membrane fusion. These experiments also indicate that effects of PRL occur mainly through a signaling cascade distinct from the PI3-kinase or MAP-kinase pathways / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Marta H. Krieger-Azollini, Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T01:40:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Crepaldi_SilviaCristina_M.pdf: 5590505 bytes, checksum: b013d47cf01e064c820efc4b70d7cbef (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: o presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito da PRL no processo de maturacão da resposta secretória à glicose em células B pancreáticas. Enfase foi dada, ao estudo de possíveis alteracões nas permeabilidades dos íons potássio e cálcio e sobre a secrecão de insulina.Para isto, ilhotas de ratos Wistar recém-nascidos, foram cultivadas por 7 a 9 dias, em Meio Essencial Mínimo, acrescido de 11% de soro fetal bovino (v/v), 2% da mistura penicilina (100 U/ml)-estreptomicina (0,1 mg/ml), com concentracão final de glicose de 10 mM. As ilhotas foram mantidas a 37°C; pH 7,4; em uma atmosfera com 5% de C02. O meio de cultura foi renovado a cada 48 horas. Parte do material em cultura serviu como controle e parte recebeu tratamento diário com PRL (2 ~g/ml).Após o período de cultura, foram executados os seguintes protocolos:a) Perfusão de ilhotas para a análise da dinâmica do efluxo do aSRb+, do 45Ca2+ e da secrecão de insulina. b) Medidas do influxo de 45Ca2+. c) Extracão e dosagem do (conteúdo total de insulina por ilhota.Os resultados mostraram que: 1. A capacidade da glicose em alterar o efluxo do 8sRb+, foi maior em ilhotas tratadas com PRL do que em relacão às controle. 2. O efeito da tolbutamida, diminuindo e da diazoxida,aumentando o efluxo do 8SRb+, foi mais acentuado em ilhotas tratadas com PRL do que nas controle. 3. O aumento na incorporação de 45Ca que ocorreu frente ao aumento da concentração de glicose ou de K+, foi semelhante em ambos os grupos experimentais.4. Na ausência do Ca2+ extracelular, glicose não provocou redução no. efluxo do 45Ca2+, em ambos os grupos de ilhotas.5. O tratamento hormonal melhorou a resposta secretória das ilhotas, quando estimuladas por 16,7 mM de glicose. 6. O conteúdo total de insulina foi maior em ilhotas tratadas com PRL do que em ilhotas controle. Concluindo, os resultados indicam que em ilhotas neonatais de rato, o tratamento crônico com PRL, aumentou o conteúdo de insulina, potencializou a capacidade da glicose em reduzir o efluxo do K+ e em aumentar a secreção de insulina. Contudo, o tratamento com PRL não influiu de maneira significativa sobre o efeito da glicose a nível dos fluxos de Ca2+ / Abstract: The present study aimed to compare the effect of PRL on the maturation of the mechanisms of insulin secretion induced by glucose in neonatal pancreatic islets. Our attention were centralized mainly on possible alterations in Ca2+ and K+ fluxes and insulin release.For this purpose islets from neonatal Wistar rats were cultured for 7 to 9 days in Minimal Essential Medium,supplemented with 11% fetal calf serum (v/v), 2% penicilin (100 Ujml)-streptomicin (0,1 mg/ml) and glucose (final concentration 10 mM). The islets were maintened at 37°C; pH 7,4; in a 5% CO2 atmosphere. Culture medium was renewed every 48 hours. Part of the islets was used as control and part was treated daily with PRL (2 j.lg/ml). After culture, the following protocols were executed: a) Measurement of 86Rb+ and 45Ca2+ efflux rate and insulin release by perifused islets.b) Measurement of 45Ca influx in incubated islets. c) Measurement of total insulin content in the islets. The results showed that: 1. The capacity of glucose in changing the 8BRb+ effl~, was higher in PRL-treated islets than in control islets. 2. The effects of tolbutamide (lowering) and diazoxide (increasing) the B6Rb+ efflux, were higher in PRL-treated than in control islets. 3. PRL-treatment did not affect the ability of glucose and high K+ to increase the 45Ca uptake by incubated islets. 4. Glucose failed to affect the 45Ca2+ efflux from islets perifused in the apsence of Ca2+, either in PRL-treated or control islets. 5. Total insulin content was higher in PRL-treated than in contraI islets. 6. Finally, glucose induced higher increase in insulin secretion in PRL-treated islets than in contraI islets. The results indicate that in neonatal rat islets, the cronic treatment wi th PRL increased the insulin content of islets and significantly changed the ability of glucose in reducing the K+ efflux and to increasing the insulin secretion. However, PRL treatment did not influence the effect of glucose on Ca2+ fluxes / Mestrado / Fisiologia e Biofisica / Mestre em Ciências Biológicas

A Prolactina humana hPRL é um hormônio protéico com 199 aminoácidos (MM ~ 23.000 Da) com um amplo espectro de atividades biológicas, sendo mais conhecido por estimular a lactação e regular o crescimento e diferenciação da glândula mamária. Além de quebra proteolítica, a maioria dos variantes de prolactina podem ser resultantes de outros processos pós-traducionais como polimerização, fosforilação, desamidação, sulfatação e glicosilação. Essa proteína contém apenas um sítio potencial de glicosilação por ligação à asparagina, localizada no aminoácido 31, que é parcialmente ocupado (10%) quando a proteína é sintetizada em células eucariotas. Apesar da atividade biológica in vitro da prolactina glicosilada (G-hPRL) ser muito menor (~4 vezes) quando comparada à não glicosilada, sua função fisiológica ainda não é bem definida e a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e clearance plasmático do hormônio. Com o objetivo de melhor caracterizar e estudar esta variante hormonal, foi realizada sua purificação em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) modificadas geneticamente, utilizando meio de cultura suplementado com cicloheximida, aumentando ~4 vezes sua concentração absoluta e ~10 vezes a razão entre a isoforma glicosilada e a não-glicosilada. A purificação da G-hPRL seguiu um processo simples e efetivo de duas etapas principais baseado em uma coluna de troca catiônica e uma coluna preparativa de exclusão molecular acoplada a um sistema de cromatografia líquida de excusão molecular de alta eficiência (HPSEC). A caracterização foi feita por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e exclusão molecular, SDS-PAGE, Western Blotting, espectometria de massa (MALDI-TOF) e um bioensaio in vitro utilizando células Nb2 e Ba/F3-LLP. Nossos resultados demostram que a cicloheximida pode ser uma importante ferramenta para aumentar a produção de prolactina glicosilada, facilitando a purificação e caracterização dessa isoforma. / Human prolactin hPRL is a 199 aminoacid protein hormone (MM ~23.000 Da) with a wide spectrum of biological activities being, however, best known for its stimulation of lactation and development of mammary gland. Besides proteolytic cleavage, the majority of prolactin variants can be the result of other posttranslational processing of the mature molecule in the anterior pituitary gland or the plasma. These include polymerization, phosphorylation, deamidation, sulfation, and glycosylation. This protein contains only one potential asparagine-linked glycosylation site which is partially ( ~10%) occupied when the protein is synthesized in eukaryotic cells. Although the biological activity of glycosylated hPRL (G-hPRL) has been found ~ 4-fold lower compared to that of hPRL, its physiological function is not well defined yet, and the carbohydrate moiety seems to play an important role in the biosynthesis, secretion, biological activity, and plasma clearance of the hormone. In order to better characterize and study this hormone variant, we carried out its laboratory scale synthesis and purification from genetically modified CHO cells medium that had been supplemented with cycloheximide, increasing thus ~4-fold its absolute concentration and ~10-fold the glycosylated versus non-glycosylated hPRL concentration ratio. G-hPRL purification was carried via a simple and effective two-step process based on a cationic exchanger and a preparative size-exclusion HPLC column (HPSEC). Characterization was carried out by reversed-phase and size-exclusion HPLC, SDS-PAGE, western blotting, MALDI-TOF MS and in vitro bioassay utilizing Nb2 and Ba/F3-LLP cells. Ours results show that cycloheximide can be an important tool to increase the production of glycosylated proteins hPRL facilitating the purification and characterization of these isoforms.