A Prolactina humana hPRL é um hormônio protéico com 199 aminoácidos (MM ~ 23.000 Da) com um amplo espectro de atividades biológicas, sendo mais conhecido por estimular a lactação e regular o crescimento e diferenciação da glândula mamária. Além de quebra proteolítica, a maioria dos variantes de prolactina podem ser resultantes de outros processos pós-traducionais como polimerização, fosforilação, desamidação, sulfatação e glicosilação. Essa proteína contém apenas um sítio potencial de glicosilação por ligação à asparagina, localizada no aminoácido 31, que é parcialmente ocupado (10%) quando a proteína é sintetizada em células eucariotas. Apesar da atividade biológica in vitro da prolactina glicosilada (G-hPRL) ser muito menor (~4 vezes) quando comparada à não glicosilada, sua função fisiológica ainda não é bem definida e a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e clearance plasmático do hormônio. Com o objetivo de melhor caracterizar e estudar esta variante hormonal, foi realizada sua purificação em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) modificadas geneticamente, utilizando meio de cultura suplementado com cicloheximida, aumentando ~4 vezes sua concentração absoluta e ~10 vezes a razão entre a isoforma glicosilada e a não-glicosilada. A purificação da G-hPRL seguiu um processo simples e efetivo de duas etapas principais baseado em uma coluna de troca catiônica e uma coluna preparativa de exclusão molecular acoplada a um sistema de cromatografia líquida de excusão molecular de alta eficiência (HPSEC). A caracterização foi feita por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e exclusão molecular, SDS-PAGE, Western Blotting, espectometria de massa (MALDI-TOF) e um bioensaio in vitro utilizando células Nb2 e Ba/F3-LLP. Nossos resultados demostram que a cicloheximida pode ser uma importante ferramenta para aumentar a produção de prolactina glicosilada, facilitando a purificação e caracterização dessa isoforma. / Human prolactin hPRL is a 199 aminoacid protein hormone (MM ~23.000 Da) with a wide spectrum of biological activities being, however, best known for its stimulation of lactation and development of mammary gland. Besides proteolytic cleavage, the majority of prolactin variants can be the result of other posttranslational processing of the mature molecule in the anterior pituitary gland or the plasma. These include polymerization, phosphorylation, deamidation, sulfation, and glycosylation. This protein contains only one potential asparagine-linked glycosylation site which is partially ( ~10%) occupied when the protein is synthesized in eukaryotic cells. Although the biological activity of glycosylated hPRL (G-hPRL) has been found ~ 4-fold lower compared to that of hPRL, its physiological function is not well defined yet, and the carbohydrate moiety seems to play an important role in the biosynthesis, secretion, biological activity, and plasma clearance of the hormone. In order to better characterize and study this hormone variant, we carried out its laboratory scale synthesis and purification from genetically modified CHO cells medium that had been supplemented with cycloheximide, increasing thus ~4-fold its absolute concentration and ~10-fold the glycosylated versus non-glycosylated hPRL concentration ratio. G-hPRL purification was carried via a simple and effective two-step process based on a cationic exchanger and a preparative size-exclusion HPLC column (HPSEC). Characterization was carried out by reversed-phase and size-exclusion HPLC, SDS-PAGE, western blotting, MALDI-TOF MS and in vitro bioassay utilizing Nb2 and Ba/F3-LLP cells. Ours results show that cycloheximide can be an important tool to increase the production of glycosylated proteins hPRL facilitating the purification and characterization of these isoforms.

O mecanismo de ação dos esteróides sexuais sobre a proliferação e diferenciação do endométrio envolve a participação de fatores de crescimento e protooncogenes, cuja regulação é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do ciclo menstrual e os efeitos do acetado de medroxiprogesterona (MP A) sobre a expressão de prolactina (PRL), do protooncogene c-los e do fator de crescimento TGF~ no endométrio humano in vivo. Quarenta e seis mulheres com ciclos regulares receberam, de forma randomizada, placebo ou MP A (10mg/ dia, 10 dias). Em seguida foram submetidas a biópsia do endométrio e as amostras foram classificadas em 3 grupos de acordo com a fase do ciclo/tratamento: Proliferativo/Placebo (grupo 1, N=ll), Secretor/Placebo (grupo 2, N=18) e Secretor/MPA (grupo 3, N=8). Parte do material foi fixada em formol e incluída em parafina, sendo posteriormente submetida a coloração por imuno-histoquímica. O restante foi congelado a -70°C para posterior análise do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica de RT-PCR. Encontrou-se PRL imunorreativa no epitélio glandular de 9,1% das amostras do grupo 1, em 55,6% das amostras do grupo 2 e em 100% das amostras do grupo 3 (p<0,05; teste de Fisher). No estroma endometriat observou-se imunocoloração para PRL em 9)% , 66,7% e 87,5% das biópsias dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,01). Os níveis médios de mRNA da PRL foram maiores na fase secretora (grupo 2) e significativamente maiores no grupo 3 em relação ao grupo 1 (p<0,05). Observou-se imunocoloração para c-los (predominando no núcleo das células estremais) em 54,5% das biópsias do grupo 1, em 7,1% das do grupo 2 e em nenhuma do grupo 3 (p<0,05, grupo 1 vs 2 e 3). Os níveis de mRNA do c-los foram substancialmente menores nos grupos 2 e 3 comparados ao grupo 1 (p<0,05) e apresentaram correlação direta com os níveis séricos de estradiol (r= 0,56; p<0,02). Não houve diferença entre os grupos quanto à expressão de TGF~l. Entretanto, a freqüência de amostras com imunocoloração positiva para TGFB3 e os níveis de mRNA do TGFB3 foram sucessivamente maiores nos grupos 2 e 3 em comparação com o grupo 1. Os dados demonstram aumento da expressão de PRL e TGF~3 e inibição da expressão de c-los no endométrio durante a fase secretora do ciclo menstrual, bem como no endométrio estimulado por MPA. A inibição de c-los e o aumento na expressão de TGFB3 poderiam participar do mecanismo antiproliferativo da progesterona e dos progestogênios sobre o endométrio humano in vivo. / Growth factors anci protooncogenes are involveci in the mechanism of sex steroicistirnulateci growth anci ciifferentiation of the enciometriurn, but their precise regulation remains unclear. The aim of the present stuciy was to evaluate the influence of menstrual cycle anci the effects of meciroxyprogesterone acetate (MP A) on the expression of prolactin (PRL), c-los anci transforrning growth factor beta (TGFI3) in the hurnan enciometriurn in vivo. Forty-six cycling women were ranciomizeci to receive either 10 mg MPA or placebo, once a ciay ciuring 10 ciays. Enciometrial specirnens were obtaineci about 8-12 hours following the last tablet intake anci patients were classifieci into three groups accorciing to biopsy ciating anci treatment: Proliferative/Placebo (group 1, N=ll), Secretory /Piacebo (group 2, N=18) anci Secretory /MP A (group 3, N=8). Enciometrial sampies were partially snap-frozen in liquici nitrogen anci partially fixeci in formalin, embecicieci in paraffin anci staineci by irnrnunohistochemistry. Messenger ribonucleic acici (rnRNA) leveis were assessed by reverse transcriptidase polymerase chain reaction (RT-PCR). Irnmunoreactive PRL was found in the epithelium of 9.1% of the specirnens from group 1, in 55.6% of group 2, anci in 100% of group 3 (p<0.05, Fisher's exact test). In the enciometrial stroma, immunopositive PRL was present in 9.1%, 66.7% anci 87.5% of the specirnens from groups 1, 2 anci 3, respectively (p<0.01). The average leveis of PRL mRNA were slightiy increaseci in group 2 anci markecily increaseci in group 3 compareci to group 1 (p<0.05). Irnrnunoreactive c-los was concentrateci in the nucleus of stromal cells in 54.5% of the biopsies from group 1, in 7.1% of group 2, and in 0% of group 3 (p<0.05, group 1 vs 2 and 3). The leveis of c-los mRNA were greatly reciuceci in groups 2 anci 3 compareci to group 1 (p<0.05) anci correlateci positiveiy with serum estraciiollevels (r=0.56, p<0.02). There were no ciifferences between groups conceming to the enciometrial expression of TGFI31. However, the frequency of immunopositive samples for TGFB3 anci the leveis of TGFB3 rnRNA were higher in groups 2 anci 3 compareci to group 1. 1t is conclucieci that MP A induces PRL anci TGFB3 and inhibits c-los expression in endometrial cells in vivo, resembling what occurs ciuring the secretory phase of spontaneous ovulatory cycles. The inhibition of c-los and the increase of TGFB3 expression may contribute to the antiproliferative effect of progestins on the endometriurn.

O mecanismo de ação dos esteróides sexuais sobre a proliferação e diferenciação do endométrio envolve a participação de fatores de crescimento e protooncogenes, cuja regulação é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do ciclo menstrual e os efeitos do acetado de medroxiprogesterona (MP A) sobre a expressão de prolactina (PRL), do protooncogene c-los e do fator de crescimento TGF~ no endométrio humano in vivo. Quarenta e seis mulheres com ciclos regulares receberam, de forma randomizada, placebo ou MP A (10mg/ dia, 10 dias). Em seguida foram submetidas a biópsia do endométrio e as amostras foram classificadas em 3 grupos de acordo com a fase do ciclo/tratamento: Proliferativo/Placebo (grupo 1, N=ll), Secretor/Placebo (grupo 2, N=18) e Secretor/MPA (grupo 3, N=8). Parte do material foi fixada em formol e incluída em parafina, sendo posteriormente submetida a coloração por imuno-histoquímica. O restante foi congelado a -70°C para posterior análise do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica de RT-PCR. Encontrou-se PRL imunorreativa no epitélio glandular de 9,1% das amostras do grupo 1, em 55,6% das amostras do grupo 2 e em 100% das amostras do grupo 3 (p<0,05; teste de Fisher). No estroma endometriat observou-se imunocoloração para PRL em 9)% , 66,7% e 87,5% das biópsias dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,01). Os níveis médios de mRNA da PRL foram maiores na fase secretora (grupo 2) e significativamente maiores no grupo 3 em relação ao grupo 1 (p<0,05). Observou-se imunocoloração para c-los (predominando no núcleo das células estremais) em 54,5% das biópsias do grupo 1, em 7,1% das do grupo 2 e em nenhuma do grupo 3 (p<0,05, grupo 1 vs 2 e 3). Os níveis de mRNA do c-los foram substancialmente menores nos grupos 2 e 3 comparados ao grupo 1 (p<0,05) e apresentaram correlação direta com os níveis séricos de estradiol (r= 0,56; p<0,02). Não houve diferença entre os grupos quanto à expressão de TGF~l. Entretanto, a freqüência de amostras com imunocoloração positiva para TGFB3 e os níveis de mRNA do TGFB3 foram sucessivamente maiores nos grupos 2 e 3 em comparação com o grupo 1. Os dados demonstram aumento da expressão de PRL e TGF~3 e inibição da expressão de c-los no endométrio durante a fase secretora do ciclo menstrual, bem como no endométrio estimulado por MPA. A inibição de c-los e o aumento na expressão de TGFB3 poderiam participar do mecanismo antiproliferativo da progesterona e dos progestogênios sobre o endométrio humano in vivo. / Growth factors anci protooncogenes are involveci in the mechanism of sex steroicistirnulateci growth anci ciifferentiation of the enciometriurn, but their precise regulation remains unclear. The aim of the present stuciy was to evaluate the influence of menstrual cycle anci the effects of meciroxyprogesterone acetate (MP A) on the expression of prolactin (PRL), c-los anci transforrning growth factor beta (TGFI3) in the hurnan enciometriurn in vivo. Forty-six cycling women were ranciomizeci to receive either 10 mg MPA or placebo, once a ciay ciuring 10 ciays. Enciometrial specirnens were obtaineci about 8-12 hours following the last tablet intake anci patients were classifieci into three groups accorciing to biopsy ciating anci treatment: Proliferative/Placebo (group 1, N=ll), Secretory /Piacebo (group 2, N=18) anci Secretory /MP A (group 3, N=8). Enciometrial sampies were partially snap-frozen in liquici nitrogen anci partially fixeci in formalin, embecicieci in paraffin anci staineci by irnrnunohistochemistry. Messenger ribonucleic acici (rnRNA) leveis were assessed by reverse transcriptidase polymerase chain reaction (RT-PCR). Irnmunoreactive PRL was found in the epithelium of 9.1% of the specirnens from group 1, in 55.6% of group 2, anci in 100% of group 3 (p<0.05, Fisher's exact test). In the enciometrial stroma, immunopositive PRL was present in 9.1%, 66.7% anci 87.5% of the specirnens from groups 1, 2 anci 3, respectively (p<0.01). The average leveis of PRL mRNA were slightiy increaseci in group 2 anci markecily increaseci in group 3 compareci to group 1 (p<0.05). Irnrnunoreactive c-los was concentrateci in the nucleus of stromal cells in 54.5% of the biopsies from group 1, in 7.1% of group 2, and in 0% of group 3 (p<0.05, group 1 vs 2 and 3). The leveis of c-los mRNA were greatly reciuceci in groups 2 anci 3 compareci to group 1 (p<0.05) anci correlateci positiveiy with serum estraciiollevels (r=0.56, p<0.02). There were no ciifferences between groups conceming to the enciometrial expression of TGFI31. However, the frequency of immunopositive samples for TGFB3 anci the leveis of TGFB3 rnRNA were higher in groups 2 anci 3 compareci to group 1. 1t is conclucieci that MP A induces PRL anci TGFB3 and inhibits c-los expression in endometrial cells in vivo, resembling what occurs ciuring the secretory phase of spontaneous ovulatory cycles. The inhibition of c-los and the increase of TGFB3 expression may contribute to the antiproliferative effect of progestins on the endometriurn.

O mecanismo de ação dos esteróides sexuais sobre a proliferação e diferenciação do endométrio envolve a participação de fatores de crescimento e protooncogenes, cuja regulação é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do ciclo menstrual e os efeitos do acetado de medroxiprogesterona (MP A) sobre a expressão de prolactina (PRL), do protooncogene c-los e do fator de crescimento TGF~ no endométrio humano in vivo. Quarenta e seis mulheres com ciclos regulares receberam, de forma randomizada, placebo ou MP A (10mg/ dia, 10 dias). Em seguida foram submetidas a biópsia do endométrio e as amostras foram classificadas em 3 grupos de acordo com a fase do ciclo/tratamento: Proliferativo/Placebo (grupo 1, N=ll), Secretor/Placebo (grupo 2, N=18) e Secretor/MPA (grupo 3, N=8). Parte do material foi fixada em formol e incluída em parafina, sendo posteriormente submetida a coloração por imuno-histoquímica. O restante foi congelado a -70°C para posterior análise do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica de RT-PCR. Encontrou-se PRL imunorreativa no epitélio glandular de 9,1% das amostras do grupo 1, em 55,6% das amostras do grupo 2 e em 100% das amostras do grupo 3 (p<0,05; teste de Fisher). No estroma endometriat observou-se imunocoloração para PRL em 9)% , 66,7% e 87,5% das biópsias dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,01). Os níveis médios de mRNA da PRL foram maiores na fase secretora (grupo 2) e significativamente maiores no grupo 3 em relação ao grupo 1 (p<0,05). Observou-se imunocoloração para c-los (predominando no núcleo das células estremais) em 54,5% das biópsias do grupo 1, em 7,1% das do grupo 2 e em nenhuma do grupo 3 (p<0,05, grupo 1 vs 2 e 3). Os níveis de mRNA do c-los foram substancialmente menores nos grupos 2 e 3 comparados ao grupo 1 (p<0,05) e apresentaram correlação direta com os níveis séricos de estradiol (r= 0,56; p<0,02). Não houve diferença entre os grupos quanto à expressão de TGF~l. Entretanto, a freqüência de amostras com imunocoloração positiva para TGFB3 e os níveis de mRNA do TGFB3 foram sucessivamente maiores nos grupos 2 e 3 em comparação com o grupo 1. Os dados demonstram aumento da expressão de PRL e TGF~3 e inibição da expressão de c-los no endométrio durante a fase secretora do ciclo menstrual, bem como no endométrio estimulado por MPA. A inibição de c-los e o aumento na expressão de TGFB3 poderiam participar do mecanismo antiproliferativo da progesterona e dos progestogênios sobre o endométrio humano in vivo. / Growth factors anci protooncogenes are involveci in the mechanism of sex steroicistirnulateci growth anci ciifferentiation of the enciometriurn, but their precise regulation remains unclear. The aim of the present stuciy was to evaluate the influence of menstrual cycle anci the effects of meciroxyprogesterone acetate (MP A) on the expression of prolactin (PRL), c-los anci transforrning growth factor beta (TGFI3) in the hurnan enciometriurn in vivo. Forty-six cycling women were ranciomizeci to receive either 10 mg MPA or placebo, once a ciay ciuring 10 ciays. Enciometrial specirnens were obtaineci about 8-12 hours following the last tablet intake anci patients were classifieci into three groups accorciing to biopsy ciating anci treatment: Proliferative/Placebo (group 1, N=ll), Secretory /Piacebo (group 2, N=18) anci Secretory /MP A (group 3, N=8). Enciometrial sampies were partially snap-frozen in liquici nitrogen anci partially fixeci in formalin, embecicieci in paraffin anci staineci by irnrnunohistochemistry. Messenger ribonucleic acici (rnRNA) leveis were assessed by reverse transcriptidase polymerase chain reaction (RT-PCR). Irnmunoreactive PRL was found in the epithelium of 9.1% of the specirnens from group 1, in 55.6% of group 2, anci in 100% of group 3 (p<0.05, Fisher's exact test). In the enciometrial stroma, immunopositive PRL was present in 9.1%, 66.7% anci 87.5% of the specirnens from groups 1, 2 anci 3, respectively (p<0.01). The average leveis of PRL mRNA were slightiy increaseci in group 2 anci markecily increaseci in group 3 compareci to group 1 (p<0.05). Irnrnunoreactive c-los was concentrateci in the nucleus of stromal cells in 54.5% of the biopsies from group 1, in 7.1% of group 2, and in 0% of group 3 (p<0.05, group 1 vs 2 and 3). The leveis of c-los mRNA were greatly reciuceci in groups 2 anci 3 compareci to group 1 (p<0.05) anci correlateci positiveiy with serum estraciiollevels (r=0.56, p<0.02). There were no ciifferences between groups conceming to the enciometrial expression of TGFI31. However, the frequency of immunopositive samples for TGFB3 anci the leveis of TGFB3 rnRNA were higher in groups 2 anci 3 compareci to group 1. 1t is conclucieci that MP A induces PRL anci TGFB3 and inhibits c-los expression in endometrial cells in vivo, resembling what occurs ciuring the secretory phase of spontaneous ovulatory cycles. The inhibition of c-los and the increase of TGFB3 expression may contribute to the antiproliferative effect of progestins on the endometriurn.

S179D prolactina (hPRL) é uma mímica molecular da prolactina humana fosforilada. Demonstrou-se que a S179D-hPRL era anti angiogênica nos ensaios de angiogênese baseados na membrana corialantóica de galinha e na córnea de camundongos. Investigações posteriores realizadas empregando modelos in vitro demonstraram que o tratamento com S179D-hPRL diminuiu o número de células viáveis, reduziu a formação de túbulos em Matrigel e interferiu com a migração e invasão da matriz extracelular. A análise dos fatores de crescimento de células endoteliais humanas tratadas com S179D-hPRL revelou: uma diminuição na expressão ou liberação da PRL endógena, da heme-oxigenase-1, do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e um aumento na expressão de dois inibidores teciduais de metaloproteases. A S179D-hPRL também bloqueou a sinalização provocada por bFGF nessas células. Nós concluímos que essa mímica molecular do hormônio pituitário fosforilado é uma potente proteína anti-angiogênica, em parte devido á sua habilidade de reduzir o estímulo autócrino de fatores de crescimento de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), por sua capacidade de bloquear a sinalização promovida pelo bFGF e por sua habilidade de interferir na migração endotelial. Também foi estudada a influência da S179D-hPRL na apoptose em células endoteliais humanas, empregando caspase-8 como um marcador da via extrínseca, e a liberação de citocromo C como um marcador da via intrínseca. As duas cascatas convergem na ativação da caspase-3, que cliva a fator de fragmentação de DNA (DFF45). Uma incubação de três dias com 50 ng/mL de S179D-hPRL quadruplicou o número de células apoptóticas; esse efeito duplicou-se com uma concentração de 100 ng/mL e atingiu um ápice com 500 ng/mL. A clivagem de DFF45 e da pro-caspase-8 foi detectado com 100 ng/mL. Citocromo C, porém, só foi observado com concentrações de 500 ng/mL. O regulador de ciclo celular p21 (um marcador pró-apoptótico) elevou-se com 100 ng/mL, enquanto que um incremento do supressor tumoral p53 necessitou três vezes o tempo de incubação e 500 ng/mL. A atividade do promotor de p21 foi máxima com 50 ng/mL do análogo de hPRL, enquanto que 500 ng/mL foram necessários para se visualizar uma alteração significativa na atividade do promotor de Bax (um indicador da atividade de p53). Como previamente demonstrado na literatura, S179D-hPRL bloqueou a fosforilação da quinase regulada extracelularmente (ERK) em resposta ao bFGF, mas também causou uma ativação tardia e prolongada da ERK. PD 98059 [inibidor específico da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPkinase)] inibiu essa ativação tardia e sustentada assim como outros efeitos da S179D-hPRL, exceto aquele sobre a indução de p53 e ativação do promotor de Bax. Podemos concluir que baixas doses de S179D-hPRL bloqueiam a sinalização de ERK induzida por bFGF e concomitantemente ativam a ERK em um tempo diferente, resultando na elevação de p21 e ativando a via extrínseca de apoptose. Maiores tempos de incubação e concentração, entretanto, ativam a via intrínseca empregando uma cascata intracelular diferente. Esses achados sugerem que níveis circulantes de PRL fosforilada podem inibir a progressão do câncer e, portanto, S179D-hPRL poderia ser um agente anti-angiogênico útil na terapêutica. / S179D-prolactin (hPRL) is an experimentally useful mimic of naturally phosphorylated human prolactin. S179D-hPRL, but not unmodified PRL, was found to be anti-angiogenic in both the chorioallantoic membrane and corneal assays. Further investigation using human endothelial in vitro models showed reduced cell number, reduced tubule formation in Matrigel, and reduced migration and invasion, as a function of treatment with S179D-hPRL. Analysis of growth factors in human endothelial cells in response to S179D-hPRL showed a decreased expression or release of endogenous PRL, heme-oxygenase-1, basic fibroblast growth factor (bFGF), angiogenin, epidermal growth factor and vascular endothelial growth factor and an increased expression of inhibitors of matrix metalloproteases. S179D-hPRL also blocked signaling from bFGF in these cells. We conclude that this molecular mimic of a pituitary hormone is a potent anti-angiogenic protein, partly as a result of its ability to reduce utilization of several well-established endothelial autocrine growth loops, partly by its ability to block signaling from bFGF and partly because of its ability to decrease endothelial migration. We also examined the influence of S179D-hPRL on apoptosis in human endothelial cells, using procaspase-8 as a marker of the extrinsic pathway, and cytochrome C release as a marker of the intrinsic pathway. Both pathways converge at caspase-3, which cleaves DNA fragmentation factor (DFF45). A 3-day incubation with 50 ng/ml S179D-hPRL quadrupled the early apoptotic cells; this effect was doubled at 100 ng/ml and maximal at 500 ng/ml. DFF45 and pro-caspase 8 cleavage were detectable at 100 ng/ml. Cytochrome C, however, was unaffected until 500 ng/ml. p21 increased at 100 ng/ml, whereas a change in p53 activity required both triple the time and 500 ng/ml. p21 promoter activity was maximal at 50 ng/ml, whereas 500 ng/ml were required to see a significant change in the Bax promoter (a measure of p53 activity). As previously shown, S179D-hPRL blocked extracelular regulated kinase (ERK) phosphorylation in response to bFGF, but, in addition, continued co-incubation showed a delayed and prolonged activation of ERK. PD98059 [a specific mitogen-activated protein kinase (MAPkinase) inhibitor] inhibited this delayed activation of ERK and the effects of S179D-hPRL on all parameters except p53, or activity of the Bax promoter. We conclude that low doses of S179D-hPRL block bFGF-induced ERK signaling and yet activates ERK in a different time frame to elevate p21, and activate the extrinsic pathway. Longer incubations and higher concentrations, however, additionally activate the intrinsic pathway using an alternate intracellular signal. These findings suggest that circulating levels of phosphorylated hPRL may reduce the progression of cancer and, furthermore, that S179D-hPRL may be a useful anti-angiogenic therapeutic.

S179D prolactina (hPRL) é uma mímica molecular da prolactina humana fosforilada. Demonstrou-se que a S179D-hPRL era anti angiogênica nos ensaios de angiogênese baseados na membrana corialantóica de galinha e na córnea de camundongos. Investigações posteriores realizadas empregando modelos in vitro demonstraram que o tratamento com S179D-hPRL diminuiu o número de células viáveis, reduziu a formação de túbulos em Matrigel e interferiu com a migração e invasão da matriz extracelular. A análise dos fatores de crescimento de células endoteliais humanas tratadas com S179D-hPRL revelou: uma diminuição na expressão ou liberação da PRL endógena, da heme-oxigenase-1, do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e um aumento na expressão de dois inibidores teciduais de metaloproteases. A S179D-hPRL também bloqueou a sinalização provocada por bFGF nessas células. Nós concluímos que essa mímica molecular do hormônio pituitário fosforilado é uma potente proteína anti-angiogênica, em parte devido á sua habilidade de reduzir o estímulo autócrino de fatores de crescimento de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), por sua capacidade de bloquear a sinalização promovida pelo bFGF e por sua habilidade de interferir na migração endotelial. Também foi estudada a influência da S179D-hPRL na apoptose em células endoteliais humanas, empregando caspase-8 como um marcador da via extrínseca, e a liberação de citocromo C como um marcador da via intrínseca. As duas cascatas convergem na ativação da caspase-3, que cliva a fator de fragmentação de DNA (DFF45). Uma incubação de três dias com 50 ng/mL de S179D-hPRL quadruplicou o número de células apoptóticas; esse efeito duplicou-se com uma concentração de 100 ng/mL e atingiu um ápice com 500 ng/mL. A clivagem de DFF45 e da pro-caspase-8 foi detectado com 100 ng/mL. Citocromo C, porém, só foi observado com concentrações de 500 ng/mL. O regulador de ciclo celular p21 (um marcador pró-apoptótico) elevou-se com 100 ng/mL, enquanto que um incremento do supressor tumoral p53 necessitou três vezes o tempo de incubação e 500 ng/mL. A atividade do promotor de p21 foi máxima com 50 ng/mL do análogo de hPRL, enquanto que 500 ng/mL foram necessários para se visualizar uma alteração significativa na atividade do promotor de Bax (um indicador da atividade de p53). Como previamente demonstrado na literatura, S179D-hPRL bloqueou a fosforilação da quinase regulada extracelularmente (ERK) em resposta ao bFGF, mas também causou uma ativação tardia e prolongada da ERK. PD 98059 [inibidor específico da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPkinase)] inibiu essa ativação tardia e sustentada assim como outros efeitos da S179D-hPRL, exceto aquele sobre a indução de p53 e ativação do promotor de Bax. Podemos concluir que baixas doses de S179D-hPRL bloqueiam a sinalização de ERK induzida por bFGF e concomitantemente ativam a ERK em um tempo diferente, resultando na elevação de p21 e ativando a via extrínseca de apoptose. Maiores tempos de incubação e concentração, entretanto, ativam a via intrínseca empregando uma cascata intracelular diferente. Esses achados sugerem que níveis circulantes de PRL fosforilada podem inibir a progressão do câncer e, portanto, S179D-hPRL poderia ser um agente anti-angiogênico útil na terapêutica. / S179D-prolactin (hPRL) is an experimentally useful mimic of naturally phosphorylated human prolactin. S179D-hPRL, but not unmodified PRL, was found to be anti-angiogenic in both the chorioallantoic membrane and corneal assays. Further investigation using human endothelial in vitro models showed reduced cell number, reduced tubule formation in Matrigel, and reduced migration and invasion, as a function of treatment with S179D-hPRL. Analysis of growth factors in human endothelial cells in response to S179D-hPRL showed a decreased expression or release of endogenous PRL, heme-oxygenase-1, basic fibroblast growth factor (bFGF), angiogenin, epidermal growth factor and vascular endothelial growth factor and an increased expression of inhibitors of matrix metalloproteases. S179D-hPRL also blocked signaling from bFGF in these cells. We conclude that this molecular mimic of a pituitary hormone is a potent anti-angiogenic protein, partly as a result of its ability to reduce utilization of several well-established endothelial autocrine growth loops, partly by its ability to block signaling from bFGF and partly because of its ability to decrease endothelial migration. We also examined the influence of S179D-hPRL on apoptosis in human endothelial cells, using procaspase-8 as a marker of the extrinsic pathway, and cytochrome C release as a marker of the intrinsic pathway. Both pathways converge at caspase-3, which cleaves DNA fragmentation factor (DFF45). A 3-day incubation with 50 ng/ml S179D-hPRL quadrupled the early apoptotic cells; this effect was doubled at 100 ng/ml and maximal at 500 ng/ml. DFF45 and pro-caspase 8 cleavage were detectable at 100 ng/ml. Cytochrome C, however, was unaffected until 500 ng/ml. p21 increased at 100 ng/ml, whereas a change in p53 activity required both triple the time and 500 ng/ml. p21 promoter activity was maximal at 50 ng/ml, whereas 500 ng/ml were required to see a significant change in the Bax promoter (a measure of p53 activity). As previously shown, S179D-hPRL blocked extracelular regulated kinase (ERK) phosphorylation in response to bFGF, but, in addition, continued co-incubation showed a delayed and prolonged activation of ERK. PD98059 [a specific mitogen-activated protein kinase (MAPkinase) inhibitor] inhibited this delayed activation of ERK and the effects of S179D-hPRL on all parameters except p53, or activity of the Bax promoter. We conclude that low doses of S179D-hPRL block bFGF-induced ERK signaling and yet activates ERK in a different time frame to elevate p21, and activate the extrinsic pathway. Longer incubations and higher concentrations, however, additionally activate the intrinsic pathway using an alternate intracellular signal. These findings suggest that circulating levels of phosphorylated hPRL may reduce the progression of cancer and, furthermore, that S179D-hPRL may be a useful anti-angiogenic therapeutic.

Mulheres férteis com endometriose apresentaram níveis séricos do hormônio do crescimento superiores se comparados com mulheres férteis sem endometriose 15 minutos após infusão de TRH. Estes resultados indicam uma alteração na secreção de prolactina e estrógenos em mulheres com infertilidade e endometriose, provavelmente repercutindo em uma alteração na fase lútea comprovada por biópsia endometrial e progesterona sérica. Estas alterações hormonais relacionam-se e podem explicar a causa da infertilidade neste grupo de mulheres sem dano tubário.

No final da gestação e nos primeiros dias da lactação, as fêmeas passam por importantes mudanças hormonais e comportamentais que induzem e permitem a nutrição e cuidado da prole. O início da responsividade maternal aos filhotes depende da elevação das concentrações de progesterona (P4), estradiol (E2), e prolactina (PRL) durante a gestação, seguida pela queda da P4 no parto. Em ratos, o comportamento maternal pode ser observado com alta freqüência durante as duas primeiras semanas após o parto. Além de apresentarem comportamento maternal, ratas lactantes são altamente agressivas neste mesmo período e apresentam uma significativa redução da ansiedade. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel dos hormônios gonadais na modulação dos comportamentos maternal, agressivo maternal e de ansiedade/medo de ratas lactantes. Para isso, as mesmas foram ovariectomizadas (OVX) ou sham OVX (SHAM) no 1º dia pós-parto e foram realizados registros do comportamento maternal, agressivo maternal além dos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto.Além disso, foram verificadas as concentrações plasmáticas de P4 e PRL das ratas lactantes e o peso das ninhadas visando o controle nutricional dos filhotes. A gonadectomia reduziu a freqüência dos comportamentos maternal e agressivo maternal, mas eles continuaram presentes e os filhotes ganharam peso normalmente. A redução significativa dos hormônios gonadais provocou um moderado aumento da ansiedade de fêmeas lactantes, e aumentou a secreção de PRL. Estes resultados indicam que os hormônios gonadais não são essenciais para o aumento de atividades maternais dirigidas aos filhotes, aumento da agressividade materna contra intrusos que se aproximam da área do ninho e redução da ansiedade observados em fêmeas lactantes, ou que estes hormônios atuam antes do parto. A primeira hipótese é improvável, considerando os estudos bem documentados que mostram que os hormônios gonadais exercem um importante efeito sobre estes comportamentos. Assim, nós podemos concluir que os hormônios das gônadas provocam alterações sobre os comportamentos de ratas lactantes atuando durante a gestação e o no parto. Além disso, durante a lactação, os hormônios gonadais parecem exercer um efeito inibitório sobre a secreção de PRL.

Mulheres férteis com endometriose apresentaram níveis séricos do hormônio do crescimento superiores se comparados com mulheres férteis sem endometriose 15 minutos após infusão de TRH. Estes resultados indicam uma alteração na secreção de prolactina e estrógenos em mulheres com infertilidade e endometriose, provavelmente repercutindo em uma alteração na fase lútea comprovada por biópsia endometrial e progesterona sérica. Estas alterações hormonais relacionam-se e podem explicar a causa da infertilidade neste grupo de mulheres sem dano tubário.

No final da gestação e nos primeiros dias da lactação, as fêmeas passam por importantes mudanças hormonais e comportamentais que induzem e permitem a nutrição e cuidado da prole. O início da responsividade maternal aos filhotes depende da elevação das concentrações de progesterona (P4), estradiol (E2), e prolactina (PRL) durante a gestação, seguida pela queda da P4 no parto. Em ratos, o comportamento maternal pode ser observado com alta freqüência durante as duas primeiras semanas após o parto. Além de apresentarem comportamento maternal, ratas lactantes são altamente agressivas neste mesmo período e apresentam uma significativa redução da ansiedade. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel dos hormônios gonadais na modulação dos comportamentos maternal, agressivo maternal e de ansiedade/medo de ratas lactantes. Para isso, as mesmas foram ovariectomizadas (OVX) ou sham OVX (SHAM) no 1º dia pós-parto e foram realizados registros do comportamento maternal, agressivo maternal além dos testes de labirinto em cruz elevado e campo aberto.Além disso, foram verificadas as concentrações plasmáticas de P4 e PRL das ratas lactantes e o peso das ninhadas visando o controle nutricional dos filhotes. A gonadectomia reduziu a freqüência dos comportamentos maternal e agressivo maternal, mas eles continuaram presentes e os filhotes ganharam peso normalmente. A redução significativa dos hormônios gonadais provocou um moderado aumento da ansiedade de fêmeas lactantes, e aumentou a secreção de PRL. Estes resultados indicam que os hormônios gonadais não são essenciais para o aumento de atividades maternais dirigidas aos filhotes, aumento da agressividade materna contra intrusos que se aproximam da área do ninho e redução da ansiedade observados em fêmeas lactantes, ou que estes hormônios atuam antes do parto. A primeira hipótese é improvável, considerando os estudos bem documentados que mostram que os hormônios gonadais exercem um importante efeito sobre estes comportamentos. Assim, nós podemos concluir que os hormônios das gônadas provocam alterações sobre os comportamentos de ratas lactantes atuando durante a gestação e o no parto. Além disso, durante a lactação, os hormônios gonadais parecem exercer um efeito inibitório sobre a secreção de PRL.