O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica, caracterizada pela desregulação glicêmica, que ocorre devido a um ataque autoimune. A insulinoterapia é o tratamento clássico para o DM1. Contudo, alguns pacientes que apresentam essa doença não respondem de forma eficiente a este tratamento e apresentam episódios frequentes de hipoglicemia severa e despercebida (pacientes hiperlábeis). Essas complicações comprometem de forma significativa a qualidade de vida dessas pessoas. O transplante de ilhotas é uma importante alternativa para o tratamento de pacientes hiperlábeis com DM1. No entanto, essa terapia apresenta restrições como a necessidade de mais de um doador por transplante e significativa morte das ilhotas devido ao estresse provocado pelo procedimento de isolamento, além da morte promovida pelo sistema imune do paciente nos primeiros momentos pós-transplante. A autofagia é um mecanismo de reciclagem de componentes citoplasmáticos que é fundamental para a homeostase celular. Em condições de estresse, este mecanismo é ativado acima do seu nível basal, promovendo a degradação de agregados proteicos e organelas defeituosas, evitando assim, danos celulares que comprometam a viabilidade da célula. Trabalhos realizados por nosso grupo têm mostrado a citoproteção que PRL promove em células-beta, reduzindo a apoptose induzida por citocinas pró-inflamatórias. Também demonstramos o papel essencial de HSPB1 na inibição de apoptose induzida por PRL após o tratamento com citocinas. Além disso, resultados recentes de nosso laboratório mostraram um aumento nos níveis de autofagia em células-beta após sua exposição a citocinas, bem como uma restauração a níveis normais na presença de PRL. Visando um melhor entendimento do papel da PRL na modulação da autofagia em células-beta, o objetivo desse projeto foi estudar se HSPB1 também é essencial no mecanismo de regulação da autofagia induzido por PRL.Para tal, fizemos experimentos em modelos de células-beta MIN6, MIN6 silenciadas para HSPB1 (MIN6-shHSPB1) e MIN6 com sequencia short hairpin aleatória (MIN6- SsC), medindo a morte celular através de ensaios de viabilidade, e ensaios de western blot para avaliar os níveis de marcadores de autofagia e fluxo autofágico (degradação de autofagossomos), tratando as células com citocinas, prolactina e indutores ou inibidores de autofagia. Os resultados mostraram que a modulação da autofagia ocasionada pela prolactina em células-beta se dá, em parte, através de HSPB1. O tratamento com prolactina foi capaz de inibir a morte celular induzida por citocinas, mesmo na presença de cloroquina, um bloqueador de autofagia, o que nos levou a concluir que a autofagia não é uma via envolvida na citoproteção de células beta induzida por PRL. Os resultados gerados nesse estudo contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos moleculares induzidos por PRL em células-beta, e poderão permitir a inferência de novas abordagens que melhorem a citoproteção, cultura e transplante dessas células em pacientes com diabetes tipo 1. / Type 1 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by glycemic dysregulation, which occurs due to an autoimmune destruction of beta-cells. Insulin therapy is the gold standard treatment for DM1. However, some DM1 patients do not respond efficiently to this treatment and suffer frequent episodes of severe hypoglycemia unawareness. Since this complication jeopardizes the quality of life of these people, Islet transplantation is a therapeutic alternative indicated to treat these patients. However, besides the lack of enough organ donors, the loss of beta cells during both the isolation as well as the infusion of islets into the recipient induce a great estresse and thus a significant cell death is one of the drawbacks of this procedure. Autophagy is a mechanism of recycling cytoplasmic components and is essential for cellular homeostasis. Under estresse conditions, this mechanism is activated above basal levels, promoting the degradation of protein aggregates and defective organelles, thus avoiding cell damage that could compromise cell viability. Studies carried out by our group have shown not only that PRL promotes cytoprotection in beta-cells, reducing pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, but also that HSPB1 plays an essential role in this inhibition of apoptosis mediated by PRL after treatment with cytokines. Moreover, recent results from our laboratory showed an increase in autophagy levels in beta-cells after exposure to cytokines, as well as a restauration to normal levels in the presence of PRL. In order to better understand the role of PRL in the modulation of autophagy in these cells, the aim of this project is to study whether HSPB1 is also essential in the mechanism of autophagy regulation induced by PRL. Using MIN6 beta cell models where HSPB1 was silenced (MIN6-shHSPB1) or not (MIN6-SsC), we studied cell death by viability assays. Moreover, western blot assays were performed in order to assess levels of autophagy and autophagic flux markers in the cells.Our results showed that HSPB1 in one of the mediators of PRL-induced modulation of autophagy. Nevertheless, since hormonal treatment was still able to inhibit cytokinesinduced cell death even in the presence of chloroquin, an autophagy blocker, we conclude that autophagy is not a signaling pathway involved in PRl-induced beta-cell cytoprotection. Altogether, the results shown in this study may help to increase the knowledge of the molecular events induced by PRL in beta-cells, and may allow to infer new approaches to improve cytoprotection, culture and transplantation of these cells into type 1 diabetic patients.

A sepse é caracterizada por ser um processo inflamatório sistêmico devido a uma infecção, levando a lesão pulmonar aguda, síndrome do desconforto respiratório agudo e a falência múltipla dos orgãos. São achados histopatológicos da sepse: edema intersticial e alveolar, acúmulo de neutrófilos e macrófagos, hemorragia, lesão endotelial e do epitélio alveolar, e colapso alveolar. Acredita-se que a prolactina, hormônio produzido nas células lactotróficas da hipófise interfira no processo inflamatório, ora estimulando-o, ora inibindo-o. Além da relação direta com a lactação, este hormônio tem sido considerado um importante modulador do sistema imune, estimulando a proliferação e a sobrevivência celular. No presente estudo, buscou-se determinar os aspectos morfofuncionais do pulmão comprometido pela sepse induzida pela ligação e perfuração do ceco (CLP) em ratos com hiperprolactinemia induzida por sulpiride, um antagonista da dopamina. O presente estudo mostrou que os ratos pré-tratados com salina e submetidos a CLP, desenvolveram o padrão morfológico da sepse como por exemplo, aumento nas células inflamatórias com predomínio dos polimorfonucleares (neutrófilos), edema intersticial e colapso alveolar. Além disso, o presente estudo mostrou que a sepse induzida por CLP produziu diminuição da pressão arterial média bem como queda em alguns parâmetros ventilatórios como por exemplo, volume corrente e volume pulmonar em ratos não anestesiados. Interessante observação foi que grupos de ratos pré-tratados com sulpiride e submetidos a CLP apresentaram um maior comprometimento nos achados morfológicos bem como uma potencialização na queda do volume corrente durante a análise ventilatória. O presente estudo sugere que a hiperprolactinemia deve ser atentamente observada, pela estreita relação com o agravamento do processo inflamatório provocado por uma infecção pré-existente, que resultaria no aumento do número de óbitos em pacientes sépticos. / Sepsis is characterized as a systemic inflammatory process due to an infection, leading to acute lung injury, acute respiratory distress syndrome and multiple organs failure. Histopathological findings of sepsis are: interstitial and alveolar edema, accumulation of neutrophils and macrophages, hemorrhage, endothelial and alveolar epithelial injury and alveolar collapse. It is believed that prolactin, a hormone produced by pituitary lactotroph cells, interferes on the inflammatory process, sometimes stimulating it and sometimes inhibiting it. In addition to the direct relationship on lactation, this hormone has been observed to play important role on the modulation of the immune system, stimulating the cell proliferation and cell survival. In the present study, we sought to determine the morphofunctional aspects of compromised lung during sepsis induced by cecal ligation and perforation (CLP) in rats with hyperprolactinemia induced by sulpiride, a dopamine antagonist. The present study showed that pretreated rats with saline and subjected to CLP developed the morphogical pattern of sepsis such as increase in inflammatory cells with predominance of polymorphonuclear cells, interstitial edema and alveolar collapse. In addition, this study showed that sepsis induced by CLP produced a decrease in mean arterial pressure and decrease in ventilatory parameters such as tidal and pulmonary volume in unanesthetized rats. An interesting observation was that pretreated rats with sulpiride and subjected to CLP had a greater impairment in the morphological findings as well as an increase in the fall of the tidal volume during the ventilation analysis. The present study suggests that the hyperprolactinemia should be closely observed by a close relationship with the worsening of the inflammatory process caused by a pre-existing infection, which would result in increasing the number of deaths in septic patients.

Não é claro como o receptor de glicocorticóide (GR) contrarregula a atividade do STAT5 na transição da gestação para a lactação. Dexras1 é uma pequena proteína G ativada por dexametasona (DEX), que regula morfologia celular, crescimento, etc. Neste estudo detectamos a expressão de Dexras1 em células beta de ilhotas pancreáticas. DEX induz a expressão de Dexras1 em células RINm5F, que está aumentada na gestação e diminuída na lactação. A expressão protéica de 11<font face=\"Symbol\">&#946HSD1, enzima ativadora de glicocorticóides (GCs), segue esse perfil. A ligação tanto do GR como do STAT5, analisada por ChIP assay, ao promotor do gene da Dexras1 aumentada por DEX é revertida por prolactina (PRL), e está diminuída e aumentada na gestação e lactação, respectivamente. DEX induz a associação ao GR, fosforilação e translocação nuclear do STAT5b. O silenciamento gênico de Dexras1 promoveu aumento da secreção de insulina, e aumentou os níveis de pERK1/2, pCREB, pPKC<font face=\"Symbol\">&#948 e PKA. Sendo assim, a regulação de Dexras1 por PRL e GCs contribui para a secreção de insulina característica do periparto. / It is not clear how glucocorticoid receptor (GR) counteracts STAT5 activity during the transition of pregnancy to lactation. Dexras1 is a small G protein activated by dexamethasone (DEX) that controls cell morphology, growth, etc. In the present study we detected Dexras1 expression in pancreatic beta cell. DEX induces Dexras1 expression in RINm5F cells, which is increased in pregnancy and decreased in lactation. The expression of 11<font face=\"Symbol\">&#946HSD1, the glucocorticoids (GCs) activating enzyme, followed Dexras1 profile in pancreatic islet. Both GR and STAT5b bindings to Dexras1 gene promoter, analyzed by ChIP assay, are increased by DEX and PRL counteracts this effect. Both bindings are decreased in pregnancy and increased in lactation. DEX induces STAT5b association to GR, phosphorylation and nuclear translocation. Dexras1 knockdown using small interference RNA (si-RNA) promoted an increase in insulin secretion, as well as increased levels of pERK1/2, pCREB, pPKC<font face=\"Symbol\">&#948 and PKA. Thus, Dexras1 regulation by PRL and GCs contributes to insulin secretion during peripartum.

Haloperidol é um antagonista de receptor D2 de dopamina freqüentemente utilizado na clínica para tratamento de pacientes esquizofrênicos. Haloperidol aumenta a liberação de prolactina pela glândula pituitária anterior, e a prolactina é um fator capaz de modular a atividade do sistema imune. Grupos de seis ratos machos e fêmeas receberam tratamento agudo de 2mg/kg de haloperidol (E1), tratamento prolongado com haloperidol (E2) (2mg/kg/dia por 21 dias); retirada abrupta do tratamento prolongado com haloperidol (E3), ou ainda tratamento agudo com 6mg/kg de haloperidol (E4). Os animais controle receberam tratamento similar com veículo de diluição (grupos C1, C2 e C3 respectivamente). Neste trabalho, o tratamento prolongado com haloperidol (E2) aumentou a atividade de macrófagos, aumentando o espraiamento, a fagocitose e a liberação de NO em ratos machos e fêmeas. O tratamento agudo com 2mg/kg de haloperidol (E1) não foi capaz de alterar a atividade de macrófagos, porém a dose de 6mg/kg (E4) aumentou o espraiamento e a fagocitose. Os tratamentos agudo (E1) e prolongado (E2) com haloperidol aumentaram os níveis plasmáticos de corticosterona e de prolactina tanto em machos quanto em fêmeas. Os macrófagos de ratos machos e fêmeas apresentam os mesmos padrões de alterações após os tratamentos com haloperidol, exceto para produção de H2O2 que foi maior apenas para as fêmeas dos grupos C3 e E3. Discutiu-se de que maneira o haloperidol induz ativação de macrófagos, se por uma forma indireta através do aumento nos níveis de prolactina, ou alternativamente, sendo esta ativação uma conseqüência da ação direta do haloperidol sobre os receptores de dopamina dos macrófagos. / Haloperidol is a receptor D2 antagonist frequently used in the treatment of schizophrenic patients. Haloperidol increased prolactin release from anterior pituitary gland, and prolactin modulates immune system activity. Groups of six male and female rats received acute 2mg/kg haloperidol treatment (E1), long-term (E2) haloperidol treatment (2mg/kg/day for 21 days); abrupt withdrawal of long-term (E3) haloperidol treatment, or acute 6mg/kg haloperidol treatment (E4). Control rats were treated similarly, but with vehicle (groups C1, C2 and C3 respectively). In this work long-term haloperidol treatment (E2) increased macrophage spreading, phagocytosis and NO release in male and female rats. Acute 2mg/kg haloperidol treatment (E1) didn?t change macrophage activity, however, the 6mg/kg dose (E4) increased macrophage spreading and phagocytosis. Corticosterone and prolactin serum levels were increased after acute (E1) and long-term (E2) haloperidol treatments in male and female rats. Macrophage of male and female rats presented the same pattern of alterations after acute and long-term haloperidol treatments, except for production of H2O2 that was larger just for the females of the groups C3 and E3. Haloperidol-induced macrophage activation was discussed in the light of a possible indirect effect through prolactin increments in rats, or, alternatively, as a consequence of a direct action of macrophage dopamine receptor.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-03-04T19:38:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EfeitosProtetoresProlactina.pdf: 2122822 bytes, checksum: 256fe6cc19504faabe9c869a4b103ad8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-03-05T15:51:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EfeitosProtetoresProlactina.pdf: 2122822 bytes, checksum: 256fe6cc19504faabe9c869a4b103ad8 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:51:31Z (GMT). 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Este estudo teve por objetivo investigar efeitos protetores da prolactina sobre distúrbios provocados por MeHg na viabilidade, morfologia, expressão de GFAP (glial fibrillary acidic protein), mitogênese e liberação de interleucina-1β (IL-1 β) em cultivo glial de córtex cerebral de ratos neonatos focalizando as células astrogliais. A exposição a diferentes concentrações de MeHg (0,1, 1, 5 e 10 μM) a diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6, 18 e 24 h) ocorreu em cultivos com 10% de soro fetal bovino (SFB). Os resultados obtidos demonstraram diminuição progressiva de 20% e 62% da viabilidade celular após exposição às concentrações de 5 e 10 μM MeHg no tempo de 24 h, respectivamente, pelo método do 3-4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio bromide (MTT) e distúrbios na expressão e distribuição de GFAP. Diferentes concentrações de prolactina (0.1, 1 e 10 nM) foram adicionadas em meio sem soro fetal bovino (FBS) para avaliar sua ação proliferativa isoladamente. Esta ação foi confirmada com indução de mitogênese em cerca de 4.5x em 18 h de observação na maior concentração (10 nM PRL). Nestas condições (sem SFB) foram analisados os efeitos da associação de 1 nM PRL + 5μM MeHg em teste de viabilidade, expressão de GFAP, morfologia celular, índice mitótico e liberação de IL-1β com o objetivo de estudar possíveis efeitos citoprotetores deste hormônio. A PRL atenuou os distúrbios provocados pelo MeHg, aumentando a viabilidade em 33%, a expressão de GFAP, proliferação celular (4x) e atenuando os distúrbios morfológicos, incluindo picnose nuclear e lise. Adicionalmente, a PRL induziu amplificação da liberação de IL1β quando associada ao MeHg. Estes achados confirmam a hipótese de que a PRL possa atuar como um agente citoprotetor em cultura primária de glia e particulamente em astrócitos, ação esta aditiva aos seus efeitos mitogênicos. / Methylmercury (MeHg) is a compound highly neurotoxic and its degenerative mechanisms are not very clear yet. In Central Nervous System, MeHg is mostly uptake by astrocytes, decreasing neuronal exposition. Studies demonstrated that prolactin (PRL) has mitogenic effects on astrocytes and it can regulate pro-inflammatories cytokines expression. The aim of this work was to verify the protective effects of PRL on disturbs provoked by MeHg on cellular viability, morphology, GFAP (glial fibrillary acidic protein) expression, mitogenesis and release of interleukin-1β in glia primary culture of cerebral cortex of newborn rats, with astrocytes in focus. Glia primary culture were exposed to differents concentrations of MeHg (0,1, 1, 5 e 10 μM) in differents time intervals (2, 4, 6, 18 e 24 h) in medium with fetal bovine serum 10%. Results demonstrated progressive decreasing of 20% e 62% on cellular viability after exposed to 5 e 10 μM MeHg for 24 h, respectively, by MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay and disturbs in the GFAP expression and distribution. Differents concentrations of PRL (0.1, 1 e 10 nM) were added in free serum medium to evaluate it proliferative action. This was confirmed by mitogenesis induction around 4.5x in 18h at 10 mM PRL. In this conditions (free serum) were evaluated the effects of co-treatment of 1 nM PRL + 5 μM MeHg on cellular viability, morphology, GFAP expression, mitotic index and release of IL-1β. PRL attenuated disturbs caused by MeHg, increasing viability in 33%, GFAP expression, cellular proliferation (4x), and attenuating morphologic alterations like nuclear picnosis and lisis. These findings prove that PRL can act like a cytoprotective agent in primary culture of glia, particularly in astrocytes, in addition to its mitogenic effects.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-12-04T17:58:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoEfeitoProtetor.pdf: 1613941 bytes, checksum: 367436baf933f8daa67c171995e6584b (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-12-05T16:29:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoEfeitoProtetor.pdf: 1613941 bytes, checksum: 367436baf933f8daa67c171995e6584b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-05T16:29:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoEfeitoProtetor.pdf: 1613941 bytes, checksum: 367436baf933f8daa67c171995e6584b (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O mercúrio pode ser encontrado em diversas formas, sendo a orgânica como metilmercúrio (MeHg), considerada a mais tóxica. Facilmente absorvido por via oral, se acumula na cadeia trófica e se amplifica em carnívoros aquáticos, principalmente em peixes, daí o risco maior para as populações que deles se alimentam preferencialmente, como os ribeirinhos Amazônidas. O efeito neurotóxico dessa forma de mercúrio tem sido amplamente demonstrado através de estudos epidemiológicos e experimentais. Alguns desses estudos também mostraram que hormônios e substâncias antioxidantes podem agir protegendo o organismo contra a ação deletéria do mercúrio. A prolactina é um destes hormônios que apresenta ação protetora, mas age também como citocina pró-inflamatória. Desde que o MeHg pode também agir como uma substância imunotóxica, procuramos neste trabalho estudar a ação citoprotetora da PRL em cultivos contínuos de linhagem B95-A de linfócitos de primata afim de avaliar sua fragilidade ao MeHg e sua reatividade a ação da PRL. Com o objetivo de avaliar a integridade funcional dos linfócitos expostos ao MeHg utilizou-se teste de reação colorimétrica para 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio bromide (MTT), o qual detecta atividade metabólica mitocondrial. Para avaliar a resposta imune do linfócito, medidas da concentração do fator de necrose tumoral alfa (TNF α) no sobrenadante do cultivo, foram realizadas por ELISA. É uma citocina pró-inflamatória liberada em resposta a agressão celular de diferentes causas, incluindo estresse oxidativo, um dos efeitos agudos mais evidentes do MeHg, além disso, esta citocina também poder responder a regulação prolactinérgica em linfócitos humanos. Após 18 horas de exposição do cultivo a crescentes concentrações do metal (0,1; 1, 5, 10 e 50 μM) verificou-se significativa diminuição do tipo dose-dependente da viabilidade celular a partir de 1 μM (35%) e progressivamente até 50 μM (80%), quando poucas células íntegras foram encontradas nos cultivos. Um efeito bifásico em forma de “sino” ocorreu na liberação de TNF α, onde concentrações mais baixas de MeHg inibiram (0,1 e 1 μM), a intermediária estimulou (5 μM) e as duas maiores (10 e 50 μM) voltaram a inibir. A prolactina também diminuiu a viabilidade celular, em cerca de 30%, somente na dose mais elevada (10 nM). Por outro lado, na dose de 1 nM a PRL preveniu a diminuição de 40% da viabilidade celular resultante a exposição ao MeHg a 5 μM. Esta dose de 1 nM de PRL foi a única a estimular a liberação de TNF α, mas curiosamente, reverteu a liberação desta citocina quando associada a 5 μM de MeHg, concentração que igualmente estimulou a secreção de TNF α. Os resultados confirmaram a toxidade do MeHg para linfócitos de primatas (linhagem B95-A) e sua reversão por uma possível ação protetora da PRL. Um efeito bifásico na secreção de TNF α resultou da exposição ao MeHg, sugerindo a presença de diferentes mecanismos citotóxicos resultantes a ação mercurial. Por outro lado, a PRL foi pouco efetiva em estimular a secreção daquela citocina, invertendo esta resposta quando associada ao MeHg. No entanto, estes resultados são preliminares e carecem de um estudo mais acurado para sua completa elucidação. / Mercury can be found in several forms, as being organic methylmercury (MeHg), considered the most toxic. Readily absorbed orally, accumulates in the food chain and is amplified in aquatic carnivores, especially in fish, hence the greater risk to populations that preferentially feed on them, such as riparian Amazonian populations. The neurotoxic effect of this form of mercury has been widely demonstrated by epidemiological and experimental studies. Some of these studies have also shown that hormones and antioxidants may act by protecting the body against the deleterious effects of mercury. Prolactin is a hormone that has such protective action, but also acts as a proinflammatory cytokine. Since MeHg can also act as an immunotoxic substance, we have studied the cytoprotective action of PRL in continuous cultures of strain B95-A primate lymphocytes in order to assess their vulnerability to MeHg and its responsiveness to the action of PRL. In order to assess the functional integrity of lymphocytes exposed to MeHg we used to test color reaction for 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), which detects activity mitochondrial metabolism. To evaluate the immune response of lymphocytes, measures of tumor necrosis factor alpha (TNF α) concentration in the middle were performed by ELISA. It is a proinflammatory cytokine released in response to cellular injury from different causes, including oxidative stress, one of the most obvious acute effects of MeHg, and this cytokine also be able to answer prolactin regulation in human lymphocytes. After 18 hours of cultivation exposure to increasing concentrations of the metal (0.1, 1, 5, 10 and 50 mM) showed significant decrease in dose-dependent cell viability from 1 mM (35%) and progressively up to 50 mM (80%), when few intact cells were found in the cultivation. A biphasic effect in a "bell" shaped occurred in the release of TNF-α, where lower concentrations of MeHg inhibited (0.1 and 1 mM) stimulated the intermediate (5 mM) and the two largest (10 and 50 mM) returned to inhibit. Prolactin also decreased the cell viability by about 30% only at the highest dose (10 nM).Moreover, at a dose of 1 nM prevented PRL 40% decrease in cell viability due to exposure to 5 mM MeHg. This dose of 1 nM PRL was the only one to stimulate the release of TNF-α, but curiously reversed the release of this cytokine when combined with 5 mM of MeHg, concentrations that also stimulated the secretion of TNF-α. The results confirmed the toxicity of MeHg to lymphocytes of primates (strain B95-A) and its reversion by possible protective action of PRL. A biphasic effect on the secretion of TNF α resulted from MeHg exposure, suggesting the presence of different mechanisms of cytotoxic action resulting from mercury. Moreover, PRL was less effective in stimulating the secretion of that cytokine, reversing this response when the associated with MeHg. However, these results are preliminary and require a more accurater study for their complete elucidation.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-12-04T17:53:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_NiveisMercurioProlactina.pdf: 1049731 bytes, checksum: 3ed4bc8369830f62690812100660a020 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-12-06T15:33:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_NiveisMercurioProlactina.pdf: 1049731 bytes, checksum: 3ed4bc8369830f62690812100660a020 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-06T15:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Dissertacao_NiveisMercurioProlactina.pdf: 1049731 bytes, checksum: 3ed4bc8369830f62690812100660a020 (MD5) Previous issue date: 2012 / Ao mercúrio tem sido atribuída a capacidade de interferir nos sistemas orgânicos imunológico e hormonal, além dos sistemas nervoso e renal frequentemente atingidos por esse agente tóxico. Mulheres em idade fértil ou grávidas constituem um grupo vulnerável a esses efeitos, em relação a si mesmas e seus conceptos. Foi avaliada a exposição ao mercúrio (Hg) e os níveis de prolactina (PRL) e interleucina-10 (IL-10) em 144 mulheres (no pós-parto e cerca de um ano depois) de Itaituba, área sob impacto ambiental do mercúrio e em mulheres de municípios da área metropolitana de Belém, sobretudo Ananindeua, área sem impacto conhecido do mercúrio (156 puérperas e 156 não puérperas). As análises de mercúrio total (Hg-t) em sangue foram feitas por Espectrometria de Absorção Atômica por Vapor Frio. As análises séricas de PRL foram feitas por Ensaio Imunoenzimático com detecção final em fluorescência e as determinações de IL-10 foram realizadas por Ensaio Imunoenzimático de Fase Sólida. Dados demográficos e epidemiológicos foram obtidos através de questionário semi-estruturado. As puérperas de Itaituba apresentaram média de Hg-t, PRL e IL-10 de 13,93 μg/l, 276,20 ng/ml e 39,54 pg/ml, respectivamente. Nas puérperas de Ananindeua as respectivas médias foram 3,67 μg/l, 337,70 ng/ml e 4,90 pg/ml. As mulheres não puérperas de Itaituba apresentaram média de Hg-t de 12,68 μg/l, média de PRL de 30,75 ng/ml e média de IL-10 de 14,20 pg/ml. As médias de Hg-t, PRL e IL-10 das mulheres de Ananindeua foram 2,73 μg/l, 17,07 ng/ml e 1,49 pg/ml, respectivamente. Os níveis de Hg-t, PRL e IL-10 foram maiores em Itaituba (p<0,0001), exceto em relação à PRL das puérperas, maior em Ananindeua. Os níveis semelhantes de Hg-t nas duas avaliações das mulheres de Itaituba (p=0,7056) e a correlação moderada sugerem continuidade da exposição (r=0,4736, p<0,0001). A principal variável preditora dos níveis de mercúrio foi o consumo de peixe nos modelos de regressão múltipla linear e logística. A paridade e os níveis de IL-10 apresentaram associação positiva com a PRL nas puérperas de Itaituba e o peso do recém-nascido e a IL-10, associação positiva com a PRL em puérperas de Ananindeua. A IL-10 apresentou associação negativa com a PRL nas mulheres não puérperas de Itaituba (p=0,0270) e positiva nas mulheres de Ananindeua (p=0,0266). Os níveis de Hg-t estavam associados negativamente com a PRL nas puérperas (p=0,0460) e positivamente com o trabalho em garimpo (p=0,0173) (este também importante para as não puérperas) em Itaituba, segundo os modelos logísticos. A IL-10 esteve associada positivamente à morbidade recente nas puérperas de Itaituba (p=0,0210), negativamente ao consumo de bebida alcoólica (p=0,0178) e positivamente ao trabalho em garimpo nas mulheres não puérperas (p=0,0199). A exposição crônica ao Hg das mulheres de Itaituba, a diferença nos níveis dos fatores imunoendócrinos avaliados em relação às mulheres não expostas e a associação com variáveis epidemiológicas relevantes, sugerem a possibilidade de impactos da exposição no perfil imunoendócrino das mulheres de Itaituba, chamando atenção para a importância da vigilância da saúde dessa população e o possível uso de bioindicadores como a PRL em sua avaliação. / The ability of interfering in the immunological and endocrine organic systems has been attributed to the mercury (Hg), besides the nervous and renal systems frequently affected by this toxicant agent. Women in fertile age or pregnant constitute a vulnerable group for those effects, in relation to themselves and their fetus. The mercury exposure was assessed as well as the prolactin (PRL) and interleukin-10 (IL-10) levels in 144 women (in the post-partum and about one year later) of Itaituba, area under environmental Hg impact and in women of the metropolitan area of Belém, most of all from Ananindeua, area without known Hg impact (156 puerperal women and 156 non-puerperal). Total Hg (Hg-t) analyses in whole blood were carried out by Atomic Absorption Spectrometry Cold Vapor. Serum analyses of PRL were made by Enzyme Immunoassay with final detection by fluorescence and IL-10 serum analyses were accomplished by Enzyme Immunoassay of Solid Phase. Demographic and epidemiological data were obtained through semi-structured questionnaire. Puerperal women of Itaituba presented average of Hg-t, PRL and IL-10 of 13.93 μg/l, 276.20 ng/ml and 39.54 pg/ml, respectively. Puerperal women of Ananindeua presented respective Hg-t, PRL and IL-10 averages of 3.76 μg/l, 337.70 ng/ml and 4.90 pg/ml. Non-puerperal women of Itaituba presented Hg-t mean of 12.68 μg/l, PRL mean of 30.75 ng/ml and IL-10 mean of 14.20 pg/ml. Mean of Hg-t, PRL and IL-10 in non-puerperal women from Ananindeua were of 2.73 μg/l, 17.07 ng/ml and 1.49 pg/ml, respectively. Levels of Hg-t, PRL and IL-10 were higher in Itaituba (p<0.0001), except in PRL levels of puerperal women, higher in Ananindeua. Similar Hg levels in women of Itaituba in two assessment (p=0.7056) and positive correlation suggest continuity of exposure (r=0.4736, p<0.0001). The main predictor variable of mercury levels was the fish consumption in the linear and logistic multiple regression models. Parity and IL-10 levels were positively associated with PRL in puerperal women of Itaituba while newborn weight and IL-10 levels presented positive association with PRL in puerperal women of Ananindeua. IL-10 was negatively associated with PRL in non-puerperal women from Itaituba (p=0.0270) and positive association in Ananindeua (p=0.0266). Levels of Hg-t showed negative association with PRL in puerperal women and positive association with working in garimpo (p=0.0173) (the last one was also important for non-puerperal women) in Itaituba, according logistic models. IL-10 was positively associated with recent morbidity in puerperal women of Itaituba (p=0.0210), negatively with ingestion of alcoholic beverages (p=0.0178) and positively with working in garimpo in non-puerperal women (p=0.0199). The chronic Hg exposure of women from Itaituba, difference among the Hg, PRL and IL-10 levels in exposed women compared with non exposed group and association with relevant epidemiological variables, suggest the possibility of Hg impacts in the women's immunoendocrine system in Itaituba, calling attention for the health surveillance of this population and the possible use of assessment biomarkers as PRL.

Haloperidol é um antagonista de receptor D2 de dopamina freqüentemente utilizado na clínica para tratamento de pacientes esquizofrênicos. Haloperidol aumenta a liberação de prolactina pela glândula pituitária anterior, e a prolactina é um fator capaz de modular a atividade do sistema imune. Grupos de seis ratos machos e fêmeas receberam tratamento agudo de 2mg/kg de haloperidol (E1), tratamento prolongado com haloperidol (E2) (2mg/kg/dia por 21 dias); retirada abrupta do tratamento prolongado com haloperidol (E3), ou ainda tratamento agudo com 6mg/kg de haloperidol (E4). Os animais controle receberam tratamento similar com veículo de diluição (grupos C1, C2 e C3 respectivamente). Neste trabalho, o tratamento prolongado com haloperidol (E2) aumentou a atividade de macrófagos, aumentando o espraiamento, a fagocitose e a liberação de NO em ratos machos e fêmeas. O tratamento agudo com 2mg/kg de haloperidol (E1) não foi capaz de alterar a atividade de macrófagos, porém a dose de 6mg/kg (E4) aumentou o espraiamento e a fagocitose. Os tratamentos agudo (E1) e prolongado (E2) com haloperidol aumentaram os níveis plasmáticos de corticosterona e de prolactina tanto em machos quanto em fêmeas. Os macrófagos de ratos machos e fêmeas apresentam os mesmos padrões de alterações após os tratamentos com haloperidol, exceto para produção de H2O2 que foi maior apenas para as fêmeas dos grupos C3 e E3. Discutiu-se de que maneira o haloperidol induz ativação de macrófagos, se por uma forma indireta através do aumento nos níveis de prolactina, ou alternativamente, sendo esta ativação uma conseqüência da ação direta do haloperidol sobre os receptores de dopamina dos macrófagos. / Haloperidol is a receptor D2 antagonist frequently used in the treatment of schizophrenic patients. Haloperidol increased prolactin release from anterior pituitary gland, and prolactin modulates immune system activity. Groups of six male and female rats received acute 2mg/kg haloperidol treatment (E1), long-term (E2) haloperidol treatment (2mg/kg/day for 21 days); abrupt withdrawal of long-term (E3) haloperidol treatment, or acute 6mg/kg haloperidol treatment (E4). Control rats were treated similarly, but with vehicle (groups C1, C2 and C3 respectively). In this work long-term haloperidol treatment (E2) increased macrophage spreading, phagocytosis and NO release in male and female rats. Acute 2mg/kg haloperidol treatment (E1) didn?t change macrophage activity, however, the 6mg/kg dose (E4) increased macrophage spreading and phagocytosis. Corticosterone and prolactin serum levels were increased after acute (E1) and long-term (E2) haloperidol treatments in male and female rats. Macrophage of male and female rats presented the same pattern of alterations after acute and long-term haloperidol treatments, except for production of H2O2 that was larger just for the females of the groups C3 and E3. Haloperidol-induced macrophage activation was discussed in the light of a possible indirect effect through prolactin increments in rats, or, alternatively, as a consequence of a direct action of macrophage dopamine receptor.

O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor &lambda;PL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-&alpha;2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH. / The expression system based on the PL or PR promoters of the lambda phage that is usually regulated by the term labile repressor (clts) is widely used to produce recombinant proteins in prokaryotic cells. However, the temperature increase required in this system to promote the repressor inactivation shows some limitations, like the increase of the HSP (Heat Shock Proteins) proteins expression, proteases e.g., that depending on the nature of the expressed protein can be harmful or not. Another limitation is the activation of SOS response, resulting on the stop of the DNA cell replication or depending on the strain can occur cell lysis. In this paper we describe the use of the &lambda;PL promoter for constitutive expression, without the repressor regulation. We optimized different cultivation conditions to increase the secretion in the periplasmic space of Escherichia coli of five proteins: the human growth hormone (hGH), that is being widely used in the treatment of children with disabilities and/or resistance to hGH, Turner syndrome, within another disorders; human prolactin (hPRL), a polypeptide hormone known for stimulating the lactation and for exercising regulatory action on growth and on the differentiation of the mammary gland; two hPRL antagonists, studied as potential medicine to the treatment of some kinds of cancers and finally the interferon &alpha;2a (IFN-&alpha;2a), that is a cytokine produced by the cells, in response to different actions, including viral nucleic acids, neoplastic cells, antigens of bacteria, protozoa and viruses. In the case of IFN-&alpha;2a, this high value added and important therapeutic application, was developed in our laboratory as a part of this paper, including the development and the validation of the analysis methodology by reversed-phase HPLC to determine the IFN present in the bacterial periplasmic fluid or in its pure form. The main strategies used to improve the expression were to start the induction with the maximum optical density of bacterial growth and optimize the induction temperature to control the expression of heterologous protein. This methodology can be used in cases where the product wont be toxic to the host cell or when the instability of the plasmid is not a problem. The possibility of cultivation in lower temperatures, since the heat-sensitive repressor is not present, contributed to the significant increase of the expression, even to proteins that are less sensitive to the cultivation temperature, like the hGH.

Neurônios GnRH e kisspeptina representam as populações neuronais de maior importância no controle da reprodução. Estradiol liga-se ao seu receptor expresso pelos neurônios kisspeptina para regular a libertação de GnRH. No modelo animal OVX+E a atividade do neurônio GnRH e pico de LH é depende do estradiol e hora do dia. Nesse estudo, embora a taxa de disparo dos neurônios GnRH seja similar entre os grupos, o padrão dos potenciais revelou uma mudança para maior duração do estouro em camundongos no proestrous, além do fato de uma maior resposta da hipófise. A prolactina tem grande impacto na modulação do eixo HPG e kisspeptina são mediadores dos efeitos da prolactina sobre a reprodução. Uma pequena porcentagem de neurônios de kisspeptina do AVPV foi indiretamente despolarizada pela prolactina. Este efeito requeria a via de sinalização PI3K. Camundongos portadores de inativação de Stat5a/b em células kisspeptina exibiram um início precoce de ciclicidade estro, indicando que os fatores de transcrição STAT5 exercem um efeito inibitório sobre o momento da puberdade. / GnRH and kisspeptina neurons represent the most important neuronal populations in the control of reproduction. Estradiol binds to its receptor expressed by the kisspeptina neurons to regulate the release of GnRH. In the animal model OVX+E the activity of the GnRH neuron and LH surge is dependent of estradiol and time of day. In this study, although the firing rate of GnRH neurons was similar between groups, the pattern of potentials revealed a change to longer burst duration in mice in proestrous, and the pituitary response was greater in this group. Prolactin has impact on HPG axis modulation and kisspeptin is a mediator of the effects of prolactin on reproduction. A small percentage of AVPV kisspeptin neurons were indirectly depolarized by prolactin. This effect required the PI3K signaling pathway. Mice bearing Stat5a/b inactivation on kisspeptin cells exhibited an early onset of estrus cyclicity, indicating that STAT5 transcription factors exert an inhibitory effect on the time of puberty.