Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / With the intensive glycemic control and longer survival of type 1 diabetes mellitus (T1DM) patients, cardiovascular disease has been the main cause of mortality. Oxidized LDL is considered a critical factor in the atherosclerotic process and the aim of our study was evaluate the absorbance of different wavelengths of oxidized phospholipids and oxidation rate of LDL particles in vitro in T1DM. We studied 54 patients aged 29.1 12.11 years and with a disease duration of 14.6 8.43 years and 28 non-diabetic volunteers. The two groups had carried where they were measured lipid profile, glucose, uric acid, blood pressure, urinary albumin excretion and spectrophotometry analysis of the oxidation of LDL cholesterol before and 1, 3, 6 and 24 hours after addition of substance oxidant copper sulfate. The coefficients of oxidation (Cox) of LDL from both groups had similar reading at all times with a significant difference between the baseline and after 1 hour (p <0 .001) and between the time after 3 and 6 hours after addition of sulfate copper (p <0 .001) for both groups. In the multiple regression model, the result was the Cox model = 8.246 to 13.93 to 10.21 + -2.71 b c (R2 = 0.835), here "a", "b" and "c" represent the absorbance (205 nm , 232 nm and 280 nm, respectively). We conclude that in our sample the wavelengths 232 nm and 280 nm related to the reading of conjugated diene and protein faction of LDL, respectively, were more important in determining the oxidation rate of the particle. / Com a intensificação do controle glicêmico e maior sobrevida dos pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM1), houve mudança progressiva das causas de mortalidade, com maior destaque para a doença cardiovascular (DCV). Em função da LDL oxidada ser considerada ponto fundamental na patogênese da doença aterosclerótica, o presente estudo objetivou avaliar as absorbâncias obtidas nos diferentes comprimentos de onda dos fosfolipídios oxidados e o coeficiente de oxidação da partícula de LDL in vitro em pacientes com diabetes mellitus tipo 1. Foram avaliados 54 pacientes com DM1 com idade de 29,1 12,11 e de duração de doença de 14,6 8,43 e 28 voluntários não diabéticos. Os pacientes e voluntários foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial onde foram mensurados perfil lipídico, glicêmico, ácido úrico, níveis pressóricos, excreção urinária de albumina e análise espectofotométrica da oxidação do LDL colesterol antes e 1, 3, 6 e 24 horas após adição de substância oxidante- sulfato de cobre. Os coeficientes de oxidação (Cox) do LDL dos dois grupos apresentaram leitura semelhante em todos os momentos com diferença significativa entre o tempo basal e após 1h (p<0, 001) e entre o momento após 3 e 6 horas após adição de sulfato de cobre ( p< 0,001) para os grupos avaliados. No modelo de regressão múltipla, o resultado obtido foi o modelo Cox = 8,246 13,93a -2,71b + 10,21c (R2=0,835), onde a, b e c representam as absorbâncias (205 nm, 232 nm e 280 nm, respectivamente). Concluímos que em nossa amostra os comprimentos de onda 232 nm e 280 nm referentes à leitura dos dienos conjugados e a fração protéica da LDL, respectivamente apresentaram maior importância na determinação do coeficiente de oxidação da partícula.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / With the intensive glycemic control and longer survival of type 1 diabetes mellitus (T1DM) patients, cardiovascular disease has been the main cause of mortality. Oxidized LDL is considered a critical factor in the atherosclerotic process and the aim of our study was evaluate the absorbance of different wavelengths of oxidized phospholipids and oxidation rate of LDL particles in vitro in T1DM. We studied 54 patients aged 29.1 12.11 years and with a disease duration of 14.6 8.43 years and 28 non-diabetic volunteers. The two groups had carried where they were measured lipid profile, glucose, uric acid, blood pressure, urinary albumin excretion and spectrophotometry analysis of the oxidation of LDL cholesterol before and 1, 3, 6 and 24 hours after addition of substance oxidant copper sulfate. The coefficients of oxidation (Cox) of LDL from both groups had similar reading at all times with a significant difference between the baseline and after 1 hour (p <0 .001) and between the time after 3 and 6 hours after addition of sulfate copper (p <0 .001) for both groups. In the multiple regression model, the result was the Cox model = 8.246 to 13.93 to 10.21 + -2.71 b c (R2 = 0.835), here "a", "b" and "c" represent the absorbance (205 nm , 232 nm and 280 nm, respectively). We conclude that in our sample the wavelengths 232 nm and 280 nm related to the reading of conjugated diene and protein faction of LDL, respectively, were more important in determining the oxidation rate of the particle. / Com a intensificação do controle glicêmico e maior sobrevida dos pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (DM1), houve mudança progressiva das causas de mortalidade, com maior destaque para a doença cardiovascular (DCV). Em função da LDL oxidada ser considerada ponto fundamental na patogênese da doença aterosclerótica, o presente estudo objetivou avaliar as absorbâncias obtidas nos diferentes comprimentos de onda dos fosfolipídios oxidados e o coeficiente de oxidação da partícula de LDL in vitro em pacientes com diabetes mellitus tipo 1. Foram avaliados 54 pacientes com DM1 com idade de 29,1 12,11 e de duração de doença de 14,6 8,43 e 28 voluntários não diabéticos. Os pacientes e voluntários foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial onde foram mensurados perfil lipídico, glicêmico, ácido úrico, níveis pressóricos, excreção urinária de albumina e análise espectofotométrica da oxidação do LDL colesterol antes e 1, 3, 6 e 24 horas após adição de substância oxidante- sulfato de cobre. Os coeficientes de oxidação (Cox) do LDL dos dois grupos apresentaram leitura semelhante em todos os momentos com diferença significativa entre o tempo basal e após 1h (p<0, 001) e entre o momento após 3 e 6 horas após adição de sulfato de cobre ( p< 0,001) para os grupos avaliados. No modelo de regressão múltipla, o resultado obtido foi o modelo Cox = 8,246 13,93a -2,71b + 10,21c (R2=0,835), onde a, b e c representam as absorbâncias (205 nm, 232 nm e 280 nm, respectivamente). Concluímos que em nossa amostra os comprimentos de onda 232 nm e 280 nm referentes à leitura dos dienos conjugados e a fração protéica da LDL, respectivamente apresentaram maior importância na determinação do coeficiente de oxidação da partícula.

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad compleja caracterizada por la desaparición selectiva de las células beta pancreáticas, responsables de la producción de insulina, debido a un proceso autodestructivo mediado por el propio sistema inmunitario. La cepa murina NOD es el modelo animal más ampliamente utilizado en el estudio de la T1D, ya que estos animales desarrollan, de forma espontánea, una forma de diabetes autoinmunitaria similar a la que se observa en humanos. Aunque se conoce que los linfocitos T son las células responsables de la destrucción directa de la masa celular beta, otros tipos celulares del sistema inmunitario también están implicados en el origen y desarrollo de esta respuesta autoinmunitaria. Entre ellos se encuentran los linfocitos B, los cuales también migran, junto con los linfocitos T, a los islotes pancreáticos durante el desarrollo de la diabetes. Nuestra hipótesis es que la población de linfocitos B que forma parte del infiltrado leucocitario en los islotes pancreáticos puede presentar cualidades funcionales distintivas, que aporten la capacidad de regular in situ la actividad de los linfocitos T autorreactivos. El primer objetivo planteado en este estudio ha sido la caracterización fenotípica y funcional de los linfocitos B infiltrantes en islotes pancreáticos, en diferentes modelos murinos de susceptibilidad/resistencia a la diabetes. Así, se ha observado que la migración de los linfocitos B al entorno intrainsular es más destacada en hembras, especialmente en la etapa pre-diabética. Esta población de linfocitos B infiltrantes muestra un fenotipo correspondiente a células maduras, pero la disminución significativa en superfície de la molécula CD19, que forma parte del complejo correceptor del BCR, sugiere un estado funcional reprimido. Los resultados obtenidos tras la estimulación in vitro de estas células indican que dentro del ambiente del infiltrado existen unas condiciones que mantienen este fenotipo reprimido, pero que estas células son especialmente sensibles a la estimulación vía CD40. Estos datos sugieren que estos linfocitos, aunque no presentan cambio de isotipo en su BCR y por tanto no provienen de una reacción de centro germinal, parecen haber estado en contacto previamente con su antígeno. No obstante, a nivel de producción de citoquinas (IL-4, IL-10, IFN?) y de capacidad estimuladora de la proliferación de linfocitos T, no see han detectado diferencias funcionales de estos linfocitos B infiltrantes de islotes, respecto a linfocitos B de poblaciones periféricas. El segundo objerivo de este estudio ha consistido en la identificación del antígeno reconocido predominantemente por esta población de linfocitos B infiltrantes. En un estudio previo, realizado por nuestro grupo, se habían generado hibridomas productores de anticuerpos, a partir de linfocitos B infiltrantes de islotes, y se había demostrado que la mayoría de estos anticuerpos monoclonales reconocían antígenos expresados en las fibras nerviosas que inervan el páncreas. En este estudio, a partir del aislamiento y posterior identificación molecular del antígeno reconocido por 21 anticuerpos monoclonales con el mismo patrón de reconocimiento pero de diferente origen clonal, se ha demostrado que la periferina es la proteína reconocida por todos ellos. Este antígeno neuroendocrino es una proteína de citoesqueleto que se expresa mayoritariamente en las fibras nerviosas periféricas, aunque también, en niveles menores, en las células del islote pancreático. Estos datos apoyan la hipótesis de que el ataque autoinmunirario que se desarrolla en los afectados por T1D, no es exclusivamente dirigido contra las células beta pancreáticas, y que la desestabilización del sistema nervioso pancreático puede ser un factor implicado en el desarrollo de la enfermedad. / Type 1 diabetes (T1D) is a complex autoimmune disease characterized by selective destruction of pancreatic beta cells by the patient's own immune system.Currently, one of the best animal models of type 1 diabetes is the nonobese diabetic (NOD) mouse. NOD mice spontaneously develop a form of diabetes that closely resembles human type 1 diabetes.Islet-infiltrating T-cells are major effectors of beta-cell damage in T1D, however, other cellular elements of the immune system also play a critical role in the initiation and/or progression of T1D. Among these, B-cells are also recruited to pancreatic islets, during disease development. We hypothesize that islet-infiltrating B-cells may have distinctive functional traits, enabling them to regulate autoreactive T-cell activity in situ. The aim of the present study was the phenotypical and functional characterization of islet-infiltrating B cells, in T1D susceptible/resistant T1D murine models. Thus, it was observed that B-cell recruitment into pancreatic islets is higher in female mice, specially just before diabetes onset. Although they are mature B-cells, they interestingly show an abnormal down-regulation of surface CD19 expression, showing a possible hiporesponsive status of these cells, given the relevance of CD19 in regulating BCR activation. Islet-infiltrating B-cells develop a pronounced costimulator phenotype after in vitro stimulation with anti-CD40, thus revealing to be somehow repressed while in the islets. These results suggest that these B-cells, although not presenting immunoglobin class switch recombination, seem to be antigen-experienced. On the other hand, cytokine expression profile (IL-4, IFN?, IL-10) and T-cell activator quality of islet-infiltrating B-cells have been shown to be similar to that from their splenic counterparts.On the other hand, the second objective of this study was the identification of the autoantigen predominantly targeted by islet-infiltrating B-cells. In a previous study in our laboratory, antibody-producing hybridomas were generated from islet-infiltrating C-cells, and it was shown that most of them targeted peripheral nervous elements. In the present study, the isolation and subsequent molecular characterization of the antigen recognized by 21 of these monoclonal antibodies, proved that peripherin is the protein targeted by them all. This neuroendocrine autoantigen is a cytoskeleton protein mainly expressed by peripheral nervous cells, but it is also expressed, although at lower levels, by islet beta-cells. These data support the hypothesis that T1D autoimmune attack is not exclusively focused on pancreatic beta-cells, and that pancreatic nervous system damage may be involved in disease development.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica, caracterizada pela desregulação glicêmica, que ocorre devido a um ataque autoimune. A insulinoterapia é o tratamento clássico para o DM1. Contudo, alguns pacientes que apresentam essa doença não respondem de forma eficiente a este tratamento e apresentam episódios frequentes de hipoglicemia severa e despercebida (pacientes hiperlábeis). Essas complicações comprometem de forma significativa a qualidade de vida dessas pessoas. O transplante de ilhotas é uma importante alternativa para o tratamento de pacientes hiperlábeis com DM1. No entanto, essa terapia apresenta restrições como a necessidade de mais de um doador por transplante e significativa morte das ilhotas devido ao estresse provocado pelo procedimento de isolamento, além da morte promovida pelo sistema imune do paciente nos primeiros momentos pós-transplante. A autofagia é um mecanismo de reciclagem de componentes citoplasmáticos que é fundamental para a homeostase celular. Em condições de estresse, este mecanismo é ativado acima do seu nível basal, promovendo a degradação de agregados proteicos e organelas defeituosas, evitando assim, danos celulares que comprometam a viabilidade da célula. Trabalhos realizados por nosso grupo têm mostrado a citoproteção que PRL promove em células-beta, reduzindo a apoptose induzida por citocinas pró-inflamatórias. Também demonstramos o papel essencial de HSPB1 na inibição de apoptose induzida por PRL após o tratamento com citocinas. Além disso, resultados recentes de nosso laboratório mostraram um aumento nos níveis de autofagia em células-beta após sua exposição a citocinas, bem como uma restauração a níveis normais na presença de PRL. Visando um melhor entendimento do papel da PRL na modulação da autofagia em células-beta, o objetivo desse projeto foi estudar se HSPB1 também é essencial no mecanismo de regulação da autofagia induzido por PRL.Para tal, fizemos experimentos em modelos de células-beta MIN6, MIN6 silenciadas para HSPB1 (MIN6-shHSPB1) e MIN6 com sequencia short hairpin aleatória (MIN6- SsC), medindo a morte celular através de ensaios de viabilidade, e ensaios de western blot para avaliar os níveis de marcadores de autofagia e fluxo autofágico (degradação de autofagossomos), tratando as células com citocinas, prolactina e indutores ou inibidores de autofagia. Os resultados mostraram que a modulação da autofagia ocasionada pela prolactina em células-beta se dá, em parte, através de HSPB1. O tratamento com prolactina foi capaz de inibir a morte celular induzida por citocinas, mesmo na presença de cloroquina, um bloqueador de autofagia, o que nos levou a concluir que a autofagia não é uma via envolvida na citoproteção de células beta induzida por PRL. Os resultados gerados nesse estudo contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos moleculares induzidos por PRL em células-beta, e poderão permitir a inferência de novas abordagens que melhorem a citoproteção, cultura e transplante dessas células em pacientes com diabetes tipo 1. / Type 1 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by glycemic dysregulation, which occurs due to an autoimmune destruction of beta-cells. Insulin therapy is the gold standard treatment for DM1. However, some DM1 patients do not respond efficiently to this treatment and suffer frequent episodes of severe hypoglycemia unawareness. Since this complication jeopardizes the quality of life of these people, Islet transplantation is a therapeutic alternative indicated to treat these patients. However, besides the lack of enough organ donors, the loss of beta cells during both the isolation as well as the infusion of islets into the recipient induce a great estresse and thus a significant cell death is one of the drawbacks of this procedure. Autophagy is a mechanism of recycling cytoplasmic components and is essential for cellular homeostasis. Under estresse conditions, this mechanism is activated above basal levels, promoting the degradation of protein aggregates and defective organelles, thus avoiding cell damage that could compromise cell viability. Studies carried out by our group have shown not only that PRL promotes cytoprotection in beta-cells, reducing pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, but also that HSPB1 plays an essential role in this inhibition of apoptosis mediated by PRL after treatment with cytokines. Moreover, recent results from our laboratory showed an increase in autophagy levels in beta-cells after exposure to cytokines, as well as a restauration to normal levels in the presence of PRL. In order to better understand the role of PRL in the modulation of autophagy in these cells, the aim of this project is to study whether HSPB1 is also essential in the mechanism of autophagy regulation induced by PRL. Using MIN6 beta cell models where HSPB1 was silenced (MIN6-shHSPB1) or not (MIN6-SsC), we studied cell death by viability assays. Moreover, western blot assays were performed in order to assess levels of autophagy and autophagic flux markers in the cells.Our results showed that HSPB1 in one of the mediators of PRL-induced modulation of autophagy. Nevertheless, since hormonal treatment was still able to inhibit cytokinesinduced cell death even in the presence of chloroquin, an autophagy blocker, we conclude that autophagy is not a signaling pathway involved in PRl-induced beta-cell cytoprotection. Altogether, the results shown in this study may help to increase the knowledge of the molecular events induced by PRL in beta-cells, and may allow to infer new approaches to improve cytoprotection, culture and transplantation of these cells into type 1 diabetic patients.

O diabetes mellitus tipo 1 é uma doença metabólica, caracterizada pela desregulação glicêmica, que ocorre devido a um ataque autoimune. A insulinoterapia é o tratamento clássico para o DM1. Contudo, alguns pacientes que apresentam essa doença não respondem de forma eficiente a este tratamento e apresentam episódios frequentes de hipoglicemia severa e despercebida (pacientes hiperlábeis). Essas complicações comprometem de forma significativa a qualidade de vida dessas pessoas. O transplante de ilhotas é uma importante alternativa para o tratamento de pacientes hiperlábeis com DM1. No entanto, essa terapia apresenta restrições como a necessidade de mais de um doador por transplante e significativa morte das ilhotas devido ao estresse provocado pelo procedimento de isolamento, além da morte promovida pelo sistema imune do paciente nos primeiros momentos pós-transplante. A autofagia é um mecanismo de reciclagem de componentes citoplasmáticos que é fundamental para a homeostase celular. Em condições de estresse, este mecanismo é ativado acima do seu nível basal, promovendo a degradação de agregados proteicos e organelas defeituosas, evitando assim, danos celulares que comprometam a viabilidade da célula. Trabalhos realizados por nosso grupo têm mostrado a citoproteção que PRL promove em células-beta, reduzindo a apoptose induzida por citocinas pró-inflamatórias. Também demonstramos o papel essencial de HSPB1 na inibição de apoptose induzida por PRL após o tratamento com citocinas. Além disso, resultados recentes de nosso laboratório mostraram um aumento nos níveis de autofagia em células-beta após sua exposição a citocinas, bem como uma restauração a níveis normais na presença de PRL. Visando um melhor entendimento do papel da PRL na modulação da autofagia em células-beta, o objetivo desse projeto foi estudar se HSPB1 também é essencial no mecanismo de regulação da autofagia induzido por PRL.Para tal, fizemos experimentos em modelos de células-beta MIN6, MIN6 silenciadas para HSPB1 (MIN6-shHSPB1) e MIN6 com sequencia short hairpin aleatória (MIN6- SsC), medindo a morte celular através de ensaios de viabilidade, e ensaios de western blot para avaliar os níveis de marcadores de autofagia e fluxo autofágico (degradação de autofagossomos), tratando as células com citocinas, prolactina e indutores ou inibidores de autofagia. Os resultados mostraram que a modulação da autofagia ocasionada pela prolactina em células-beta se dá, em parte, através de HSPB1. O tratamento com prolactina foi capaz de inibir a morte celular induzida por citocinas, mesmo na presença de cloroquina, um bloqueador de autofagia, o que nos levou a concluir que a autofagia não é uma via envolvida na citoproteção de células beta induzida por PRL. Os resultados gerados nesse estudo contribuíram para uma melhor compreensão dos eventos moleculares induzidos por PRL em células-beta, e poderão permitir a inferência de novas abordagens que melhorem a citoproteção, cultura e transplante dessas células em pacientes com diabetes tipo 1. / Type 1 diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by glycemic dysregulation, which occurs due to an autoimmune destruction of beta-cells. Insulin therapy is the gold standard treatment for DM1. However, some DM1 patients do not respond efficiently to this treatment and suffer frequent episodes of severe hypoglycemia unawareness. Since this complication jeopardizes the quality of life of these people, Islet transplantation is a therapeutic alternative indicated to treat these patients. However, besides the lack of enough organ donors, the loss of beta cells during both the isolation as well as the infusion of islets into the recipient induce a great estresse and thus a significant cell death is one of the drawbacks of this procedure. Autophagy is a mechanism of recycling cytoplasmic components and is essential for cellular homeostasis. Under estresse conditions, this mechanism is activated above basal levels, promoting the degradation of protein aggregates and defective organelles, thus avoiding cell damage that could compromise cell viability. Studies carried out by our group have shown not only that PRL promotes cytoprotection in beta-cells, reducing pro-inflammatory cytokines-induced apoptosis, but also that HSPB1 plays an essential role in this inhibition of apoptosis mediated by PRL after treatment with cytokines. Moreover, recent results from our laboratory showed an increase in autophagy levels in beta-cells after exposure to cytokines, as well as a restauration to normal levels in the presence of PRL. In order to better understand the role of PRL in the modulation of autophagy in these cells, the aim of this project is to study whether HSPB1 is also essential in the mechanism of autophagy regulation induced by PRL. Using MIN6 beta cell models where HSPB1 was silenced (MIN6-shHSPB1) or not (MIN6-SsC), we studied cell death by viability assays. Moreover, western blot assays were performed in order to assess levels of autophagy and autophagic flux markers in the cells.Our results showed that HSPB1 in one of the mediators of PRL-induced modulation of autophagy. Nevertheless, since hormonal treatment was still able to inhibit cytokinesinduced cell death even in the presence of chloroquin, an autophagy blocker, we conclude that autophagy is not a signaling pathway involved in PRl-induced beta-cell cytoprotection. Altogether, the results shown in this study may help to increase the knowledge of the molecular events induced by PRL in beta-cells, and may allow to infer new approaches to improve cytoprotection, culture and transplantation of these cells into type 1 diabetic patients.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

[ES] Las personas con diabetes tipo 1 carecen de la capacidad de secretar insulina y, por lo tanto, necesitan regular su glucosa en sangre con la administración de insulina exógena. El páncreas artificial se presenta como la solución tecnológica ideal para alcanzar los objetivos terapéuticos de la normoglucemia, liberando al paciente de la carga actual de autocontrol y manejo. Sin embargo, el riesgo de hipoglucemia y la variabilidad glucémica siguen siendo factores limitantes en los algoritmos de control actuales integrados en el páncreas artificial. El propósito de la presente tesis es profundizar en el conocimiento de la hipoglucemia y avanzar los algoritmos de control del páncreas artificial para minimizar la incidencia de hipoglucemia y reducir la variabilidad glucémica. Después de proporcionar una visión general del estado del arte del control de la glucosa y el páncreas artificial, esta tesis aborda temas relacionados con el modelado y el control, con las siguientes contribuciones: Se presenta una extensión del modelo de Bergman Minimal que tiene en cuenta la respuesta contrarreguladora a la hipoglucemia. Este modelo explica la relación entre los diversos cambios fisiológicos producidos durante la hipoglucemia, con la adrenalina y los ácidos grasos libres como actores principales. Como resultado, se obtiene una mejor comprensión de la hipoglucemia, lo que permite explicar una auto-potenciación paradójica de la hipoglucemia como se modela a través de enfoques funcionales en el ampliamente utilizado simulador de diabetes tipo 1 UVA-Padova, que se utilizará en esta tesis para la validación in silico de los controladores desarrollados. Se realiza una evaluación de las métricas de variabilidad de la glucosa y los índices de calidad de control. La evaluación de la variabilidad glucémica en el desempeño de los controladores es necesaria; pero todavía no hay un conjunto de métricas de variabilidad glucémica que sea considerado como el "gold estándar". Por tanto, se lleva a cabo un análisis de las métricas de variabilidad disponibles en la literatura para definir un conjunto de indicadores recomendables. Debido a las limitaciones de los sistemas de páncreas artificiales unihormonales para mitigar la hipoglucemia en escenarios difíciles como el ejercicio, esta tesis se centra en el desarrollo de nuevos algoritmos de control bihormonales, con infusión simultanea de insulina y glucagón. Se propone un controlador coordinado bihormonal con estructuras de control paralelas como un algoritmo de control factible para la mitigación de la hipoglucemia y la reducción de la variabilidad glucémica, demostrando un rendimiento superior al de las estructuras de control utilizadas actualmente con lazos de control independientes de insulina y glucagón. Los controladores están diseñados y evaluados in silico en escenarios desafiantes y su rendimiento se evalúa principalmente con el conjunto de métricas definidas previamente como las recomendables. / [CAT] Les persones amb diabetis tipus 1 no tenen la capacitat de secretar insulina secreta i per tant, necessiten regular la seva glucosa en sang amb l'administració d'insulina exògena. El Pàncrees Artificial es presenta com la solució tecnològica ideal per assolir els objectius terapèutics de la normoglucèmia, alliberant al pacient de la càrrega actual d'autocontrol. No obstant, el risc d'hipoglucèmia i l'alta variabilitat glucèmica continuen sent un factor limitant en els algoritmes de control actuals integrats en el Pàncrees Artificials. El propòsit de la present tesi és aprofundir en el coneixement de la hipoglucèmia i millorar els algoritmes de control per corregir amb antelació la dosi excessiva d'insulina, minimitzant la incidència d'hipoglucèmia i reduint la variabilitat glucèmica. Després de donar una visió general de l'estat de l'art del control de la glucosa i el pàncrees artificial, aquesta tesi aborda aspectes de modelització i control, amb les següents contribucions: Es presenta una extensió del model Minimal de Bergman amb la contrarregulació. Aquest model explica la relació entre els diversos canvis siològics produïts durant la hipoglucèmia. Així, permet comprendre millor la hipoglucèmia i comparar els resultats amb els proporcionats per l'enfocament funcional del simulador de diabetis tipus 1 més utilitzat a la comunitat científica. Es realitza una avaluació de les mètriques de variabilitat glucèmica i dels índexs de qualitat de control. Es necessària l'avaluació de la variabilitat glucèmica en el rendiment dels controladors; però encara no hi ha un conjunt de mètriques considerades com les "gold standard". Per tant, es realitza una anàlisi de les mètriques de variabilitat disponibles a la literatura per definir un conjunt d'indicadors recomanables. Es proposa un controlador bi-hormonal coordinat amb estructures de control paral.leles com un algoritme de control viable per a la mitigació d'hipoglucèmia i la reducció de la variabilitat glucèmica. Els controladors estan dissenyats i avaluats in-silico en escenaris desafiadors i el seu rendiment es valora principalment amb el conjunt de mètriques definides prèviament com les mètriques recomanables. / [EN] People with Type 1 Diabetes lack the ability to secrete insulin and therefore need to regulate their blood glucose with exogenous insulin delivery. The Artificial Pancreas is presented as the ideal technological solution to reach the therapeutic goals of normoglycaemia, freeing the patient from the current burden of self-control and management. Nevertheless, the risk of hypoglycaemia and the high glycaemic variability are still a limiting factors in the current control algorithms integrated in the Artificial Pancreas. The purpose of the present thesis is to delve into knowledge of hypoglycaemia and to advance in the artificial pancreas control algorithms in order to minimise hypoglycaemia incidence and reduce glycaemic variability. After providing an overview of the state of the art in the eld of glucose control and articial pancreas, this thesis addresses issues on modelling and control, with the following contributions: An extension of the Bergman Minimal model accounting for counterregulatory response to hypoglycaemia is presented. This model explains the relationship between the several physiological changes produced during hypoglycaemia, with adrenaline and free fatty acids as main players. As a result, a better understanding of hypoglycaemia is gained, allowing to explain a paradoxical auto-potentiation of hypoglycaemia as modeled through functional approaches in the widespread used UVA-Padova Type 1 Diabetes simulator, which will be used in this thesis for in silico validation of the developed controllers. An assessment of glucose variability metrics and control quality indices is carried out. The evaluation of the glycaemic variability on the controllers performance is necessary; but there is not a gold standard variability metrics yet. Therefore, an analysis of the variability metrics available in literature is conducted in order to define a recommendable set of indicators. Due to the limitations of single-hormone artificial pancreas systems in mitigating hypoglycaemia in challenging scenarios such as exercise, this thesis focuses on the developement of new dual-hormone control algorithms, with concomitant infusion of insulin and glucagon. A coordinated dual-hormone controller with parallel control structures is proposed as a feasible control algorithm for hypoglycaemia mitigation and glycaemic variability reduction, demonstrating superior performance as currently used control structures with independent insulin and glucagon control loops. The controllers are designed and evaluated in-silico under challenging scenarios and their performance are assessed mainly with the set of metrics defined previously as the recommendable ones. / Moscardó García, V. (2019). Contributions to modelling and control for improved hypoglycaemia and variability mitigation by dual-hormone artificial pancreas systems [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/120456 / TESIS

O presente estudo investigou a função visual de pacientes com diabetes tipo 1 atletas e sedentários através de testes psicofísicos e eletrofisiológicos computadorizados de última geração. O objetivo foi investigar possíveis efeitos do exercício físico nas funções visuais. Materiais e Métodos: 33 pacientes com diabetes tipo 1, divididos em dois grupos experimentais: diabético atleta (n = 15; idade = 33,33 ± 6,78; tempo de doença =16,19 ± 6,63) e diabéticos sedentário (n = 18 idade = 28,94 ± 6,04; tempo de doença = 15,92 ± 8,46) e 40 sujeitos controles: controle atleta (n = 20; idade = 32,0 ± 5,61) e controle sedentário ( n = 20; idade = 27,05 5,60 ) foram submetidos a exames de: visão de cores e sensibilidade ao contraste Cambridge Colour Test - CCT; eletroretinograma por padrão reverso PERG e análises laboratoriais para quantificar óxido nítrico e endotelina por quimioluminescência e ELISA. As comparações entre os grupos foram feitas através de teste não paramétrico (Teste Kruskal-Wallis). Resultados: O grupo Diabético apresentou perdas significativas na amplitude do PERG, na discriminação de cores no eixo protan, área da elipse e nas frequências espaciais avaliadas da função da sensibilidade ao contraste, além de disfunção dos fatores endoteliais comparado ao grupo Controle. O grupo diabético atleta apresentou concentração maior de óxido nítrico comparado ao grupo Diabético sedentário. Não foram encontradas correlações entre os fatores endoteliais e as funções visuais. Conclusão: foram encontradas perdas funcionais na avaliação psicofísica e eletrofisiológica de pacientes com diabetes tipo 1. Os achados deste estudo confirmam a hipótese de que as perdas visuais sejam de origem neural pós - receptoral. Aumento na concentração de óxido nítrico encontrado em pacientes diabéticos atletas, confirmam os achados da literatura de que o exercício físico é capaz de aumentar a biodisponibilidade deste fator endotelial. Entretanto esse aumento de biodisponibilidade não se refletiu em recuperação das perdas nas funções visuais, uma vez que não houve correlação entre as alterações dos fatores endoteliais e os resultados da avaliação visual. A conclusão, em resumo, é de que o exercício físico não promoveu proteção dos danos visuais verificados em pacientes diabéticos / The study compared visual functions of sedentary and athlete patients with type 1 diabetes, and respective controls, using computerized psychophysical and electrophysiological tests. Materials and Methods: 33 Patients with type 1 diabetes, divided into two experimental groups: athlete diabetics (n = 15; age = 33.33 ± 6.78; rate of disease = 16.19 ± 6.63) and sedentary diabetics ( n = 18 age = 28.94 ± 6.04; rate of disease = 15.92 ± 8.46) and 40 control subjects: athlete control (n = 20; age = 32.0 ± 5.61) and sedentary control (n = 20; age = 27.05 5.60) were subjected to tests of: color vision and contrast sensitivity - Cambridge Colour Test - CCT; pattern electroretinogram (PERG) and laboratorial analysis of nitric oxide and endothelin using chemiluminescence and ELISA. The comparisons between groups were made through the nonparametric (Kruskal-Wallis test). Results: compared the control group, the diabetic group showed significant losses (1) in color discrimination in the protan axis and in ellipse area (2) in several spatial frequencies of the luminance spatial contrast sensitivity function; (3) a reduction in PERG amplitude and (4) dysfunction of endothelial factors. The athlete diabetic group showed increased concentration of nitric oxide compared to the sedentary diabetic group. No correlations were found between the endothelial factors and visual functions. Conclusion: losses in psychophysical and electrophysiological functions were found in patients with type 1 diabetes. The findings support the hypothesis that visual losses are due to the post-receptoral pathways. Increased nitric oxide concentration found in athlete diabetic patients, confirm the findings of the literature that physical exercise can increase the bioavailability this endothelial factor. However this increase in bioavailability was not reflected in the recovery of losses in visual functions, since there was no correlation between changes in endothelial factors and results of visual assessment. In conclusion, the exercise did not promote protection against visual losses due to diabetes

O diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células b presentes nas ilhotas pancreáticas por linfócitos T auto-reativos, especialmente Th1 e Th17, levando o indivíduo a um estado de hiperglicemia. Embora existam diversos estudos que abordam a resposta imune adaptativa no contexto do DM1, poucos trabalhos tentaram elucidar o papel da resposta imune inata no desenvolvimento da doença. Neste contexto, avaliamos o perfil de expressão e o papel do receptor NLRP1 na patogênese do DM1 experimental e em humanos. Nossos dados apontam que no modelo de DM1 induzido por STZ, NLRP1 possui um papel protetor no desenvolvimento da doença de forma independente da ativação do inflamassoma, através da inibição da translocação de bactérias para os linfonodos pancreáticos (LNPs), além de reduzir a diferenciação de células Th17 e Tc17 nos LNPs, o que foi correlacionado à diminuição de IL-17 no pâncreas. Posteriormente, analisamos o papel de NLRP1 em outro modelo experimental, o NOD (nonobese diabetic), onde descrevemos que NLRP1 também é expresso no desenvolvimento da doença. Por fim, avaliamos o papel de NLRP1 em pacientes com DM1, através da genotipagem desses pacientes para um polimorfismo com ganho de função em NLRP1, o rs12150220. Ao contrário do que acontece em camundongos, NLRP1 em humanos parece ter um papel patogênico, uma vez que detectamos mais células T produtoras de IL-17 em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com o polimorfismo, além de níveis elevados da citocina no soro. Em suma, nossos dados apontam para papéis distintos de NLRP1 em camundongos e humanos com DM1, sugerindo cautela ao tentarmos transpor os achados sobre o receptor em camundongos para a clínica. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that is caused by the destruction of the pancreatic b cells by autoreactive T cells, especially Th1 and Th17, leading to a state of hyperglycemia. Even though there are several studies on the role of the adaptive immune response in T1D, little is known about the role of an innate immune response in the development of the disease. Thus, we investigated the role of NLRP1 in the pathogenesis of mouse and human T1D. Our data indicate that in STZ-induced T1D, NLRP1 exerts a protective role in the development of the disease in an inflammasome-independent pathway, through the inhibition of bacterial translocation to the pancreatic lymph nodes (PLNs), and inhibition of the differentiation of Th17 and Tc17 cells in the PLNs, which correlated with decreased levels of IL-17 in the pancreas. Then, we analyzed the role of NLRP1 in nonobese diabetic (NOD) mice. We demonstrate that NLRP1 is also expressed in the development of T1D in this murine model. Lastly, we evaluated the role of NLRP1 in T1D patients, by genotyping these individuals for a polymorphism with a gain-of-function in NLRP1, the rs12150220. Unlike murine NLRP1, NLRP1 in humans appears to be pathogenic, considering that we detected more IL-17-producing T cells in peripheral blood mononuclear cells in patients carrying the polymorphism, besides elevated levels of this cytokine in the serum. Overall, our data suggest distinct roles for murine and human NLRP1 in the context of T1D, suggesting carefulness when translating the findings from murine NLRP1 to the clinic.