Nos organismos eucariotos, aproximadamente 50% das proteínas traduzidas no citoplasma são transportadas para as organelas, onde irão desempenhar suas funções. Com isso, surgiu um intricado sistema de transporte intracelular de proteínas. Nas plantas, a presença de uma segunda organela endossimbionte, o plastídio, tornou este sistema mais complexo e gerou demanda adicional por transporte. Ainda, grande maioria das proteínas mitocondriais e plastidiais são codificadas por genes nucleares e importadas do citosol. O dogma uma proteína-uma localização foi associado ao conceito de um gene-uma proteína na biologia celular. Entretanto, proteínas individuais podem ter mais de uma função, e mais recentemente, proteínas codificadas por um único gene foram identificadas em mais de um compartimento subcelular, o que deu origem ao conceito de duplo direcionamento (DD). Um exemplo bem estudado de DD vem das proteínas da família das aminoacil-tRNA sintetases (aaRS), que participam da síntese protéica ao acoplar o aminoácido ao seu tRNA cognato. Dentre as aaRSs, a glutamil-tRNA sintetase citosólica (GluRS), através de sua extensão N-terminal, parece estar envolvida com outras funções além da tradução. Em Arabidopsis thaliana, há dois genes nucleares que codificam a GluRS, um para uma proteína de duplo direcionamento (DD) e outro para uma proteína citosólica. Resultados recentes em nosso laboratório mostraram que a GluRS citosólica pode estar relacionada ao controle da localização subcelular de proteínas organelares em Arabidopsis. Para verificar um eventual papel desta proteína na localização subcelular de outras proteínas, foram realizados ensaios de duplo-híbrido em levedura, os quais mostraram interação entre a GluRS e a glutamina sintetase (GS) de Arabidopsis thaliana, proteína de DD para mitocôndrias e cloroplastos Esta interação foi confirmada in planta, sendo a sequência da GluRS responsável pela interação localizada na região N-terminal, do resíduo 207 ao 316. Análises filogenéticas apontam que esta região encontra-se ausente nas bactérias e que originou-se provavelmente em Archea, entre 2,6 e 1,8 bilhões de anos. Além disso, observa-se que esta sequência é conservada em fungos, musgos e plantas vaculares, tendo originado-se em Arabidopsis há cerca de 2 bilhões de anos. / In eukaryotic organisms, about 50% of cytoplasmic translated proteins are transported to the organelles, where they can play their roles. Thus, a complex system for intracellular transport was established. In plants, the presence of a second endosymbiont organelle, the plastid, turned this system still more intricated and required an additional transport mechanism. Besides, most of organellar proteins are coded by nuclear genes and imported from the cytosol. The one protein-one localization was associated to the idea of one gene-one protein, which has long been established in molecular biology. However, individual proteins can show more than one function, and recently, proteins coded by one single gene were identified in more than one subcellular compartment, which has originated the concept of dual targeting. One of the most studied example of dual targeted proteins is the aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) family, which are related to protein synthesis by attaching the correct amino acid onto the cognate tRNA molecule. Among the aaRSs, cytosolic glutamyl-tRNA synthetase (GluRS), through its N-terminal extension, seems to be involved in other cellular role beyond translation. In Arabidopsis thaliana, there are two genes encoding GluRS, one for a dual-targeted protein and other for a cytosolic protein. Recent results in our laboratory showed that GluRS interacts with proteins destinated to other organelles, which suggest that this protein might have a role in interfering on protein localization in Arabidopsis. In order to gain some information on the role of this protein in subcellular localization, yeast two-hybrid assays were performed. These studies showed the interaction between GluRS and glutamine synthetase (GS), a mitochondrial and chloroplastic dual-targeted protein. This interaction was confirmed in planta. In addition, the GluRS sequence associated to protein interaction was localized at its N-terminal portion, between the residues 207 316. Phylogenetic analysis revealed that this region is absent in bacteria and it probably arose from Archea between 2.6 and 1.8 billion years ago. Also, this sequence is conserved in fungi, moss and all the green plants investigated. Finally, datation analysis showed that this sequence arose in Arabidopsis between 2 and 1.7 billion years ago.

A regulação da localização de proteínas é um dos aspectos fundamentais na biologia celular vegetal. Os cloroplastos importam mais de 90% de suas proteínas do citosol, portanto, é importante caracterizar os fatores citosólicos que podem estar envolvidos no direcionamento de proteínas para as organelas. Um ensaio de duplohíbrido em leveduras com as proteínas cloroplastidiais HMPPK/TMPPase (TH1) e Glutamina Sintetase (GS) II usados como iscas revelou que a forma citosólica da glutamil-tRNA sintetase - GluRS (At5g26710) de Arabidopsis thaliana interagiu com ambas as proteínas. Estudos de Complementação da Fluorescência Bimolecular (BiFC) confirmaram tais interações in planta. Estudos com deleções na região Nterminal da GluRS mostraram que esta região é responsável pelas interações com HMPPK/TMPPase e GSII. Além disso, seis resíduos de aminoácidos parecem ser cruciais para a interação entre as proteínas. Curiosamente, foi mostrado que a GluRS está envolvida na localização de proteínas em leveduras. A fim de obter mais informações sobre o envolvimento da GluRS ns localização de proteínas nos cloroplastos, foram produzidos plantas de tabaco transgênicas expressando uma proteína quimérica, feita pela fusão do gene codificador da HMPPK/TMPPase, TH1- GFP, e GSII-GFP e posteriormente usados em ensaios de agroinfiltração com RNA de interferência (RNAi) para GluRS. Análises em microscópio confocal mostraram que TH1-GFP e GSII-GFP acumulam no citosol em vez de serem direcionados aos cloroplastos. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez que a GluRS está envolvida na localização de proteínas cloroplastidiais em plantas e esse mecanismo é também conservado em Saccharomyces cerevisiae. / Regulation of protein localization is one of the key aspects in plant cell biology. Chloroplasts import more than 90% of their proteins from the cytosol, therefore, it is important to identify and characterize cytosolic factors that might be involved in protein delivery to the organelar envelope. A yeast two-hybrid screen with a chloroplastlocalized HMPPK/TMPPase protein and glutamine synthetase (GS), used as baits, revealed that the cytosolic form of the glutamyl-tRNA synthetase (GluRS) (At5g26710) from Arabidopsis thaliana interacted with both proteins. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) studies confirmed such interactions in planta. Deletion studies of GluRS showed that the N-terminal region of the protein is responsible for proteinprotein interactions (PPI) with TH1 and GS. In addition, six amino acid residues appeared to be crucial for PPI. Interestingly, GluRS has been also shown to be involved in regulating protein localization in yeast. In order to gain more information about the involvement of GluRS on protein localization in chloroplasts, we produced transgenic tobacco plants expressing a chimeric protein made by the fusion of TH1- GFP and GSIIGFP and agroinfiltrated with a RNA interference (RNAi) construct against GluRS. Confocal analysis showed that TH1-GFP and GSII-GFP accumulated in the cytosol instead of being targeted to chloroplasts. Here, we show for the same time that GluRS is involved in protein localization in plants and this mechanism is also conserved in Saccharomyces cerevisiae.

Nos organismos eucariotos, aproximadamente 50% das proteínas traduzidas no citoplasma são transportadas para as organelas, onde irão desempenhar suas funções. Com isso, surgiu um intricado sistema de transporte intracelular de proteínas. Nas plantas, a presença de uma segunda organela endossimbionte, o plastídio, tornou este sistema mais complexo e gerou demanda adicional por transporte. Ainda, grande maioria das proteínas mitocondriais e plastidiais são codificadas por genes nucleares e importadas do citosol. O dogma uma proteína-uma localização foi associado ao conceito de um gene-uma proteína na biologia celular. Entretanto, proteínas individuais podem ter mais de uma função, e mais recentemente, proteínas codificadas por um único gene foram identificadas em mais de um compartimento subcelular, o que deu origem ao conceito de duplo direcionamento (DD). Um exemplo bem estudado de DD vem das proteínas da família das aminoacil-tRNA sintetases (aaRS), que participam da síntese protéica ao acoplar o aminoácido ao seu tRNA cognato. Dentre as aaRSs, a glutamil-tRNA sintetase citosólica (GluRS), através de sua extensão N-terminal, parece estar envolvida com outras funções além da tradução. Em Arabidopsis thaliana, há dois genes nucleares que codificam a GluRS, um para uma proteína de duplo direcionamento (DD) e outro para uma proteína citosólica. Resultados recentes em nosso laboratório mostraram que a GluRS citosólica pode estar relacionada ao controle da localização subcelular de proteínas organelares em Arabidopsis. Para verificar um eventual papel desta proteína na localização subcelular de outras proteínas, foram realizados ensaios de duplo-híbrido em levedura, os quais mostraram interação entre a GluRS e a glutamina sintetase (GS) de Arabidopsis thaliana, proteína de DD para mitocôndrias e cloroplastos Esta interação foi confirmada in planta, sendo a sequência da GluRS responsável pela interação localizada na região N-terminal, do resíduo 207 ao 316. Análises filogenéticas apontam que esta região encontra-se ausente nas bactérias e que originou-se provavelmente em Archea, entre 2,6 e 1,8 bilhões de anos. Além disso, observa-se que esta sequência é conservada em fungos, musgos e plantas vaculares, tendo originado-se em Arabidopsis há cerca de 2 bilhões de anos. / In eukaryotic organisms, about 50% of cytoplasmic translated proteins are transported to the organelles, where they can play their roles. Thus, a complex system for intracellular transport was established. In plants, the presence of a second endosymbiont organelle, the plastid, turned this system still more intricated and required an additional transport mechanism. Besides, most of organellar proteins are coded by nuclear genes and imported from the cytosol. The one protein-one localization was associated to the idea of one gene-one protein, which has long been established in molecular biology. However, individual proteins can show more than one function, and recently, proteins coded by one single gene were identified in more than one subcellular compartment, which has originated the concept of dual targeting. One of the most studied example of dual targeted proteins is the aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) family, which are related to protein synthesis by attaching the correct amino acid onto the cognate tRNA molecule. Among the aaRSs, cytosolic glutamyl-tRNA synthetase (GluRS), through its N-terminal extension, seems to be involved in other cellular role beyond translation. In Arabidopsis thaliana, there are two genes encoding GluRS, one for a dual-targeted protein and other for a cytosolic protein. Recent results in our laboratory showed that GluRS interacts with proteins destinated to other organelles, which suggest that this protein might have a role in interfering on protein localization in Arabidopsis. In order to gain some information on the role of this protein in subcellular localization, yeast two-hybrid assays were performed. These studies showed the interaction between GluRS and glutamine synthetase (GS), a mitochondrial and chloroplastic dual-targeted protein. This interaction was confirmed in planta. In addition, the GluRS sequence associated to protein interaction was localized at its N-terminal portion, between the residues 207 316. Phylogenetic analysis revealed that this region is absent in bacteria and it probably arose from Archea between 2.6 and 1.8 billion years ago. Also, this sequence is conserved in fungi, moss and all the green plants investigated. Finally, datation analysis showed that this sequence arose in Arabidopsis between 2 and 1.7 billion years ago.

A regulação da localização de proteínas é um dos aspectos fundamentais na biologia celular vegetal. Os cloroplastos importam mais de 90% de suas proteínas do citosol, portanto, é importante caracterizar os fatores citosólicos que podem estar envolvidos no direcionamento de proteínas para as organelas. Um ensaio de duplohíbrido em leveduras com as proteínas cloroplastidiais HMPPK/TMPPase (TH1) e Glutamina Sintetase (GS) II usados como iscas revelou que a forma citosólica da glutamil-tRNA sintetase - GluRS (At5g26710) de Arabidopsis thaliana interagiu com ambas as proteínas. Estudos de Complementação da Fluorescência Bimolecular (BiFC) confirmaram tais interações in planta. Estudos com deleções na região Nterminal da GluRS mostraram que esta região é responsável pelas interações com HMPPK/TMPPase e GSII. Além disso, seis resíduos de aminoácidos parecem ser cruciais para a interação entre as proteínas. Curiosamente, foi mostrado que a GluRS está envolvida na localização de proteínas em leveduras. A fim de obter mais informações sobre o envolvimento da GluRS ns localização de proteínas nos cloroplastos, foram produzidos plantas de tabaco transgênicas expressando uma proteína quimérica, feita pela fusão do gene codificador da HMPPK/TMPPase, TH1- GFP, e GSII-GFP e posteriormente usados em ensaios de agroinfiltração com RNA de interferência (RNAi) para GluRS. Análises em microscópio confocal mostraram que TH1-GFP e GSII-GFP acumulam no citosol em vez de serem direcionados aos cloroplastos. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez que a GluRS está envolvida na localização de proteínas cloroplastidiais em plantas e esse mecanismo é também conservado em Saccharomyces cerevisiae. / Regulation of protein localization is one of the key aspects in plant cell biology. Chloroplasts import more than 90% of their proteins from the cytosol, therefore, it is important to identify and characterize cytosolic factors that might be involved in protein delivery to the organelar envelope. A yeast two-hybrid screen with a chloroplastlocalized HMPPK/TMPPase protein and glutamine synthetase (GS), used as baits, revealed that the cytosolic form of the glutamyl-tRNA synthetase (GluRS) (At5g26710) from Arabidopsis thaliana interacted with both proteins. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) studies confirmed such interactions in planta. Deletion studies of GluRS showed that the N-terminal region of the protein is responsible for proteinprotein interactions (PPI) with TH1 and GS. In addition, six amino acid residues appeared to be crucial for PPI. Interestingly, GluRS has been also shown to be involved in regulating protein localization in yeast. In order to gain more information about the involvement of GluRS on protein localization in chloroplasts, we produced transgenic tobacco plants expressing a chimeric protein made by the fusion of TH1- GFP and GSIIGFP and agroinfiltrated with a RNA interference (RNAi) construct against GluRS. Confocal analysis showed that TH1-GFP and GSII-GFP accumulated in the cytosol instead of being targeted to chloroplasts. Here, we show for the same time that GluRS is involved in protein localization in plants and this mechanism is also conserved in Saccharomyces cerevisiae.