Thesis (M. D. S.)--University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (leaf 51-57) Also available in print.

Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2005. / Title proper from title frame. Also available in printed format.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1984. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 182-191).

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-17T12:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T16:48:58Z : No. of bitstreams: 1 174636.pdf: 2462193 bytes, checksum: 4fa4689e88576335a1f0a6d099ad373f (MD5) / A hidrólise dos ácidos 2,8-carbóxi-N,N-dialquilnaftalâmicos, proposta como modelo não mimético de catálise enzimática por proteinases aspárticas, foi estudada determinando-se a constante de velocidade em função do pH, a uma temperatura de 35 °C. A análise do perfil de pH mostrou que a reação é predominantemente intramolecular na região entre pH = 2,00 e pH = 5,00, onde a decomposição dos ácidos2,8-carbóxi-N,N-dialquilnaftalâmicos ocorre com a participação dos dois grupamentos carboxílicos, um na sua forma ácida não dissociada e outro na forma dissociada (carboxilato), levando a formação do anidrido correspondente. O máximo de velocidade de reação é atingido quando estas duas espécies estão presentes. O efeito isotópico de solvente apresentou para o máximo de velocidade uma relação kH/kD = 1,04 o que, associado ao fato de não ocorrer variação na forma da curva, indica que nenhum próton esteja sendo transferido na etapa determinante da velocidade para esta reação. Parâmetros termodinâmicos calculados, mostraram que a reação apresenta uma dependência de fatores entrópicos e entálpicos.

Fitocistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas em plantas que atuam principalmente na inibição de papaínas. Entretanto, há uma demonstração in vitro de uma fitocistatina carboxi-estendida com capacidade de inibir também uma protease do tipo legumaína. Em arroz existem 12 genes de fitocistatinas, mas apenas um deles (OcXII), possui a extensão C-terminal. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender a diversidade e os mecanismos de interação entre as fitocistatinas e suas proteases cisteínicas alvo em arroz, com ênfase nas implicações funcionais da OcXII. Neste trabalho, nós demonstramos que, em arroz, os 12 genes de fitocistatinas têm um perfil de expressão gênica diferenciado na germinação e em respostas ambientais, sendo OcI, OcIII e OcXII os genes mais expressos. O peptídeo recombinante, correspondente à extremidade C-terminal da OcXII possui capacidade inibitória de legumaínas e não afeta a atividade das papaínas. Através do silenciamento transcricional da OcXII, via RNAi, foram obtidas plantas com atividades proteolíticas aumentadas tanto de papaínas quanto legumaínas, em adição a um fenótipo de crescimento inicial acelerado. O fenótipo oposto é observado em plântulas crescendo em condições alcalinas. Plantas expressando o promotor OcXII fusionado ao gene repórter gus demonstraram um perfil de ativação de OcXII durante a germinação, principalmente na região do escutelo das sementes. Esta ativação de OcXII permanece alta quando as sementes são mantidas com níveis elevados de ABA e sob estresse alcalino. Como alvos específicos de OcXII, as legumaínas estão relacionadas com a biossíntese de componentes vacuolares e degradação de proteínas de armazenamento. Em arroz, nós encontramos cinco diferentes loci para as legumaínas. Análises filogenéticas e estudos de expressão gênica demonstraram uma maior associação de OsaLeg2 e OsaLeg3 com tecidos de semente, e OsaLeg1, 4 e 5 com tecidos vegetativos. Também foram observadas formas de splicing alternativo, com potencial de originar diferentes isoformas ativas de legumaínas. Em geral, nossos dados demonstram o envolvimento bifuncional da OcXII nos processos de germinação e defesa interagindo e inibindo a atividade de proteases cisteínicas específicas, onde a região N-term de OcXII inibe papaínas, enquanto a C-term inibe legumaínas. / Phytocystatins are competitive inhibitors of cysteine proteases in plants, principally inhibiting papain-like proteases activity. However, there is one in vitro demonstration that a carboxy-extended phytocystatin can inhibit legumain-like proteases either. In rice there are 12 phytocystatins genes, but only one (OcXII) has the C-terminal extension. Thus, the aim of this study is to understand the diversity and interaction mechanisms among phytocystatins and its cysteine protease targets in rice, focusing on OcXII functional implications. In this work we demonstrated that in rice, the 12 phytocystatins genes have a different gene expression profile during the germination and environmental responses, while OcI OcIII and OcXII were the most expressed genes. A recombinant peptide corresponding to the different C-terminus of OcXII was produced and its inhibitory capacity was confirmed against legumains without affecting the activity of papains. OcXII transcriptional silencing, via RNAi, resulted in plants with increased proteolytic activity for both papain and legumains, in addition to an accelerated initial growth phenotype. The opposite phenotype is observed in seedlings growing under alkaline conditions. Plants expressing the OcXII promoter fused to gus reporter gene demonstrated an OcXII activation profile during germination, especially in the seed scutellum region. This OcXII activation remains high when the seeds are kept at high ABA levels or under alkaline conditions. As specific OcXII targets, legumains are related to the biosynthesis of vacuolar storage components and protein degradation. In rice, we found 5 different loci for legumains. Phylogenetic analyses and gene expression studies demonstrated a greater association of OsaLeg3 and OsaLeg2 with seed tissues, while OsaLeg1, 4 and 5 were more abundant in vegetative tissues. Also alternatively spliced forms were observed, with the potential to produce different isoforms of active legumains. Overall, our data demonstrate the involvement of the bifunctional OcXII in germination processes and defense, interacting and inhibiting the activity of specific cysteine proteases, where its N-term region inhibits papain, while the C-term inhibits legumains.

Fitocistatinas são inibidores competitivos de proteases cisteínicas em plantas que atuam principalmente na inibição de papaínas. Entretanto, há uma demonstração in vitro de uma fitocistatina carboxi-estendida com capacidade de inibir também uma protease do tipo legumaína. Em arroz existem 12 genes de fitocistatinas, mas apenas um deles (OcXII), possui a extensão C-terminal. Desta forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender a diversidade e os mecanismos de interação entre as fitocistatinas e suas proteases cisteínicas alvo em arroz, com ênfase nas implicações funcionais da OcXII. Neste trabalho, nós demonstramos que, em arroz, os 12 genes de fitocistatinas têm um perfil de expressão gênica diferenciado na germinação e em respostas ambientais, sendo OcI, OcIII e OcXII os genes mais expressos. O peptídeo recombinante, correspondente à extremidade C-terminal da OcXII possui capacidade inibitória de legumaínas e não afeta a atividade das papaínas. Através do silenciamento transcricional da OcXII, via RNAi, foram obtidas plantas com atividades proteolíticas aumentadas tanto de papaínas quanto legumaínas, em adição a um fenótipo de crescimento inicial acelerado. O fenótipo oposto é observado em plântulas crescendo em condições alcalinas. Plantas expressando o promotor OcXII fusionado ao gene repórter gus demonstraram um perfil de ativação de OcXII durante a germinação, principalmente na região do escutelo das sementes. Esta ativação de OcXII permanece alta quando as sementes são mantidas com níveis elevados de ABA e sob estresse alcalino. Como alvos específicos de OcXII, as legumaínas estão relacionadas com a biossíntese de componentes vacuolares e degradação de proteínas de armazenamento. Em arroz, nós encontramos cinco diferentes loci para as legumaínas. Análises filogenéticas e estudos de expressão gênica demonstraram uma maior associação de OsaLeg2 e OsaLeg3 com tecidos de semente, e OsaLeg1, 4 e 5 com tecidos vegetativos. Também foram observadas formas de splicing alternativo, com potencial de originar diferentes isoformas ativas de legumaínas. Em geral, nossos dados demonstram o envolvimento bifuncional da OcXII nos processos de germinação e defesa interagindo e inibindo a atividade de proteases cisteínicas específicas, onde a região N-term de OcXII inibe papaínas, enquanto a C-term inibe legumaínas. / Phytocystatins are competitive inhibitors of cysteine proteases in plants, principally inhibiting papain-like proteases activity. However, there is one in vitro demonstration that a carboxy-extended phytocystatin can inhibit legumain-like proteases either. In rice there are 12 phytocystatins genes, but only one (OcXII) has the C-terminal extension. Thus, the aim of this study is to understand the diversity and interaction mechanisms among phytocystatins and its cysteine protease targets in rice, focusing on OcXII functional implications. In this work we demonstrated that in rice, the 12 phytocystatins genes have a different gene expression profile during the germination and environmental responses, while OcI OcIII and OcXII were the most expressed genes. A recombinant peptide corresponding to the different C-terminus of OcXII was produced and its inhibitory capacity was confirmed against legumains without affecting the activity of papains. OcXII transcriptional silencing, via RNAi, resulted in plants with increased proteolytic activity for both papain and legumains, in addition to an accelerated initial growth phenotype. The opposite phenotype is observed in seedlings growing under alkaline conditions. Plants expressing the OcXII promoter fused to gus reporter gene demonstrated an OcXII activation profile during germination, especially in the seed scutellum region. This OcXII activation remains high when the seeds are kept at high ABA levels or under alkaline conditions. As specific OcXII targets, legumains are related to the biosynthesis of vacuolar storage components and protein degradation. In rice, we found 5 different loci for legumains. Phylogenetic analyses and gene expression studies demonstrated a greater association of OsaLeg3 and OsaLeg2 with seed tissues, while OsaLeg1, 4 and 5 were more abundant in vegetative tissues. Also alternatively spliced forms were observed, with the potential to produce different isoforms of active legumains. Overall, our data demonstrate the involvement of the bifunctional OcXII in germination processes and defense, interacting and inhibiting the activity of specific cysteine proteases, where its N-term region inhibits papain, while the C-term inhibits legumains.

Orientador: Edgard Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-26T10:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bolzani_Glaucia_M.pdf: 3179083 bytes, checksum: 274f319bc587a077d6785bd696b3bc19 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A ciclosporina-A (CSA) é uma droga imunossupressora, seletiva para linfócitos T, muito usada atualmente na prevenção da rejeição de transplantes de órgãos e de medula óssea. Dentre os efeitos colaterais da CSA está o aumento gengival, caracterizado principalmente por um acúmulo excessivo de matriz extracelular. Como o mecanismo através do qual a CSA atua na regulação da síntese e degradação de matriz extracelular ainda não é conhecido, o objetivo do presente trabalho foi estudar seu efeito sobre a produção das metaloproteinases de matriz (MMPs) e do colágeno tipo I por fibroblastos gengivais, através de eletroforese em SDS - PAGE, zimografia e western blots. Para isto, ratos foram tratados diariamente com 10mg/kg de peso corporal de CSA por, via subcutânea durante 30 e 60 dias, sendo que todos os animais tratados desenvolveram aumento gengiva!. A atividade gelatinolítica dos meios de cultura condicionados com os fragmentos de tecido gengival foi menor nos animais tratados com CSA que nos grupos controle. A atividade enzimática também foi inibida no meio de cultura condicionado por fibroblastos tratados com CSA. A análise através de western blots demonstrou que a produção de colagenase de fibroblastos (MMP-1 ) e de estromelisina-1 (MMP-3) por 7 diferentes linhagens de fibroblastos gengivais humanos em cultura também foi significativamente reduzida pela ação da CSA. Com relação ao colágeno tipo I, foi detectada uma maior quantidade desta glicoproteína na matriz extracelular da gengiva dos ratos tratados com CSA, em comparação com os controles, assim como em culturas primárias de fibroblastos gengivais tratados com esta droga / Abstract: Cyclosporin A (CyA) is an immunossupressant drug used to prevent rejection of allograft transplants and in the management of various autoimmune diseases that acts blocking interleukin-2 synthesis by CD4+lymphocytes. The gingival overgrowth affecting the attached gingiva of 25-80% of the treated patients, is a frequent side effect of CyA treatment in the oral cavity. The aim of the present work was to evaluate the effect of CyA on matrix metalloproteinases (MMPs) synthesis and activity as well as type I collagen production by gingival fibroblasts. Wistar rats were treated daily with 10mg/kg of body weight of CyA during 30 and 60 days to induce gingival overgrowth. After these periods, the gingival tissue was removed and used to study MMPs activity in zymographic assays as well as type I collagen deposition by SDS-PAGE. Primary cultures of fibroblasts from rats and 7 different clinically healthy human gingiva were established and used to analyze secretion and activity of MMPs in the culture medium. The cells were treated with different concentrations of CyA and analised by zymographic assays and western blots. The gelatinolytic activity of MMP-2 was strongly reduced by CyA treatment, both "in vivo" and in cell culture. In addition, the relative amounts of MMP-1 and MMP-3 in the culture medium was significanty reduced by CyA treatment and the amount of type I collagen in the hyperplastic rat gingival tissue was higher than in control animais. Our data clearly showed that CyA strongly reduces the activity and production of MMPs by gingival fibroblasts, probably leading to the accumulation of type I collagen and other macromolecules in the gingival connective tissue / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

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The A segment of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) is expressed as a polyprotein encoding three primary gene products, VP2, NS and VP3, from a large open reading frame. The nucleotide sequence for the A segment of the Sp isolate of IPNV was determined. The NS protein is the putative autocatalytic proteinase responsible for the cleavage of the polyprotein. The functional boundaries of the NS proteinase were mapped by plasmid deletion analysis and examined in an La vitro, translation system. The NS proteolytic activity was determined to lie within the EcoRI and Nsil restriction sites. Characterization of the NS proteinase also was approached by use of proteinase inhibitors and site-directed mutagenesis of the putative catalytic and cleavage sites. Eight proteinase inhibitors, representative of all four proteinase classes, were tested and all failed to inhibit the NS enzyme. Mutagenesis of a putative aspartyl proteinase catalytic motif, DTG, to VTG did not affect proteolytic processing. Additionally, the mutagenesis of the predicted N-terminal cleavage site did not alter processing, however, altered processing was observed when the predicted C-terminal cleavage site was mutated. The major capsid protein, VP2, was mapped with polyclonal and monoclonal antisera. The VP2 gene was digested with Sau3A and subcloned into the pATH expression vector. The trpE-fusion proteins were characterized with polyclonal and monoclonal antisera. Two immunoreactive regions were identified with anti IPNV-Sp sera. A common immunoreactive region, B10, was reactive with antisera to three serotypes of IPNV as well as a neutralizing monoclonal antibody, AS-1. A serotype specific immunoreactive region, A43, also was identified, being recognized only by anti IPNV-Sp sera. The B segment of IPNV encodes the putative RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), VP1. The nucleotide sequence for the B segment of the Sp isolate was determined and the deduced amino acid sequences were compared to other polymerases. Concensus sequences associated with GTP-binding proteins and RdRps were identified in the VP1 sequence. However, unlike RdRps associated with single-stranded RNA viruses, the IPNV VP1 proteins lack the Gly-Asp-Asp motif characteristic of this enzyme family. Additionally, the VP1 protein was expressed in a bacterial system and polyclonal antisera was raised against the protein. / Graduation date: 1993