Stuttgart, Univ., Diss., 2002.

Stuttgart, Univ., Diss., 2003.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

Universiẗat, Diss., 2002--München.

Proefschrift Maastricht. / Lit. opg. - Met een samenvatting in het Nederlands.

München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Les microparticules (MP) sont des vésicules qui résultent du bourgeonnement des membranesdes cellules activées ou apoptotiques. Leur capacité à vectoriser des systèmes fonctionnelsexprimés par leurs cellules d’origine nous a conduit à explorer, la génération de plasmine àleur surface. Dans un premier travail, nous montrons que les MP dérivées de cellulesendothéliales (MPE) sont des surfaces catalytiques capables d’activer le plasminogène par lesystème de l’urokinase et de son récepteur (uPA/uPAR). Les MPE agissent comme desvecteurs de plasmine constituant une nouvelle voie dans la régulation des activitésprotéolytiques de l’endothélium. Dans un second travail, nous avons montré que l’uPA portéepar les cellules ou par les MPE est spécifiquement impliquée dans un mécanismereconnaissance du plasminogène lié à une autre surface biologique générant de la plasmine insitu avec une grande efficacité. Dans un troisième travail, nous montrons que cette activitéfibrinolytique est détectable sur les MP extraites de la circulation sanguine, où elle est plusspécifiquement portée par les sous populations endothéliales et leucocytaires. Cette activitéqui est dépendante de l’uPA mais aussi de l’activateur tissulaire du plasminogène, estmodulée dans des pathologies cardiovasculaires et auto-immunes. Dans une seconde partie, lapertinence de la mesure des MP comme biomarqueur en pratique clinique nous a amené ànous focaliser sur leurs méthodes d’analyse. En effet, à l’heure actuelle, l’évaluation dubénéfice apporté par les MP est limitée par un manque de standardisation des méthodologies.Dans ce travail, nous présentons une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie enflux (CMF) et son évaluation dans le cadre d’une étude multicentrique utilisant des microbillesfluorescentes calibrées en taille. Enfin, nous discutons dans une revue les limitesactuelles de la CMF et les stratégies ou améliorations technologiques permettant de lesdépasser. / Microparticles (MP) are small vesicles resulting from the blebbing of cell membranes in response to activation or apoptosis. Because they express functional molecules from their parent cells, plasmin generation at their surface has been explored. First we have shown that endothelial derived MP (EMP) promote plasminogen activation at their surface in an urokinase and its receptor (uPA/uPAR) dependant manner. Thus, plasmin generation by EMP constitutes a new pathway for the regulation of the endothelium proteolytic activities. Second, we have shown that cellular or MP uPA is specifically involved in the recognition and effective activation of plasminogen bound to another biological surface. Third, we have demonstrated that circulating endothelial and leukocytes MP bear this plasminogenolytic activity which it not only uPA but also tissue-type plasminogen activator dependant and modulate in pathological settings such as cardiovascular and auto-immune diseases. Supported by this work, a patent on a method to measure MP plasmin activity has been filed. In a second part, we focused on analytical methods available to measure MP. Indeed, there is an increasing interest to measure MP as biomarker in clinical practice. However, the evaluation of their input for patients is impeding by methodological concerns and a lack of standardization so far. In this work, we present a new strategy based a size-calibrated fluorescent beads for the standardization of flow cytometry (FCM). This approach was evaluated in a multicentre study. Finally, we reviewed the present limitation of the FCM for MP measurement and the strategies or technological improvements to overcome them.

Die asexuellen Sporen von Aspergillus fumigatus sind ubiquitär verbreitete Luftkeime. Als Saprophyt ist dieser opportunistisch humanpathogene Pilz darauf spezialisiert, polymere Substanzen aus dem umgebenden Milieu zu zersetzen, um daraus die von ihm benötigten Nährstoffe zu generieren und aufzunehmen. Die Fähigkeit, verschiedene Stickstoff- und Kohlenstoffquellen zu verwerten, trägt dabei zu seiner Virulenz bei und hierbei scheint die extrazelluläre Proteolyse eine wichtige Rolle zu spielen. Sekretierte Proteasen, die das umgebende Gewebe während einer Infektion mit A. fumigatus erschließen, könnten somit zu dessen Pathogenität beitragen. Dementsprechend sollte im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung einer Regulation der extrazellulären proteolytischen Aktivität von A. fumigatus für dessen Virulenz untersucht werden. Dies geschah durch Untersuchungen eines konservierten Transkriptionsfaktors, PrtT. Dabei stellte sich heraus, dass PrtT die Expression der drei Hauptproteasen von A. fumigatus, Alp, Mep und Pep stark beeinflusst, in einem murinen Tiermodell der pulmonaren Aspergillose scheint dieser Regulator jedoch keine Rolle für die Pathogenität von A. fumigatus zu spielen. Um einen weiteren Aspekt des pilzlichen Aminosäurestoffwechsels zu beleuchten, wurde die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren als mögliche Virulenzdeterminate untersucht. Für den Menschen sind diese Aminosäuren essentiell, weshalb dieser Syntheseweg ein mögliches Ziel für antimykotische Substanzen darstellen könnte. Es konnten mehrere für A. fumigatus essentielle Komponenten des Shikimatweges identifiziert werden, des Weiteren wurden Deletionsmutanten in den Genen aroC und trpA, die für die Chorismatmutase bzw. Anthranilatsynthase der Biosynthese von Phenylalanin und Tyrosin bzw. Tryptophan kodieren, erzeugt und phänotypisch charakterisiert. Deren Untersuchung in einem alternativen Tiermodell der Aspergillose zeigte eine deutlich attenuierte Virulenz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie wichtig die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren für das Wachstum von A. fumigatus ist, und dass ein Eingriff in diesen Syntheseweg eine lohnende Strategie zur Entwicklung neuer Antimykotika sein könnte. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen die für den Schimmelpilz A. fumigatus typische Redundanz bezüglich extrazellulärer proteolytischer Enzyme und dass diese nur bedingt hinsichtlich ihres Virulenzbeitrags untersucht werden können. Im Gegensatz hierzu lassen sich bestimmte Stoffwechselwege, die oftmals durch einzigartige Genprodukte katalysiert werden, unter Umständen besser als unspezifische aber vielversprechende Virulenzdeterminanten identifizieren. / The air-borne spores of Aspergillus fumigatus are ubiquitously distributed. As a saprophyte, this fungus is well adapted to feed from the environment by degradation of polymeric substances and uptake of breakdown products. The nutritional versatility has to be regarded as virulence determinant in the development of pulmonary aspergillosis. Secreted proteolytic activities that degrade the surrounding lung tissue during infection may contribute to pathogenicity. Until now, knowledge on the regulation of the expression and secretion of proteases by A. fumigatus is scarce. Therefore, the role of extracellular proteolytic activity for pathogenicity of A. fumigatus was examined by characterisation of a global regulatory factor, PrtT, that acts on expression of secreted proteases. It could be shown that PrtT regulates the transcription of the major secreted proteases Alp, Mep and Pep. When tested in a leukopenic mouse model, the deletant strain is not attenuated in virulence, suggesting that the PrtT transcription factor - and accordingly extracellular proteolysis - supports virulence of this opportunistic pathogen only to a limited extent. To gain insight into the fungal biosynthesis pathway of amino acids, the aromatic amino acid biosynthesis was investigated concerning the aspect of a virulence determinant. In contrast to mammals, fungi are able for de novo synthesis of the aromatic amino acids. Therefore it might be a usable target for antifungal therapy since such pathway does not exist in humans. Some genes of the shikimate pathway could be shown to be essential for the survival of A. fumigatus. Virulence tests of strains with deletion of the genes aroC or trpA which encodes for the chorismate mutase and anthranilate synthase respectively, showed attenuated virulence of both strains. These results clarify the stringent necessity of the aromatic amino acid biosynthesis for the survival of A. fumigatus, concluding this biosynthesis pathway as a usable target for antimycotic substances. The results of this work emphasise the redundancy of extracellular proteolytic activities. In contrast specific pathways which are mostly catalysed by unique gene products may be identified as virulence determinant rather than unspecific factors.

Dresden, Techn. Univ., Diss., 2004.

Stuttgart, Universiẗat, Diss., 2005.