Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 15 décembre 2005). Bibliogr.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 sept. 2007). Bibliogr.

L'acétylcholine (ACh), bien connue comme neurotransmetteur chez les animaux, est le substrat des acétylcholinestérases eucaryotes et procaryotes (AChE). La structure et la fonction des AChE de mammifères ont été bien étudiées en raison de leur importance à la fois dans les synapses cérébrales cholinergiques, dans le système nerveux périphérique et également comme une cible médicamenteuse clé pour de nombreuses maladies telles que la maladie d'Alzheimer chez les humains. En revanche, les acétylcholinestérases procaryotes restent mal comprises malgré une longue historique d'études. La bactérie Pseudomonas aeruginosa possède le système d'acquisition de la choline comprenant l'enzyme ChoE, qui aide à importer la choline comme source de nutriments. Fait intéressant, ChoE a été identifiée comme une acétylcholinestérase putative qui présente des propriétés enzymatiques similaires aux AChE de mammifères malgré sa taille beaucoup plus petite. Dans ce travail, pour mieux comprendre l'acétylcholinestérase d'origine procaryote, nous avons effectué la caractérisation structurale et biochimique de ChoE en utilisant la cristallographie aux rayons X et l'enzymologie comme approches primaires. Nous avons démontré que ChoE est indispensable à la croissance de P. aeruginosa lorsque l'acétylcholine est utilisée comme seule source de carbone et d'azote. Un ensemble complet de structures à haute résolution de ChoE a été obtenu, y compris des complexes avec des substrats, des produits, un intermédiaire acyle ainsi qu'un inhibiteur. Ces structures ont révélé les déterminants moléculaires de la reconnaissance du substrat, des instantanés des différentes étapes catalytiques et la base moléculaire de l'inhibition du substrat à des concentrations élevées de substrat. D'après ces résultats, la libération retardée du produit acétate facilite la liaison non productive du substrat, provoquant l'inhibition du substrat. En utilisant une série de mutants, nous avons étudié le rôle des résidus critiques dans la triade catalytique, le trou oxyanion et la poche de liaison de la choline, tels que Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 et His288. Ces résultats ont révélé que Ser38 et His288 dans la triade catalytique sont essentiels pour l'activité ChoE tandis que Asp285 n'est pas essentiel. Conformément au mécanisme moléculaire déduit de ces structures, l'inhibition du substrat est abolie ou considérablement atténuée chez les mutants N147A, Y106A, D285N et W287A. Par-dessus tout, nous avons identifié trois conformations distinctes de Ser38 catalytique, dont la plasticité conformationnelle contrôle vraisemblablement la géométrie du site actif et donc les états fonctionnels de ChoE, ce qui est également corroboré par notre analyse structurale d'autres hydrolases SGNH. En résumé, ces travaux ont fourni des informations moléculaires sans précédent sur les acétylcholinestérases bactériennes et la famille des hydrolases SGNH. / Acetylcholine (ACh), a well-known neurotransmitter in animals, is the substrate of both eukaryotic and prokaryotic acetylcholinesterases (AChE). The structure and the function of mammalian AChEs have been well studied due to their importance in both cholinergic brain synapses and the peripheral nervous systems. They are also a key drug target for many diseases such as Alzheimer's disease in humans. In contrast, prokaryotic acetylcholinesterases remain poorly understood despite a long history of studies. Pseudomonas aeruginosa bacterium possesses the choline acquisition system including the enzyme ChoE, helping it to import choline as a nutrient source. ChoE has been identified as a putative acetylcholinesterase which exhibits similar enzymatic properties to mammalian AChEs despite its much smaller size. In this work, to better understand the acetylcholinesterase of prokaryotic sources, we performed the structural and biochemical characterization of ChoE using X-ray crystallography and enzymology as the primary approaches. We have demonstrated that ChoE is indispensable for P. aeruginosa growth when acetylcholine is used as the sole carbon and nitrogen source. A comprehensive set of high-resolution structures of ChoE have been obtained including the complexes of enzyme with substrates, products, acyl intermediate and inhibitor. These structures have revealed the molecular determinants for substrate recognition, snapshots of the various catalytic steps, and the molecular basis of substrate inhibition at high substrate concentrations. From these results, the retarded release of the acetate product facilitates the nonproductive binding of substrate causing substrate inhibition. Using a series of mutants, we have studied the role of critical residues in the catalytic triad, the oxyanion hole and the choline-binding pocket, such as Ser38, Tyr106, Asn147, Asp285, Trp287 and His288. These results indicated that both Ser38 and His288 in the catalytic triad are strictly required for ChoE activity while Asp285 is not essential. Consistent with the molecular mechanism deduced from our structures, substrate inhibition is abolished or significantly alleviated in the N147A, Y106A, D285N and W287A mutants. Importantly, we have identified three distinct conformations of catalytic Ser38, whose conformational plasticity presumably controls the active site geometry and thus the functional states of ChoE, which is also substantiated by our structural analysis of other SGNH hydrolases. In summary, this work has provided unprecedented molecular insights into both bacterial acetylcholinesterases and the SGNH hydrolase family.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram négatif possédant un métabolisme très versatile lui permattant de proliférer dans plusieurs types environnements. Sa capacité à produire plusieurs facteurs de virulence lui permet de causer des infections opportunistes tel que des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique. Notre équipe a développé la mutagénèse à étiquette, basée sur la PCR (PCR based Siggnature-tagged mutagenesis), permettant de cribler une banque de 7968 mutants. Cette technique a permis la sélection de 214 mutants représentant des évènements d’insertion d’un mini-transposon dans 148 gènes différents. De ces nouveaux gènes essentiels à l’infection par P. aeruginosa, nous avons choisi de caractériser le gène PA3498. Nous avons conclu que la protéine codée par ce gène est nécessaire à l’initiation et/ou au maintien du pathogène in vivo ainsi qu’à la maturation des protéases sécrétées par P. aeruginosa et qu’elle est homologue à l’oxydoréductase PDR de Burkholderia cepacia. / Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacteria causing chronic pulmonary infections in cystic fibrosis patients. Virulence factors of this pathogen facilitate the colonization of the pulmonary tract and lungs of cystic fibrosis patients. Our team has developed a PCR-based signature-tagged mutagenesis technique permitting the screening of a collection of 7968 mutants. A total of 214 mutants, representing transposition events into 148 open reading frames, were shown to be attenuated in lung infection and were retained for further analysis. Of these genes, we chose PA3498 for its characterization. We have concluded that this gene is coding for an oxydoreductase sharing homology with a familly of oxydoreductases including PDR protein of Burkholderia cepacia. Finally, PA3498 protein is needed to initiate or/and to maintain the pathogen in vivo and this protein plays a role in the maturation and processing of the P. aeruginosa exoproteases.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Pseudomonas aeruginosa est l’agent pathogène principal causant des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). Le mutant STM_modA dérivé de la souche P. aeruginosa PAO1 a été obtenu par mutagénèse par étiquette-signature et est donc incapable de persister dans le poumon d’un modèle de rat. Le mutant STM_modA présente une mutation par insertion interrompant le cadre de lecture du gène modA, dont le produit fait partie du transporteur ModABC qui permet l’internalisation du molybdate depuis l’espace périplasmique. Le molybdate est la forme environnementale et assimilable du molybdène, essentiel pour l’activité des molybdoenzymes. Il a été démontré par les présents travaux que l’activité du transporteur ModABC est essentielle pour l’infection pulmonaire chronique chez le rat, pour la formation du biofilm, pour la résistance à la prédation par l’amibe Dictyostelium discoideum, pour la dénitrification et la croissance anaérobie subséquente, ainsi que pour l’expression du transcriptome en conditions anaérobies. / Pseudomonas aeruginosa is the main pathogen causing chronic lung infections in cystic fibrosis patients. The genome of the laboratory reference strain PAO1 was sequenced revealing its highly complex virulence regulatory network and a large part of genes of unknown function. A PCR-based signature tagged mutagenesis (STM) allowed the identification of 148 genes essential for chronic lung infection in a rat model. The PAO1-derivated strain STM_modA was obtained using this technique and is thus unable to persist in the rat lug in competition with a pool of strains. This strain carries an insertional mutation interrupting the open reading frame of the modA gene. This gene codes with the co-transcribed modB and modC genes for an ATP-binding cassette transporter (ModABC) responsible for the internalization of molybdate from the periplasmic space. Molybdate is the environmental molybdenum-containing ion, which is essential for the activity of the molybdoenzymes, a group of enzymes involved in a wide range of metabolic functions. The present work demonstrates that the ModABC transporter activity is essential for chronic lung infection in a rat model, for biofilm formation, for resistance to predation by the amoeba Dictyostelium discoideum as well as for denitrification and subsequent anaerobic growth. Whole transcriptome shotgun sequencing demonstrated major changes in the gene transcription levels of STM_modA in comparison with wild-type PAO1 in anaerobic conditions. This work highlights the ModABC transporter as a potential target for the inhibitors development, a new strategy for antimicrobial research.

Pseudomonas aeruginosa souche LESB58 est une bactérie pathogène connue pour sa versatilité, son antibiorésistance et son caractère opportuniste émergent qui le rend responsable d'infections nosocomiales importantes en milieu hospitalier. Dans le cadre de ce travail, nous posons l’hypothèse qu’il est possible d’étudier le génome de la bactérie pathogène P. aeruginosa souche LESB58 par une approche de modélisation métabolique et analyse in silico à partir des annotations de son génome séquencé. Nous utilisons une approche basée sur les contraintes nommée « Fc (FBA) » pour analyser le modèle in silico. Comme le génome de P. aeruginosa n’est pas très caractérisé et qu’il contient un nombre considérable de gènes sans annotation fonctionnelle, nous n’avons pas terminé la reconstruction à l’échelle génomique. Comme un nombre important de relations « génotype-phénotype » n’ont pu être établies, nous avons débuté une analyse de génomique comparative de quatre souches séquencées de P. aeruginosa, soit les souches LESB58, PAO1, PA7 et PA14, afin de cibler les gènes impliqués dans les phénotypes connus de P. aeruginosa. Le but de ce travail a été de s’initier aux méthodes d’analyses métaboliques in silico et de recherches de relations « génotype-phénotype » pouvant reconstruire un modèle in silico.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui cause des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de fibrose kystique (FK). Certaines souches, adaptées au microenvironnement des poumons FK, se distinguent, entre autres, par une résistance accrue aux antibiotiques et une formation abondante de biofilm. L'étude d'isolats provenant de patients FK est nécessaire afin de comprendre les déterminants génétiques expliquant cette adaptation et trouver de nouveaux moyens de lutter contre cette bactérie. Une librairie de mutants de LESB58, souche épidémique chez les patients FK, a été créée en 2009. Dans l’étude présentée ici, un criblage successif dans trois hôtes différents a été réalisé sur ces mutants, permettant d'identifier un mutant particulièrement peu virulent : le mutant STM PALES_11731. Ce mutant, contrairement à la souche sauvage, s'est avéré incapable de former des biofilm-like structures (BLS), une forme d'agrégation bactérienne ressemblant à du biofilm, mais flottant dans le milieu de culture. Afin d’évaluer ce phénomène chez différentes souches, la formation de biofilm adhéré et de BLS chez LESB58 et trois autres souches (la référence PAO1 et deux souches environnementales, PPF-1 et Urg-7) a été comparée à l'aide d'une nouvelle approche de quantification par analyse d'images. L’effet de cations divalents sur la formation de ces structures a également été exploré. Une diversité dans les phénotypes de formation de biofilms et de BLS et a été observée. Un manque de corrélation entre la formation de biofilms adhérés et de BLS a également été noté, suggérant que ces phénomènes pourraient ne pas être directement reliés et soulevant plusieurs questions sur les mécanismes de formation des BLS. Les résultats de ce projet de maîtrise indiquent que les BLS pourraient jouer un rôle dans la virulence de P. aeruginosa chez les patients FK et soulèvent l’importance de déterminer les mécanismes moléculaires ou physiques responsables de leur formation. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen known to cause chronic lung infections in cystic fibrosis (CF) patients. Some strains, adapted to the CF lung microenvironment, show distinguishing phenotypes such as an increased resistance to antibiotic treatments and an enhanced biofilm formation. The study of P. aeruginosa isolates from CF patients is necessary to understand the genetic determinants explaining this adaptation and to allow the development of new ways to fight this bacterium. A library of LESB58 mutants has been created in 2009. LESB58 is an epidemic strain among CF patients. In the study presented here, a sequential screening in three different hosts has been performed, leading to the identification of a mutant with a strong virulence defect: the STM PALES_11731 mutant. This mutant, contrary to the wild type, was unable to form biofilm-like structures (BLSs), a type of bacterial aggregation resembling biofilm, but floating in the culture medium. To assess this phenomenon among P. aeruginosa strains, the formation of adhered biofilm and BLSs in LESB58 and three other strains (the reference strain PAO1 and two environmental strains, PPF-1 and Urg-7) was compared using a novel image analysis quantification approach. The impact of the addition of divalent cations on the formation of those structures was also assessed. The results obtained demonstrate some diversity of biofilm and BLS formation in this bacterial species. They also reveal a lack of correlation between the BLS and adhered biofilm formation response to the ion treatment, suggesting that these two phenomena might not be directly related and raising questions about the mechanisms of BLS formation. The results of this project indicate that BLSs could play a role in the virulence of P. aeruginosa in CF patients and highlight the importance, in a future study, of studying the molecular and physical mechanisms responsible for their formation.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2001. / Bibliogr.: f. 67-74. Publié aussi en version électronique.