Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

Este estudo buscou estabelecer um sistema de produção de pps, contendo a proteína Gag do MLV para formação da cápside, as glicoproteínas de membrana E1 e E2 do HCV carregando o RNA da glicoproteína do vírus da raiva - RVGP (ppHCV-RVGP). Para gerar ppHCV-RVGP, células HEK293-T foram co-transfectadas com 3 vetores, utilizando lipofectamina e eletroporação. As ppHCV-RVGP foram coletadas do sobrenadante 48 h p.t e quantificadas por qRT-PCR foram obtidas 300 cópias de RNA/μL, para ambos os métodos de co-transfecção. Células Huh 7 foram infectadas e a expressão da RVGP foi analisada 48 h p.i. por ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Estes imunoensaios mostraram a baixa expressão da proteína RVGP. Realizamos ensaios de qRT-PCR para detectar a adesão e entrada da ppHCV-RVGP e verificou-se que a estas foram ineficientes. Realizamos western blotting para analisar a expressão das proteínas necessárias para a formação das ppHCV, este mostrou a produção da proteína Gag e a incorporação das proteínas de membrana, porém a glicoproteína E2 não foi incorporada eficientemente na membrana da ppHCV. Concluímos que o sistema de pseudopartículas virais foi eficiente para transportar o RNA-RVGP, porém não foi capaz de infectar eficientemente células Huh 7. / The aim of this study was to establish a system for the production of pps, containing the protein Gag of MLV to form the capsid, the glycoproteins membrane E1 and E2 of HCV and carrying the RNA of glycoprotein of rabies virus - RVGP (ppHCV-RVGP). To produce ppHCV-RVGP, HEK293-T cells were co-transfected with 3 vectors using lipofectamine and electroporation. The pps were harvested from the supernatant 48 h p.t. and quantificated by qRT-PCR and resulted in 300 copies of RNA/μL, to both methods of co-transfection. Huh 7 cells were infected and RVGP expression was analyzed 48 hours after by ELISA and indirect immunofluorescence (IFI) assays. These immunoassays showed a low expression of RVGP. Others assays of qRT-PCR conducted to detect the adhesion and entry of ppHCV-RVGP showed that this process was inefficient. We performed western blotting assays to analyze the proteins required to form the ppHCV. Western blotting assays that the production of Gag protein and incorporation of glycoproteins were successful, however E2 glycoprotein has not been incorporated efficiently on ppHCV membrane. In conclusion, the system of virus pseudoparticles was efficient in carrying the RNA-RGVP, although was not able to efficiently infect Huh 7 cells.

Células HEK293T e Huh7 foram adaptadas em meios livres de soro fetal bovino (SFM). Parâmetros metabólicos e de crescimento foram avaliados, além da expressão gênica heteróloga, utilizando um sistema de expressão que produz pseudo-partículas (ppHCV), derivadas do vírus da Leucemia Murina (MLV) e da Hepatite C (HCV). A adaptação foi realizada através de diluição sequencial para SFM. A linhagem HEK293T foi adaptada em dois SFM: Hybridoma-SFM e CHO-S-SFMII, a linhagem Huh7 foi adaptada nos quatro SFM escolhidos. O consumo de substratos para cada linhagem foi diferente entre os SFM, apesar de o crescimento celular ter sido semelhante. Para a análise da expressão gênica, três vetores foram co-transfectados em células HEK293T. Foi observado que para a produção de ppHCV, o tempo de coleta foi de 48 horas. O método de co-transfecção por lipofectamina produziu mais cópias de vírus, sendo que quantificações de 5,30x103 cópias RNA/μL foram encontradas para vírus produzidos em células adaptadas no meio Hybridoma-SFM através de qRT-PCR. Estas ppHCV foram usadas para infectar células Huh7, células infectadas produziram cerca de 10 ng de proteína recombinante/106 células. / HEK 293-T and Huh7 cells were adapted in serum free mediu (SFM). Metabolic and growth parameters were assessed, as well as heterologous gene expression, using an expression system that produces pseudo-particles (ppHCV), derived from the murine leukemia virus (MLV), and Hepatitis C (HCV). The adaptation was performed by sequential dilution in SFM. The HEK- 293T line was adapted in two SFM: Hybridoma-SFM and CHO-S-SFMII, the Huh7 line was adapted in four chosen SFM. The consumption of substrates were different for each line in SFM, while cell growth was similar. For the analysis of gene expression, three vectors were co-transfected into HEK-293T cells. It was observed that for the production of ppHCV, the collection time was 48 hours. The method of co-transfection with lipofectamine produced more copies of the virus into the cells, 5,30 x103 RNA copies/μL were found to virus produced in the cells adapted in Hybridoma- SFM, by qRT-PCR. These ppHCV were used to infect Huh 7, infected cells produced around 10 ng recombinant protein /106 cells.

A hepatite viral causada pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema à saúde mundial e afeta cerca de 170 milhões de pessoas. O caso crônico da doença resulta em cirrose hepática e a maioria dos pacientes tratados não desenvolve uma resposta imune satisfatória. A proteína não estrutural 3 (NS3) pode estimular uma resposta celular que auxilia a resposta nos infectados. Nosso trabalho desenvolveu duas pseudopartículas virais que carregam um material genético para a protease da NS3 do HCV. Um dos sistemas, a HCVpp é constituída por proteínas do vírus da leucemia murina e outras do HCV. E o outro sistema, a partícula viral é baseada no Semliki Forest Virus (SFV). As células HEK293T e BHK-21 foram transfectadas para a formação das pseudopartículas HCVpp-NS3p1a e SFV-NS3p1a, respectivamente. Essas partículas foram quantificadas pela presença do material genético da NS3 por qRT-PCR, atingindo uma produção aproximada de 4x105 partículas HCVpp-NS3p1a/mL e 2,5x107 partículas SFV-NS3p1a/mL. Essas partículas foram utilizadas para infecção de células HuH-7.0 e BHK-21. / Viral hepatitis caused by the hepatitis C virus (HCV) is a global health problem, affecting about 170 million people. The chronic case of the disease results in liver cirrhosis and most patients do not develop a satisfactory immune response. The nonstructural protein 3 (NS3) can stimulate a cellular response that helps answer the infected. Our work has developed two viral pseudoparticles who carry a genetic material for the HCV NS3 protease. One of the systems is constituted by the HCVpp proteins of murine leukemia virus and other HCV. The other system, the viral particle is based on the Semliki Forest Virus (SFV). The HEK293T and BHK-21 cells were transfected for forming the pseudoparticles HCVpp-NS3p1a and SFV-NS3p1a, respectively. These particles were quantified by the presence of genetic material of NS3 by qRT-PCR, reaching a production of about 4x105 HCVpp-NS3p1a particles/mL and 2,5 x107 SFV-NS3p1a particles /mL. These particles were used for infection of Huh-7.0 cells and BHK-21.

A hepatite viral causada pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema à saúde mundial e afeta cerca de 170 milhões de pessoas. O caso crônico da doença resulta em cirrose hepática e a maioria dos pacientes tratados não desenvolve uma resposta imune satisfatória. A proteína não estrutural 3 (NS3) pode estimular uma resposta celular que auxilia a resposta nos infectados. Nosso trabalho desenvolveu duas pseudopartículas virais que carregam um material genético para a protease da NS3 do HCV. Um dos sistemas, a HCVpp é constituída por proteínas do vírus da leucemia murina e outras do HCV. E o outro sistema, a partícula viral é baseada no Semliki Forest Virus (SFV). As células HEK293T e BHK-21 foram transfectadas para a formação das pseudopartículas HCVpp-NS3p1a e SFV-NS3p1a, respectivamente. Essas partículas foram quantificadas pela presença do material genético da NS3 por qRT-PCR, atingindo uma produção aproximada de 4x105 partículas HCVpp-NS3p1a/mL e 2,5x107 partículas SFV-NS3p1a/mL. Essas partículas foram utilizadas para infecção de células HuH-7.0 e BHK-21. / Viral hepatitis caused by the hepatitis C virus (HCV) is a global health problem, affecting about 170 million people. The chronic case of the disease results in liver cirrhosis and most patients do not develop a satisfactory immune response. The nonstructural protein 3 (NS3) can stimulate a cellular response that helps answer the infected. Our work has developed two viral pseudoparticles who carry a genetic material for the HCV NS3 protease. One of the systems is constituted by the HCVpp proteins of murine leukemia virus and other HCV. The other system, the viral particle is based on the Semliki Forest Virus (SFV). The HEK293T and BHK-21 cells were transfected for forming the pseudoparticles HCVpp-NS3p1a and SFV-NS3p1a, respectively. These particles were quantified by the presence of genetic material of NS3 by qRT-PCR, reaching a production of about 4x105 HCVpp-NS3p1a particles/mL and 2,5 x107 SFV-NS3p1a particles /mL. These particles were used for infection of Huh-7.0 cells and BHK-21.