A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.

A raiva é uma antropozoonose e causa a morte de 55 mil pessoas anualmente no mundo. Neste trabalho foi utilizado um sistema genético derivado do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) carregando RNA para expressão gênica da glicoproteína do vírus da raiva (RVGP) e da proteína verde fluorescente (GFP), a título de controle do experimento. Lotes de partículas virais de SFV-RVGP e SFV-GFP foram obtidos em células BHK-21 e quantificados através de qRT-PCR. Foram realizados ensaios de infecção tanto com vírus ativado e não ativado em duas linhagens de macrófagos murinos IC-21 e J774A-1. A expressão da proteína RVGP foi avaliada pelo teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) e a expressão da proteína GFP analisada por Microscopia de Fluorescência e Citometria de Fluxo em ambas as linhagens. A entrada do vírus SFV em células de mamíferos ocorre após 2 horas da infeção e de acordo com o experimento no qual analisamos a titulação viral do sobrenadante celular, indicaram que até as 72 horas pós infecção a titulação viral se manteve com o mesmo valor inicial, sugerindo que não houve entrada dos vírus na célula por transdução ou por fagocitose. / Rabies is a anthropozoonosis and causes the death of 55,000 people worldwide each year. In this work we used a genetic system derived from the Semliki forest virus (SFV) carrying RNA for gene expression of the rabies virus glycoprotein (RVGP) and green fluorescent protein (GFP), by way of experiment control. Plots of viral particles of SFV-RVGP and SFV-GFP were obtained in BHK-21 cells and quantified by qRT-PCR. Infection assays were performed both with activated and not activated in two virus strains of murine macrophages IC-21 and J774A-1. The expression of RVGP protein was assessed by indirect immunofluorescence test (IFI) and the expression of GFP protein analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometry in both strains. The SFV entry of viruses into mammalian cells occurs after 2 hours of infection and according to the experiment in which we analyzed the viral titer of the cell supernatant showed that by 72 hours post-infection viral titer remained at the same initial value, suggesting no entry of virus into the cell by transduction or by phagocytosis.

Arboviruses are transmitted between vertebrate hosts by arthropod vectors, such as mosquitoes or ticks. In vertebrates arboviruses cause cytopathic effects and disease, however, arbovirus infection of arthropods usually results in persistence. Control of arboviral infection is mediated by the arthropod’s immune system. Pathways such as RNAi, JAK/STAT, Toll and IMD have previously been implicated in controlling arbovirus infections. In contrast, the antiviral role of other pathways in mosquitoes, such as melanisation, is unknown. Using high through output 454 sequencing the transcriptome of U4.4 cells infected with the model arbovirus Semliki Forest virus (SFV)(Togaviridae, Alphavirus) was generated. This experiment revealed intriguing patterns of differential transcript abundance that suggest a broad impact of SFV infection in U4.4 cells, such as in metabolism, cell structure and nucleic acid processing. SFV infection induces differential expression of genes in pathways such as apoptosis, stress response and cell cycle. Most interestingly, this study indicated that melanisation might have an antiviral role in mosquitoes. In arthropods, melanisation is a process involved in wound healing and antimicrobial defences. Phenoloxidase (PO), a key enzyme involved in melanisation, is cytotoxic and therefore kept in its inactive form, prophenoloxidase (PPO), until activation is triggered. The PPO activation process is tightly regulated by serine protease inhibitors (serpins) which inhibit the proteolytic activation reaction. In this thesis I demonstrate that the supernatant of cultured Aedes albopictus-derived U4.4 cells contains a functional proPO-activating system, which is activated by infection with bacteria and virions of SFV. Activation of this pathway reduces the spread and infectivity of SFV in vitro and in vivo. In order to further characterise the PO cascade and its antiviral role the serpins in Ae. albopictus were also investigated. Using the transcriptome sequencing and bioinformatics we identified and classified 11 serpins. We silenced each of the serpins and monitored PPO levels and antiviral activity showing that homologues to drosophila’s serpin- 27a plays a role in melanisation against SFV in vitro. Collectively, these results characterise the mosquito PO cascade as a novel immune defence against arbovirus infection in mosquitoes.

Vacinação contra doenças virais e bacterianas tem sido uma das histórias de sucesso da medicina humana e veterinária. Vacinas genéticas são constituídas apenas de DNA (como plasmídeos) ou RNA (como mRNA), que são entregues às células alvo. Esta abordagem proporciona uma vantagem significativa, pois essas preparações em geral apresentam facilidade de construção genética, baixo custo, rapidez de produção em massa, estabilidade elevada e um perfil de segurança atraente. Vacinas baseadas em RNA recentemente receberam maior atenção porque, ao contrário de vacinas de DNA, são processadas no citoplasma, excluindo a necessidade de entrada no núcleo celular. O vírus Semliki Forest (SFV, Alphavirus, Togaviridae ) possui um RNA genômico, auto replicativo, de simples fita e polaridade positiva, protegido em uma nucleocápside icosaédrica, composta pelo próprio RNA e pela proteína de cápside viral (C), de 267 aminoácidos. A nucleocápside contém 180 cópias da proteína C e é coberta por uma membrana lipoprotéica contendo as glicoproteínas virais. Para realizar a entrega de moléculas de RNA com fins de imunização é fundamental que o material esteja protegido da ação de enzimas. Assim, o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína C recombinante de SFV em E.coli , associá-la in vitro com RNA auto replicativo, contendo gene repórter e fazer entrega deste complexo à célula alvo. Para isso, o gene da proteína C foi obtido de forma sintética e clonado em um vetor de expressão em bactérias, pET-28a(+). Para a expressão da proteína C recombinante foram utilizadas bactérias E. coli BL21(DE3) e testadas diferentes temperaturas após indução com IPTG. A proteína obtida foi purificada por cromatografia de afinidade e a amostra foi dialisada utilizando coluna de dessalinização. Após a purificação, a proteína recombinante foi submetida a uma associação in vitro com RNA, obtido através de transcrição in vitro . A eficiência de formação do complexo Proteína-RNA foi medida pela quantidade diferencial de RNA livre antes e após o procedimento por eletroforese em gel de agarose e pela análise através de imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão. A entrega do complexo Proteína-RNA foi realizada de forma eficiente à célula alvo. Desta forma, de maneira geral, a proteína de capsídeo do vírus SFV é capaz de se associar in vitro com RNA auto replicativo, trazendo proteção e estabilidade ao mesmo, bem como realizar a entrega desse material à célula alvo, através da desmontagem da nucleocápside no interior da célula hospedeira. / Vaccination against viral and bacterial diseases has been one of the success stories of human and veterinary medicine. Genetic vaccines consist only of DNA (such as plasmids) or RNA (such as mRNA), which are delivered to target cells. This approach provides a significant advantage as these preparations generally have ease of genetic engineering, low cost, fast mass production, high stability and attractive safety profile. Unlike DNA vaccines, RNAbased vaccines are processed into the cytoplasm, excluding the need for entry into the cell nucleus. The Semliki Forest virus (SFV, Alphavirus, Togaviridae ) has a positive-strand and auto amplify RNA, protected in an icosahedral nucleocapsid, composed of viral RNA and the 267 amino acid capsid protein (C). The nucleocapsid contains 180 copies of protein C and is covered by a lipoprotein membrane containing the viral glycoproteins. In order to carry out the delivery of RNA molecules for immunization purposes, it is essential that the material is protected from the action of enzymes. Thus, the objective of this work was to express recombinant SFV C protein in E.coli, to associate it in vitro with auto replicative RNA, containing reporter gene and to deliver this complex to the target cell. For this, the protein C gene was synthesized and cloned into a bacterial expression vector, pET-28a (+). For expression of recombinant protein C, E. coli BL21 (DE3) bacteria were used and different temperatures tested after IPTG induction. The obtained protein was purified by affinity chromatography and the sample was dialyzed using desalting column. After purification, the recombinant protein was subjected to an in vitro association with RNA, obtained by in vitro transcription. The efficiency of formation of the Protein-RNA complex was measured by the differential amount of free RNA before and after the procedure by agarose gel electrophoresis and by the analysis through images obtained by transmission electron microscopy. Delivery of the Protein-RNA complex was efficiently performed on the target cell. Thus, in general, the SFV virus capsid protein is able to associate in vitro with auto amplify RNA, providing protection and stability to it, as well as delivering this material to the target cell, by disassembling the nucleocapsid in the interior of the host cell.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

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A hepatite viral causada pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema à saúde mundial e afeta cerca de 170 milhões de pessoas. O caso crônico da doença resulta em cirrose hepática e a maioria dos pacientes tratados não desenvolve uma resposta imune satisfatória. A proteína não estrutural 3 (NS3) pode estimular uma resposta celular que auxilia a resposta nos infectados. Nosso trabalho desenvolveu duas pseudopartículas virais que carregam um material genético para a protease da NS3 do HCV. Um dos sistemas, a HCVpp é constituída por proteínas do vírus da leucemia murina e outras do HCV. E o outro sistema, a partícula viral é baseada no Semliki Forest Virus (SFV). As células HEK293T e BHK-21 foram transfectadas para a formação das pseudopartículas HCVpp-NS3p1a e SFV-NS3p1a, respectivamente. Essas partículas foram quantificadas pela presença do material genético da NS3 por qRT-PCR, atingindo uma produção aproximada de 4x105 partículas HCVpp-NS3p1a/mL e 2,5x107 partículas SFV-NS3p1a/mL. Essas partículas foram utilizadas para infecção de células HuH-7.0 e BHK-21. / Viral hepatitis caused by the hepatitis C virus (HCV) is a global health problem, affecting about 170 million people. The chronic case of the disease results in liver cirrhosis and most patients do not develop a satisfactory immune response. The nonstructural protein 3 (NS3) can stimulate a cellular response that helps answer the infected. Our work has developed two viral pseudoparticles who carry a genetic material for the HCV NS3 protease. One of the systems is constituted by the HCVpp proteins of murine leukemia virus and other HCV. The other system, the viral particle is based on the Semliki Forest Virus (SFV). The HEK293T and BHK-21 cells were transfected for forming the pseudoparticles HCVpp-NS3p1a and SFV-NS3p1a, respectively. These particles were quantified by the presence of genetic material of NS3 by qRT-PCR, reaching a production of about 4x105 HCVpp-NS3p1a particles/mL and 2,5 x107 SFV-NS3p1a particles /mL. These particles were used for infection of Huh-7.0 cells and BHK-21.

Les Récepteurs Couplés aux Protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires chez l’Homme, et leur implication dans un grand nombre de processus physiologiques justifie pleinement l’intérêt de leur étude. Les anticorps spécifiques de ces récepteurs sont des outils polyvalents à haute valeur ajoutée, qui restent toutefois encore trop rarement disponibles, notamment en raison des difficultés techniques posées par leur génération. Ce manuscrit présente la mise au point d’une méthode d’immunisation alternative et innovante, mettant en jeu des particules virales recombinantes dérivées du Virus de la Forêt de Semliki (SFV) codant pour le récepteur d’intérêt. Appliquée au récepteur de l’adénosine A2A humain, l’immunisation permet d’engendrer la surexpression de celui-ci à la surface des cellules de l’animal infecté, et de provoquer l’apparition d’une réponse immunitaire. Cette approche permet d’une part de générer un sérum polyclonal de souris spécifique au récepteur, et ouvre donc une nouvelle voie pour l’obtention d’anticorps monoclonaux murins. Elle semble d’autre part prometteuse pour la génération de nanobodies. / G Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest membrane protein family represented in the human genome. Their involvement in a wide number of biological processes fully supports their study. GPCR-targeting antibodies are versatile and valuable tools, which remain scarcely available, chiefly because their generation is a challenging process. This thesis presents an alternative and innovative strategy in which recombinant Semliki Forest Virus (SFV) particles coding for the receptor of interest are used as immunogens. When applied to the human version of the Adenosine A2A receptor, this method enables to cause the receptor’s overexpression at the surface of the infected animal cells, which generates an immune response. This strategy enables to raise receptor-specific mouse polyclonal serum. It opens a new path towards the generation of monoclonal mouse antibodies. Additionally, it seems to also be a promising approach to develop nanobodies.

A hepatite viral causada pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema à saúde mundial e afeta cerca de 170 milhões de pessoas. O caso crônico da doença resulta em cirrose hepática e a maioria dos pacientes tratados não desenvolve uma resposta imune satisfatória. A proteína não estrutural 3 (NS3) pode estimular uma resposta celular que auxilia a resposta nos infectados. Nosso trabalho desenvolveu duas pseudopartículas virais que carregam um material genético para a protease da NS3 do HCV. Um dos sistemas, a HCVpp é constituída por proteínas do vírus da leucemia murina e outras do HCV. E o outro sistema, a partícula viral é baseada no Semliki Forest Virus (SFV). As células HEK293T e BHK-21 foram transfectadas para a formação das pseudopartículas HCVpp-NS3p1a e SFV-NS3p1a, respectivamente. Essas partículas foram quantificadas pela presença do material genético da NS3 por qRT-PCR, atingindo uma produção aproximada de 4x105 partículas HCVpp-NS3p1a/mL e 2,5x107 partículas SFV-NS3p1a/mL. Essas partículas foram utilizadas para infecção de células HuH-7.0 e BHK-21. / Viral hepatitis caused by the hepatitis C virus (HCV) is a global health problem, affecting about 170 million people. The chronic case of the disease results in liver cirrhosis and most patients do not develop a satisfactory immune response. The nonstructural protein 3 (NS3) can stimulate a cellular response that helps answer the infected. Our work has developed two viral pseudoparticles who carry a genetic material for the HCV NS3 protease. One of the systems is constituted by the HCVpp proteins of murine leukemia virus and other HCV. The other system, the viral particle is based on the Semliki Forest Virus (SFV). The HEK293T and BHK-21 cells were transfected for forming the pseudoparticles HCVpp-NS3p1a and SFV-NS3p1a, respectively. These particles were quantified by the presence of genetic material of NS3 by qRT-PCR, reaching a production of about 4x105 HCVpp-NS3p1a particles/mL and 2,5 x107 SFV-NS3p1a particles /mL. These particles were used for infection of Huh-7.0 cells and BHK-21.