In der Kinderherzchirurgie ist die Operation am kardiopulmonalen Bypass unter kardioplegen Herzstillstand ein Standardverfahren zur Korrektur angeborener Herzfehler. Dabei sorgt die Herz-Lungenmaschine (HLM) für die maschinelle Aufrechterhaltung von Blutfluss und Gasaustausch während des operativen Eingriffes. Dank stetiger Verbesserung von Technologie, Materialien sowie Anästhesieführung hat sich dieses Verfahren seit seiner ersten erfolgreichen Erprobung vor etwa 70 Jahren von einem hochriskanten Eingriff zu einem Standardverfahren in der Herzchirurgie mit jährlich sinkenden Morbiditäts- und Mortalitätsraten entwickelt. Dennoch bleibt der Eingriff ein Risikofaktor. Durch den veränderten Blutfluss an der HLM kann es zur Minderperfusion des Organismus mit hypoxisch-ischämischen und inflammatorischen Zellschäden kommen. Das Herz erfährt aufgrund der Kardioplegie eine zusätzliche Beeinträchtigung in seiner Funktion. Klinisch können sich die zellulären Schäden je nach Schweregrad in Form von Arrhythmien, kardialen Dysfunktionen bis hin zum Herzstillstand äußern. In dieser experimentellen Studie im Ferkelmodell wurden zwei potenziell kardioprotektive Strategien untersucht, durch die jene Schäden möglicherweise verringert werden könnten. Dabei handelt es sich zum einen um eine pulsatile Flussmodulation an der Herz-Lungenmaschine statt des herkömmlichen laminaren Flusses, wodurch eine bessere Oxygenierung der Organe erreicht werden könnte. Weiterhin soll eine pharmakologisch-therapeutische Möglichkeit zur Verringerung der oxidativen Zellschäden untersucht werden. Hierfür wurde Epigallocatechingallat gewählt. Dieses Polyphenol ist im grünen Tee enthalten und gilt als effektiver Radikalfänger sowie antiapoptotischer Wirkstoff. Ziel ist es festzustellen, in welchem Maße hypoxisch-ischämische und apoptotische Zellschäden nach Anwendung der HLM auftreten und inwiefern diese durch pulsatile Perfusion oder EGCG-Gabe beeinflussbar sind. Zu diesem Zweck wurden 5 Versuchsgruppen mit jeweils 6- 9 Ferkeln der Rasse Angler-Sattelschwein im Alter von ca. 4 Wochen und einem Gewicht zwischen 8-15 kg gebildet: „Kontrollgruppe“, „Kontrollgruppe + EGCG“, Versuchsgruppe „HLM laminar', Versuchsgruppe „HLM laminar + EGCG“ und Versuchsgruppe „HLM pulsatil“. Der operative Versuchsteil wurde nach einem einheitlichen OP-Protokoll unter moderater Hypothermie (28°C) mit 90-minütigem kardiopulmonalem Bypass, 30 min Reperfusionszeit und 90-minütiger Rekonvaleszenzzeit durchgeführt. Es kam die HLM vom Typ Stöckert SIII zum Einsatz, die sowohl pulsatilen als auch laminaren Blutfluss generieren kann. Den EGCG-Gruppen wurde zu zwei Zeitpunkten 10 mg/kg EGCG i.v. verabreicht. Die postoperativen Untersuchungen bestanden aus immunhistochemischen Färbungen des Herzgewebes auf hypoxisch-ischämische und apoptotische Marker (HIF-1α, AIF, Nitrotyrosin, cleaved Caspase 3, PAR, TNFα). Weiterhin wurde mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) der Gehalt an energiereichen Phosphaten und deren Abbauprodukten (ATP, AMP, ADP) gemessen. Das intraoperative Kreislaufmonitoring wurde dokumentiert. Zur Verlaufsbestimmung von Parametern des Blutbildes und der klinischen Blutchemie wurde zu drei Zeitpunkten während der Operation Blut entnommen. Die Ergebnisse zeigen, dass alle immunhistochemischen Marker in der Gruppe „HLM laminar“ am höchsten waren und belegen das Vorkommen hypoxischer, inflammatorischer und apoptotischer Stoffwechselprozesse unter Nutzung der laminaren HLM. Bei pulsatiler Perfusion wurde signifikant weniger TNFα, Caspase 3, PAR sowie Nitrotyrosin nachgewiesen und die zellulären Energiereserven (ATP/ ADP + AMP) im Myokard waren höher. Vermutlich wurde durch das veränderte Flussmuster eine bessere Gewebsoxygenierung gewährleistet. Unter EGCG-Gabe war die Expression von HIF-1α, AIF, Nitrotyrosin, TNFα und PAR signifikant vermindert. Somit ist anzunehmen, dass EGCG toxische Metabolite (ROS/ RNS) neutralisierte und gleichzeitig apoptotische Zellschäden verringerte. Beide untersuchten Strategien zeigten kardioprotektive Wirkung, da sie in die pathophysiologischen Stoffwechselwege von Ischämie/Reperfusion und Apoptose eingriffen und in der Lage waren, zelluläre Schäden zu vermindern. Die Ergebnisse sind für die Kardioprotektion in der Kinderkardiologie von Bedeutung, da sie effektive therapeutische Möglichkeiten darstellen könnten, die ischämischen Zellschäden zu verringern und somit die klinischen Folgen für das Herz zu reduzieren.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 ANWENDUNG DER HERZ-LUNGENMASCHINE 2.1.1 Entwicklung der Herz-Lungenmaschine- ein historischer Überblick 2.1.2 Aufbau der Herz-Lungenmaschine und Indikation für deren Einsatz 2.1.3 Besonderheiten der pädiatrischen Kardiochirurgie 2.1.4 Bedeutung der Herz-Lungenmaschine in der Veterinärmedizin 2.2 PATHOPHYSIOLOGIE DER HERZ-LUNGENMASCHINE 2.2.1 Häufige postoperative Komplikationen 2.2.2 Entzündungsreaktion 2.2.2.1 SIRS 2.2.2.2 Körpereigene Abwehrmechanismen 2.2.2.3 Störung der Hämostase 2.2.3 Ischämie-Reperfusionsschaden 2.2.4 Zelltod 2.3 KARDIOPROTEKTIVE STRATEGIEN 2.3.1 Perioperative Maßnahmen 2.3.2 Pulsatile Perfusion 2.3.3 Pharmakologische Kardioprotektion mit Epigallogatechingallat (EGCG) 2.4 HYPOXIE-, ENTZÜNDUNGS- UND APOPTOSEMARKER ZUR ANALYSE 2.4.1 Entzündungsmarker 2.4.2 Marker für Hypoxie und oxidativen Stress 2.4.3 Apoptosemarker 2.5 FRAGESTELLUNG 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 VERSUCHSDURCHFÜHRUNG 3.1.1 Versuchstiere und Versuchsgruppen 3.1.2 Anästhesie und OP-Durchführung 3.1.2.1 Prämedikation und Narkoseeinleitung 3.1.2.2 Narkose 3.1.2.3 Monitoring 3.1.2.4 Versuchsablauf 3.1.3 Extrakorporale Zirkulation und Kardioplegie 3.1.3.1 Aufbau der HLM 3.1.3.2 Operativer Zugang und Kanülierung des Herzens 3.1.3.3 Vorbereitung der HLM 3.1.3.4 Herbeiführung der Kardioplegie 3.1.3.5 Durchführung der extrakorporalen Zirkulation 3.2 POSTOPERATIVE UNTERSUCHUNGEN 3.2.1 Probenentnahme und –aufbereitung 3.2.2 Histologische Färbung 3.2.3 Immunhistochemische Färbungen 3.2.3.1 Entparaffinierung und Rehydrierung 3.2.3.2 Permeabilisierung 3.2.3.3 Blocken der endogenen Bindungsstellen 3.2.3.4 Antikörper- Inkubation 3.2.3.5 Kernfärbung 3.2.3.6 Negativkontrollen 3.2.4 Mikroskopie 3.2.5 Auswertung 3.2.6 Blutwerte 3.2.7 RP-HPLC 3.3 STATISTISCHE AUSWERTUNG 4 ERGEBNISSE 4.1 ERGEBNISSE DER BLUTPROBEN UND NARKOSE- ÜBERWACHUNG 4.2 ERGEBNISSE DER IMMUNHISTOCHEMIE 4.2.1 HIF-1α-Färbung 4.2.2 AIF-Färbung 4.2.3 Nitrotyrosin-Färbung 4.2.4 TNFα-Färbung 4.2.5 PAR-Färbung 4.2.6 cC3-Färbung 4.3 ERGEBNISSE DER RP-HPLC 5 DISKUSSION 5.1 MODELLBETRACHTUNG 5.2 EINFLUSS DER HLM AUF DAS HERZGEWEBE 5.3 LAMINARE VS. PULSATILE PERFUSION DER HLM 5.4 EINFLUSS VON EGCG 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATURVERZEICHNIS 9 ANHANG 9.1 ANGABEN ZU MEDIKAMENTEN UND OP-MATERIAL 9.2 GERÄTE UND ZUBEHÖR FÜR DIE POSTOPERATIVEN UNTERSUCHUNGEN 9.3 HERSTELLUNGSPROTOKOLLE UND ZUSAMMENSETZUNG DER LÖSUNGEN FÜR DIE HISTOLOGIE UND IMMUNHISTOCHEMIE 9.3.1 Formalinfixierung nach LILLIE 9.3.2 Vollautomatische Paraffineinbettung 9.4 ZUBEHÖR FÜR DIE RP-HPLC 9.5 HPLC- PROTOKOLL FÜR DIE VORBEREITUNG DER HPLC-QUANTIFIZIERUNG METABOLISCHER KOMPONENTEN IM HERZGEWEBE 9.6 AUSWERTUNG 9.7 ANTIKÖRPER UND FÄRBEPROTOKOLLE DER IMMUNHISTOCHEMIE 9.7.1 Färbeprotokoll HIF-1α 9.7.2 Färbeprotokoll AIF 9.7.3 Färbeprotokoll Nitrotyrosin 9.7.4 Färbeprotokoll TNFα 9.7.5 Färbeprotokoll PAR 9.7.6 Färbeprotokoll cC3 9.7.7 Färbeprotokoll HE 9.8 TABELLEN UND ABBILDUNGEN 10 DANKSAGUNG

Im Rahmen dieser Dissertation wurden anhand eines Ferkelmodells (8-15kg Schweine, 5 Gruppen: „nicht pulsatile HLM“: n=9, „Minozyklin+HLM“: n= 6, „pulsatile HLM“: n=7, „Minozyklin-Kontrolle: n=6, „Kontrolle“: n=8) während einer 120-minütigen extrakorporaler Zirkulation (EKZ) und einer darauffolgenden 90-minütigen Rekonvaleszenzzeit der physikalische Einflussfaktor des pulsatilen Flusses sowie der pharmakologische Effekt von Minozyklin auf die Niere jeweils unabhängig voneinander untersucht. In allen Gruppen wurden HE-Färbungen sowie immunhistochemische Färbungen (HIF-1-α, 3-Nitrotyrosin, PAR, AIF) durchgeführt um pathologische Veränderungen auf zellulärer Ebene zu detektieren. Zusätzlich wurden energiereiche Phosphate und ihre Abbauprodukte mittels High Pressure/Performance Liquid Chromatography (HPLC) bestimmt. Zur Beurteilung der klinischen Funktion der Niere wurden nierenspezifische Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) und Laktat im arteriellen Blut bestimmt. Mit der pulsatilen Perfusion konnte ein Abfall des O2-Partialdruckes nicht verhindert werden (HIF-1-α), allerdings konnte die ATP-Konzentration aufrecht erhalten werden. Dies spricht dafür, dass die pulsatile Perfusion im Gegensatz zu der nicht pulsatilen Perfusion keinen relevanten O2-Mangel verursachte. Auch die Ergebnisse der Nitrotyrosin-3-Auswertung zeigen, dass die Bildung von Peroxynitrit reduziert und somit der nitrosative Stress auf die Zellen begrenzt wurde. Die DNA wurde jedoch unabhängig vom gewählten Blutflussprofil geschädigt (PAR). Auch anhand der nierenspezifischen Blutparameter (Serumkreatinin, Serumharnstoff) ließ sich eine postoperative Beeinträchtigung der Nierenfunktion feststellen. Im Vergleich zu der nicht pulsatilen EKZ war hier jedoch eine geringfügige Verbesserung zu erkennen (Serumkreatinin). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die pulsatile EKZ der Grad der Ischämie beeinflusst werden konnte, allerdings waren insgesamt keine wesentlich positiven Auswirkungen auf zellulärer Ebene und auf die postoperative Nierenfunktion festzustellen. Der Einsatz des technisch anspruchsvollen pulsatilen Perfusionssystems scheint daher in Bezug auf die Niere in der routinemäßigen Herzchirurgie nicht unbedingt erforderlich zu sein. Durch die Gabe von Minozyklin wurde zwar der Grad der Ischämie (HIF-1-α, ATP) nicht beeinflusst, allerdings konnte Minozyklin durch seine antioxidativen bzw. antinitrosativen (3-Nitrotyrosin), PARP-1-hemmenden (PAR) sowie antiapoptotischen (AIF) Wirkmechanismen die Niere offenbar vor den Folgen einer Ischämie schützen. Anhand der nierenspezifischen Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) wurde erkenntlich, dass Minozyklin die Nierenfunktion positiv beeinflusst, was wiederum die histologischen Befunde bestätigt. Für die Humanmedizin ist somit der Einsatz von Minozyklin während der EKZ eine Möglichkeit die Auswirkungen des Ischämie/Reperfusionsschadens und deren klinische Folgen hinsichtlich der Niere zu begrenzen. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der einmalige Einsatz eines Antibiotikums auch negativen Einfluss auf den Körper ausübt (Resistenzentwicklung, Nebenwirkungen), sodass Minozyklin aufgrund der in dieser Versuchsreihe gezeigten positiven Eigenschaften, insbesondere die PARP-1-Inhibition, lediglich als Modellsubstanz für Weiterentwicklungen genutzt werden kann.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden anhand eines Ferkelmodells (8-15kg Schweine, 5 Gruppen: „nicht pulsatile HLM“: n=9, „Minozyklin+HLM“: n= 6, „pulsatile HLM“: n=7, „Minozyklin-Kontrolle: n=6, „Kontrolle“: n=8) während einer 120-minütigen extrakorporaler Zirkulation (EKZ) und einer darauffolgenden 90-minütigen Rekonvaleszenzzeit der physikalische Einflussfaktor des pulsatilen Flusses sowie der pharmakologische Effekt von Minozyklin auf die Niere jeweils unabhängig voneinander untersucht. In allen Gruppen wurden HE-Färbungen sowie immunhistochemische Färbungen (HIF-1-α, 3-Nitrotyrosin, PAR, AIF) durchgeführt um pathologische Veränderungen auf zellulärer Ebene zu detektieren. Zusätzlich wurden energiereiche Phosphate und ihre Abbauprodukte mittels High Pressure/Performance Liquid Chromatography (HPLC) bestimmt. Zur Beurteilung der klinischen Funktion der Niere wurden nierenspezifische Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) und Laktat im arteriellen Blut bestimmt. Mit der pulsatilen Perfusion konnte ein Abfall des O2-Partialdruckes nicht verhindert werden (HIF-1-α), allerdings konnte die ATP-Konzentration aufrecht erhalten werden. Dies spricht dafür, dass die pulsatile Perfusion im Gegensatz zu der nicht pulsatilen Perfusion keinen relevanten O2-Mangel verursachte. Auch die Ergebnisse der Nitrotyrosin-3-Auswertung zeigen, dass die Bildung von Peroxynitrit reduziert und somit der nitrosative Stress auf die Zellen begrenzt wurde. Die DNA wurde jedoch unabhängig vom gewählten Blutflussprofil geschädigt (PAR). Auch anhand der nierenspezifischen Blutparameter (Serumkreatinin, Serumharnstoff) ließ sich eine postoperative Beeinträchtigung der Nierenfunktion feststellen. Im Vergleich zu der nicht pulsatilen EKZ war hier jedoch eine geringfügige Verbesserung zu erkennen (Serumkreatinin). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die pulsatile EKZ der Grad der Ischämie beeinflusst werden konnte, allerdings waren insgesamt keine wesentlich positiven Auswirkungen auf zellulärer Ebene und auf die postoperative Nierenfunktion festzustellen. Der Einsatz des technisch anspruchsvollen pulsatilen Perfusionssystems scheint daher in Bezug auf die Niere in der routinemäßigen Herzchirurgie nicht unbedingt erforderlich zu sein. Durch die Gabe von Minozyklin wurde zwar der Grad der Ischämie (HIF-1-α, ATP) nicht beeinflusst, allerdings konnte Minozyklin durch seine antioxidativen bzw. antinitrosativen (3-Nitrotyrosin), PARP-1-hemmenden (PAR) sowie antiapoptotischen (AIF) Wirkmechanismen die Niere offenbar vor den Folgen einer Ischämie schützen. Anhand der nierenspezifischen Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) wurde erkenntlich, dass Minozyklin die Nierenfunktion positiv beeinflusst, was wiederum die histologischen Befunde bestätigt. Für die Humanmedizin ist somit der Einsatz von Minozyklin während der EKZ eine Möglichkeit die Auswirkungen des Ischämie/Reperfusionsschadens und deren klinische Folgen hinsichtlich der Niere zu begrenzen. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der einmalige Einsatz eines Antibiotikums auch negativen Einfluss auf den Körper ausübt (Resistenzentwicklung, Nebenwirkungen), sodass Minozyklin aufgrund der in dieser Versuchsreihe gezeigten positiven Eigenschaften, insbesondere die PARP-1-Inhibition, lediglich als Modellsubstanz für Weiterentwicklungen genutzt werden kann.