Orientador: Gilberto de Nucci / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T18:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_HeloisaHelenadeAraujo_D.pdf: 10532617 bytes, checksum: 075e0d33d8ac8d0a9357892f11c91122 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: O efeito do tratamento crônico com N?-Nitro-L-arginina metil éster (LNAME) foi investigado em ratos, usando-se o modelo de pleurisia e inflamação alérgica em animais sensibilizados com ovalbumina (OVA). A migração de eosinófilos in vitro induzida por fMLP, PAF e soro ativado com zimosan foi também avaliada nestes animais. A inibição crônica da biossíntese de óxido nítrico (NO) foi realizada pela adição de L-NAME na água que os animais ingeriam ad libitum, na concentração aproximada de 75 µmol/rato/dia, por um período de 30 dias. A pleurisia foi induzida pela injeção de bradicinina (50 µg), PAF (1 µg), lipopolissacáride (0.25 µg) e carragenina (125 µg) na cavidade pleural. A sensibilização ativa com OVA foi efetuada pela injeção subcutânea de 200 µg de OVA adsorvida em 8 mg de AI(OH)3. O desafio com 1 mg de OVA, injetado na luz intratraqueal, foi realizado 14 dias após a sensibilização. Para as análises histológicas, os pulmões foram cortados em fragmentos, fixados em mistura contendo paraformaldeído (4%) e glutaraldeído (0.5%) em tampão fosfato (0.1 M) e incluídos em parafina. Para os estudos da quimiotaxia in vitro, os eosinófilos foram coletados da cavidade peritoneal de ratos Wistar e isolados em gradiente descontínuo de metrizamide. No modelo de pleurisia houve migração significativa de eosinófilos para a cavidade pleural, observada 24 h após a injeção de bradicinina, PAF, lipopolissacáride e carragenina, em ratos não tratados. Esta migração foi marcadamente reduzida nos animais tratados com L-NAME. Nos animais tratados e não tratados, sensibilizados e desafiados com OVA, observou-se, 24 h após desafio, significativa infiltração de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA), principalmente de neutrófilos e células mononucleares. Neste modelo, a migração de eosinófilos ocorreu, de modo mais intenso, 48 h após o desafio. Em 48 h, o tratamento com L-NAME reduziu significativamente o influxo de leucócitos totais e eosinófilos, sem contudo alterar a infiltração de neutrófilos. Em ratos não tratados, 48 h após o desafio, a histologia dos pulmões revelou uma infiltração rica em eosinófilos, e nos animais tratados com L-NAME, redução dessa infiltração. Com relação à quimiotaxia in vitro, os eosinófilos obtidos da cavidade peritoneal de ratos não tratados mostraram uma migração significativa em resposta ao fMLP (5x10-8 M), PAF (10-8 M) e soro ativado com zimosan (27 µI). A migração foi marcadamente reduzida quando os eosinófilos foram isoladas de animais tratados cronicamente com L-NAME. A L-arginina (5.5 mM), precursor da síntese de NO, mas não a D-arginina (5.5 mM), enantiômero inativo, restaurou a capacidade dos eosinófilos de ratos tratados em responder ao fator quimiotáxico fMLP. Nossos resultados mostram que o tratamento crônico com L-NAME inibe a migração de eosinófilos in vivo, sendo esta inibição também demonstrada ex vivo. Isto sugere que, provavelmente, o L-NAME exerce seu efeito diretamente sobre os eosinófilos, dificultando, assim, sua locomoção / Abstract: The effect of chronic N?-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) treatment on the in vivo eosinophil migration was investigated in the rat using both the pleurisy model and the bronchoalveolar lavage (BAL) in ovalbumin (OVA) sensitized animais. The in vitro (microchemotaxis chamber) eosinophil migration induced by fMLP, PAF and zymosan-activated serum (ZAS) was also evaluated in the rat. Chronic inhibition of NO biosynthesis was achieved by adding L-NAME to the drinking water to give an intake of approximately 75 µmol/rat/day for four weeks. The pleurisy was induced by intrapleural injection of BK (50 µg), PAF (1 µg), LPS (0.25 µg) and carrageenin (125 µg). Active sensibilization against OVA was performed by s.c. injection of 200 µg OVA and 8 mg AI(OH)3.14 days thereafter OVA (1 mg) was injected into the airways. For histopathological analysis, the lungs were cut into small fragments, fixed in 4% buffered paraformaldehyde-glutaraldehyde solution and embedded in paraffin wax. For the in vitro chemotaxis studies, eosinophils were collected from the peritoneal cavity of male Wistar rats and isolated on a discontinuous metrizamide gradient. The intrapleural injection of BK, PAF, LPS and carrageenin into untreated rats in vivo induced a significant eosinophil migration by 24 h postinjection. This migration was markedly reduced in L-NAME-treated rats. The BAL 24 h post-challenge with OVA showed a significant leucocyte infiltration composed mainly of neutrophils and mononuclear cells. The eosinophils migrated mainly at 48 h after challenge. At 48h, L-NAME treatment significantly reduce both total leucocyte and eosinophil infiltration. The neutrophil influx was not affected by L-NAME. Similarly, at 48 post-challenge, the lungs presented an infiltration rich in eosinophils as revealed by histopathological analysis. Again, the eosinophil infiltration was attenuated in the lungs from L-NAME-treated animals. Regarding the in vitro chemotaxis, eosinophil obtained from untreáted rats showed a significant migration in response to fMLP (5x10-8 M), PAF (10-8 M) and zymosan-activated serum (27 µl). In contrast, the migration induced by these chemotactic agents was markedly reduced in cells isolated from animals treated chronically with L-NAME. L-arginine (5.5 mM), but not D-arginine (5.5 mM), restored the ability of eosinophils from L-NAME-treated animals to migrate in response to fMLP. The finding that the inhibition of eosinophil chemotaxis persisted in vitro suggests that the phenomena observed is due to a direct effect of L-NAME on the eosinophil itself, probably, on cell movement / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Ciências

Orientador: Jose Geraldo P. Ferraz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T17:03:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coppi_LucianeCristina_D.pdf: 5991264 bytes, checksum: bbcad7dd36b02092b27ac1c30b751988 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os eosinófilos estão envolvidos na patogênese de várias doenças inflamatórias crônicas? incluindo doenças inflamatórias intestinais (Dll)? como doença de Crohn (DC) e retocolite ulcerativa inespecífica (RCVI). No entanto? ainda é desconhecido como os eosinófilos contribuem para a patogênese das Dll. Portanto? o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade dos eosinófilos isolados de sangue periférico de pacientes com Dll comparada aos voluntários sadios. Eosinófilos dos voluntários sadios (n=5)? com DC (n=5) e RCVI (n=5) foram purificados usando-se um gradiente de Percoll? seguido de separação imunomagnética. A atividade dos eosinófilos foi avaliada usando-se os ensaios de quimiotaxi~ adesão? liberação de peroxidase do eosinófilo (EPO)? citometria de fluxo? contagem histológica e análise morfométrica. A quimiotaxia dos eosinófilos induzida pelo N-formyl-metionyl-Ieucyl-fenilanina(fMLP) foi significativamente maior para as células isoladas de pacientes com DC e RCVI? quando comparada aos voluntários sadios.A adesão basal dos eosinófilos de pacientes com DC aumentou significativamente para fibronectina ou soro? quando comparada aos voluntários sadios e RCVI. A liberação basal e estimulada de EPO foi reduzida em células de pacientes com DC? quando comparada aos voluntários sadios. Entretanto? em células isoladas de pacientes com RCVI? a liberação de EPO basal foi significativamente maior quando comparada aos voluntários sadios. A expressão das moléculas de adesão macrophage-l antigen (Mac-l) e very late antigen 4 (VLA-4) não apresentou diferença em relação aos voluntários sadios. A contagem histológica dos eosinófilos em tecido intestinal e morfométrica dos grânulos destas células mostrar~ respectivamente? aumento significativo do número de eosinófilos e de seus grânulos em pacientes com DC e RCVI quando comparadas aos voluntários sadios. Nossos resultados sugerem que os eosinófilos periféricos estão pré-ativados em pacientes com Dll. A ativação dos eosinófilos periféricos? seguida da migração para o tecido intestinal deve contribuir para a patogênese das Dll / Abstract: Eosinophils are involved in the pathogenesis of several chronic inflammatory diseases, including inflammatory bowel disease (ffiD), as Crohn's disease (CD) and ulcerative colites (DC). However, how activation of intravascular eosinophils contributes to disease activity or ffiD pathogenesis is still unknown. The aim of this study was to investigate if eosinophils isolated ITomperipheral blood ITomffiD patients are activated compared to healthy volunteers. Eosinophils ITomhea1thyvolunteers (n=5), CD (n=5) and DC patients (n=5) were purified using a Percoll gradient followed by immunomagnetic cell separator. Eosinophil activity was investigated using chemotaxis, adhesion and mediator release assays (eosinophil peroxidase, EPO), flow cytometric, histologic counting and morphometric analysis. -formyl-metionyl-Ieucyl-fenilanina (fMLP) induced eosinophil chemotaxis was significandy augmented in cells isolated from CD and DC patients compared to hea1thyvolunteers. Eosinophil basal adhesion of CD significantlyincreased to fibronectin or serum if compared to DC or hea1thyvolunteers. Basal and stimulated EPO release was reduced in cells ITomCD patients compared to hea1thyvolunteers. However, basal EPO release was significantly enhanced in cells isolated from DC patients when compared to hea1thy volunteers. The expression of adhesion molecules macrophage-l antigen (Mac-l) and very late antigen 4 (VLA-4) isn't different in patients with DC and CD compared to hea1thyvolunteers. Histologic counting of eosinophils in intestinal tissue and morphometric analysis of granules of this cells showed, respectively, significant augmentation in the number of eosinophils and its granules in CD and DC patients compared to hea1thy volunteers. Our results suggest that peripheral eosinophils are preactivated in ffiD patients. Activation of peripheral eosinophils followed by migration to intestinal tissue probably contributes to ffiD pathogenesis / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica