Connue pour son rôle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protéase à sérine, peut également agir par l’intermédiaire de PAR1, un récepteur activé par protéase et couplé aux protéines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive l’extrémité N-terminale du PAR1 entre l’Arg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrémité terminale qui agit elle-même comme un ligand. La thrombine et une séquence peptidique de cinq acides aminés, composée des résidus Ser42 à Arg46, nommée PAR1-AP, déclenchent dans diverses cellules de mammifères une réponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette étude, le système d’expression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le récepteur PAR1 du rat à la surface de ces cellules et de réaliser son couplage fonctionnel à leur signalisation intracellulaire (modèle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en réponse au PAR1-AP, a ensuite été étudiée en détail à l’aide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres éléments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP déclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi d’un plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. À l’aide d’inhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifédipine et le D-600, l'entrée du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibée, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. L’inhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la réponse au PAR1-AP après épuisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de façon discordante quant à l’inhibition de la libération de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La réponse à PAR1-AP n’est pas affectée par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase β. L’inhibition de la protéine kinase C (PKC) par le bisindolylmaléimide induit des oscillations en présence de Ca2+ extracellulaire et atténue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En présence de Ca2+ extracellulaire, l’activation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la réponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protéine kinase A (PKA), cause une prolongation de la durée du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la réponse à PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dépourvu de Ca2+. Les résultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rôle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modèle rPAR1-Sf9. / Thrombin’s serine protease activity allows for it to have a role in both the coagulation cascade as well as through a GTP- binding protein coupled receptor (GPCR) known as the protease-activated receptor-1 (PAR1). Thrombin binds to PAR1 at the N-terminal, cleaving between Arg41 and Ser42, and unmasking a new N-terminal which acts as a tethered ligand. Thrombin and a five amino acid peptide composed of the sequence of residues Ser42 to Arg46, known as PAR 1-AP, has been shown to mediate a number of signalling mechanisms in mammalian cells, including a calcium signalling pathway. In the present study, the Sf9-baculovirus system allowed us to express the rat PAR1 (rPAR1-Sf9) on the cell surface and study its intracellular signalling. The calcium (Ca2+) signal was studied using the fluorescent probe Fura-2, and several Ca2+ channel inhibitors and calcium signal modulators were used to study the signal induced by PAR1-AP. In the presence of extracellular calcium [Ca2+]e, thrombin and PAR1-AP produced a Ca2+ signal which consisted of an initial spike in [Ca2+]i followed by a relatively maintained plateau and a slow return towards baseline. In the absence of Ca2+ in the extracellular space, the initial Ca2+ increase is followed by a quick return to baseline [Ca2+]i. Ca2+ channel inhibitors, lanthanum, nifedipine and D-600, inhibited the entry of Ca2+ from the extracellular space and abolished the plateau phase of the response to PAR1-AP. Inhibition of the Ca2+-ATPase with thapsigargin abolished the response to PAR1-AP after having depleted the Ca2+ stores involved in the initial spike in [Ca2+]i. TMB-8, expected to inhibit the release of Ca2+ from internal stores, inconsistently inhibited the [Ca2+]i response to PAR1-AP. The response elicited by PAR1-AP was not affected by D-609, an inhibitor of phospholipase Cβ. Inhibition of protein kinase C (PKC) with bisindolylmaleimide induced oscillations in the [Ca2+]i levels in the presence of extracellular Ca2+ while it significantly blunted the response in the absence of extracellular Ca2+. PDBu activation of PKC truncated the [Ca2+]i surge in Ca2+-rich conditions while abolishing it altogether in the absence of extracellular Ca2+. H-89 inhibition of protein kinase A (PKA) prolonged the plateau duration in Ca2+-rich medium while inhibiting the response to PAR1-AP in a Ca2+-deficient environment. Taken together, our results suggest that PKC and possibly PKA play a critical role in the mobilisation of Ca2+ in rPAR1-Sf9 by PAR1-AP.

Les rétinopathies ischémiques (RI) sont la cause majeure de cécité chez les personnes âgées de moins de 65 ans. Il existe deux types de RIs soit la rétinopathie du prématuré (ROP) ainsi que la rétinopathie diabétique (RD). Les RIs sont décrites en deux phases soit la phase de vasooblitération, marquée par une perte importante de vaisseaux sanguins, et une phase de néovascularisation secondaire à lʼischémie menant à une croissance pathologique de vaisseaux. Cette seconde phase peut générer des complications cliniques telles quʼun oedème dans lʼhumeur vitré ainsi que le détachement de la rétine chez les patients déjà atteints dʼune RI. Les traitements approuvés pour les RIs visent à réduire la formation des vaisseaux pathologiques ou lʼoedème; mais ceux-ci malheureusement ne règlent pas les problèmes sous-jacents tels que la perte vasculaire et lʼischémie. La rétine est un tissu hautement vascularisé qui contribue à lʼirrigation et à lʼhoméostasie des neurones. Lʼinteraction neurovasculaire, comprenant de neurones, vaisseaux et cellules gliales, contribue au maintien de cette homéostasie. Durant le développement, les neurones et les cellules gliales jouent un rôle important dans la vascularisation de la rétine en sécrétant des facteurs qui stimulent l'angiogenèse. Cependant, nos connaissances sur lʼinteraction neurovasculaire dans les RIs sont limitées. En identifiant les interactions importantes entre les cellules composant cette unité neurovasculaire dans la rétine, nous pourrons viser des cibles qui engendreront une revascularisation seine afin de diminuer les signes pathologiques chez les patients atteints dʼune RI. Les travaux présentés dans cette thèse visent à mieux expliquer cette interaction neurovasculaire en soulignant des concepts importants propres aux RIs. En utilisant un modèle de rétinopathie induite par lʼoxygène chez la souris, qui reproduit les caractéristiques importantes de la ROP (et en certaines instances, la RD), nous identifions quelques molécules clés jouant un rôle significatif dans les RIs soit la sémaphorine 3A (sema3A), lʼIL-1β, ainsi que le récepteur PAR2. Nos résultats démontrent que Sema3A, sécrétée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) durant une ischémie, empêche la revascularisation normale et que cette expression est induite par lʼIL-1β provenant des microglies activées. En bloquant Sema3A directement ou via lʼinhibition de lʼIL- 1β, nous remarquons une revascularisation seine ainsi quʼune diminution importante des vaisseaux pathologiques. Cela nous indique que Sema3A est impliquée dans la guidance vasculaire et quʼelle contribue à la pathogenèse des RIs. Lʼactivation de façon exogène de PAR2, identifié aussi comme régulateur du récepteur de lʼIL-1β (IL- 1RI) sur les CGRs, se traduit par une diminution séquentielle de lʼIL-1RI et de Sema3A ce qui mène également à une revascularisation seine. En conclusion, ces travaux soulignent lʼimportance de lʼinteraction neurovasculaire ainsi que la guidance vasculaire dans les RIs. Ils renforcent lʼimportance de la communication entre neurone, vaisseau et microglie dans la pathogenèse des RIs. Finalement, nous identifions quelques molécules clés qui pourront servir comme cibles afin de lutter contre lʼischémie qui cause des problèmes vasculaires chez les patients atteints dʼune RI. / Ischemic retinopathies (IRs), namely, retinopathy of prematurity (ROP) and diabetic retinopathy (DR), are the major cause of blindness in persons under the age of 65. IRs are biphasic disorders described by an initial vasoobliterative phase marked by a persistent microvascular degeneration, which leads to ischemia. Retinal ischemia, secondary to vessel loss, incites a second neovascularization phase represented by an aberrant, misdirected neovessel formation into the vitreous, which can cause adverse clinical complications including vitreous hemorrhaging and tractional retinal detachment. While current treatments aim at reducing vitreous/retinal hemorrhaging and/or pathological pre-retinal neovascularization, these regimens fail to address the underlying problem; that is, microvascular decay and retinal ischemia. The retina is a highly metabolic tissue that requires a significant amount of nutrients and oxygen. This is supplied by an intricate and highly regulated vascular network required to maintain homeostasis and proper function. The intricate cellular interactions in the neurovascular unit – the consortium of vessel, neurons and support glia – are required for regulating and maintaining homeostasis under normal conditions. However, the understanding of how this unit functions under ischemic stress, that which is seen in patients suffering from IRs, is not well defined. The present work underlines several important concepts of neurovascular coupling in IRs in efforts to identify potential therapeutic agents that may help curb retinal ischemia by stimulating normal revascularization. Using a mouse model of oxygen-induced retinopathy (OIR), which reproduces the salient features of ROP (and in some instances DR), we identified key players involved in generating the pathophysiological signatures associated with IRs; namely, semaphorin3A (Sema3A), interleukin-1β (IL-1β) and protease-activated receptor 2 (PAR2). Our results show that neuronal-derived Sema3A, secreted by ischemic retinal ganglion cells (RGCs), acts as a potent vaso-repulsive molecules that impedes normal revascularization. Activated microglia contribute to this process by secreting IL-1β, which induces paracrine release of Sema3A expression contributing to microvascular decay as well as pathological pre-retinal neovascularization. Inhibition of Sema3A or IL-1β translates to rapid revascularization and, as a result, a significant reduction in pathological neovessel formation. These results demonstrate that Sema3A is directly involved in vascular guidance and precipitates the pathophysiological features associated with IRs. PAR2, found on RGCs, was also identified as a key regulatory mechanism involved in dampening IL-1β induced Sema3A mediated vascular decay by reducing IL-1 receptor (IL-1RI). Exogenous activation of neuronal PAR2 translates to a sequential reduction of both IL-1RI and Sema3A resulting in accelerated revascularization and consequentially pre-retinal neovascularization. In conclusion, these studies highlight the importance of neurovascular coupling associated with IRs. Herein, we demonstrate the consorted interaction between neuron, vessel and glia and its impact on shaping the retinal vasculature during disease. Moreover, we underscore the significant impact of neuronal guidance cues in manifesting the salient vascular features of IRs. Finally, we identify key players that may serve as potential therapeutic avenues in curbing retinal ischemia in efforts to reduce vascular complications associated with IRs.