L'angiogénèse consiste en la formation de vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Une des limites du génie tissulaire est la néovascularisation de l'implant assurant la survie des cellules incorporées dans le biomatériau. C'est pourquoi nous nous sommes intéressés, dans un premier temps, à la création d'un système vasculaire dans des masses de taille de plus en plus volumineuse composées de fibrine et de collagène cultivées dans un bioréacteur. Les cellules endothéliales incorporées dans la masse ont formé quelques micro-vaisseaux de manière aléatoire. Afin d'orienter ces vaisseaux, nous avons essayé d'une part, d'incorporer des fïbroblastes dans une masse centrale et d'autre part, de créer une hypoxie au centre. L'utilisation d'une telle matrice «composite» n'a pas permis de créer d'hypoxie dans le centre de la masse. Les fibroblastes situés au centre ont colonisé la périphérie de la masse inhibant ainsi les cellules endothéliales à former une angiogénèse. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux interactions cellules-cellules dans un environnement tridimensionnel au cours de l'angiogénèse. Les cellules étaient soit dispersées dans une matrice de fibrine, soit ensemencées à la surface de micro-billes (Cytodex) ou de macro-billes (billes de collagène). Concernant les cellules isolées, nous avons déterminé qu'il fallait une densité d'au moins de 4x104 cellules/ml pour induire une angiogénèse. En revanche, pour une densité cellulaire similaire, la surface angiogénique a augmenté de 5 et 3 fois respectivement, pour les micro- et macro-billes. Un réseau angiogénique a pu se former entre les micro-billes contrairement aux macro-billes. Au vue des résultats obtenus, les micro-billes sembleraient être une bonne alternative pour la néovascularisation d'implants et permettraient de réduire le nombre de cellules endothéliales lors de l'ensemencement. / L'angiogénèse consiste en la formation de vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Une des limites du génie tissulaire est la néovascularisation de l'implant assurant la survie des cellules incorporées dans le biomatériau. C'est pourquoi nous nous sommes intéressés, dans un premier temps, à la création d'un système vasculaire dans des masses de taille de plus en plus volumineuse composées de fibrine et de collagène cultivées dans un bioréacteur. Les cellules endothéliales incorporées dans la masse ont formé quelques micro-vaisseaux de manière aléatoire. Afin d'orienter ces vaisseaux, nous avons essayé d'une part, d'incorporer des fïbroblastes dans une masse centrale et d'autre part, de créer une hypoxie au centre. L'utilisation d'une telle matrice «composite» n'a pas permis de créer d'hypoxie dans le centre de la masse. Les fibroblastes situés au centre ont colonisé la périphérie de la masse inhibant ainsi les cellules endothéliales à former une angiogénèse. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux interactions cellules-cellules dans un environnement tridimensionnel au cours de l'angiogénèse. Les cellules étaient soit dispersées dans une matrice de fibrine, soit ensemencées à la surface de micro-billes (Cytodex) ou de macro-billes (billes de collagène). Concernant les cellules isolées, nous avons déterminé qu'il fallait une densité d'au moins de 4x104 cellules/ml pour induire une angiogénèse. En revanche, pour une densité cellulaire similaire, la surface angiogénique a augmenté de 5 et 3 fois respectivement, pour les micro- et macro-billes. Un réseau angiogénique a pu se former entre les micro-billes contrairement aux macro-billes. Au vue des résultats obtenus, les micro-billes sembleraient être une bonne alternative pour la néovascularisation d'implants et permettraient de réduire le nombre de cellules endothéliales lors de l'ensemencement.

La protéine membranaire « Growth Arrest-Specific 1 » (GAS1) est reconnue pour ses effets antitumoraux et anti-métastatiques de par sa capacité à induire l’arrêt du cycle cellulaire, généralement en phase Go, et l’apoptose. Cependant, le rôle de GAS1 a été peu étudié et est quelque peu controversé dans le contexte oncologique. De plus, des évidences poussent à croire que cette protéine jouerait un rôle dans le processus angiogénique. Pour étudier le rôle de GAS1 dans le cancer, des tests in cellulo classiques mesurant la prolifération, le cycle cellulaire ainsi que l’apoptose ont été réalisés sur des cellules cancéreuses surexprimant GAS1. Des immunobuvardages ont été utilisés afin de détecter la présence de GAS1 dans les différentes lignées cellulaires et leur milieu de culture. Des xénogreffes utilisant la membrane chorioallantoïque de l’œuf de poulet (essai CAM) ont été réalisées pour évaluer le potentiel tumorigénique et angiogénique des cellules. La surexpression de GAS1 dans les différentes lignées cellulaires cancéreuses n’a eu aucun effet sur leur prolifération, leur cycle cellulaire ainsi que leur état apoptotique, lorsque mesurés in vitro. Cependant, lorsque ces cellules furent testées à l’aide de l’essai CAM, le poids des tumeurs exprimant GAS1 ainsi que l’angiogenèse ont augmenté. Des essais CAM, utilisant entre autres des bouchons de collagène et la protéine GAS1 soluble purifiée, ont démontré que cette dernière stimule indirectement l’angiogenèse. En résumé, un nouveau rôle pro-angiogénique a été mis en évidence pour la protéine GAS1 soluble. L’angiogenèse tumorale est primordiale à la progression de plusieurs types de cancers incluant le cancer de la prostate. Cette dernière est d’ailleurs ciblée par des traitements anticancéreux. GAS1 soluble représente donc une cible thérapeutique potentielle pour traiter le cancer. / Growth Arrest-Specific 1 (GAS1) is a membrane protein recognized for its antitumor and anti-metastatic effects due to its capacity to induce cell cycle arrest, usually in the Go phase, and apoptosis. However, the role of GAS1 has not been the subject of much analysis and is somewhat controversial in cancer. Moreover, evidence leads us to infer that this protein could play a role in angiogenesis. To study the role of GAS1 in cancer, conventional in cellulo tests measuring proliferation, cell cycle and apoptosis were performed on cancer cells overexpressing GAS1. Immunoblotting was used to detect the presence of GAS1 in the different cell lines and their culture medium. Xenografts employing the chorioallantoic membrane of the chicken egg (CAM essay) were used to evaluate the tumorigenic and angiogenic potential of the cells. GAS1 overexpression in various cancer cell lines showed no effect on their proliferation, cell cycle and apoptotic state when measured in vitro. However, when these cells were tested with the CAM assay, weight of tumors expressing GAS1 as well as angiogenesis was increased. CAM assays, using among other things collagen plugs and purified soluble GAS1 protein, demonstrated that the latter indirectly stimulates angiogenesis. In summary, a new pro-angiogenic role has been demonstrated for soluble GAS1. Tumor angiogenesis is essential to the progression of several types of cancer including prostate cancer. Angiogenesis is therefore the focus of several anticancer treatments. Thus, soluble GAS1 represents a potential therapeutic target for treating cancer.

Le processus de cicatrisation est complexe et hautement régulé par de nombreux facteurs. La différenciation des fibroblastes (Fb) du derme en myofibroblastes (Wmyo) est très importante pour la guérison des plaies. Les Wmyo accélérent la fermeture des plaies par leur contraction, et jouent un rôle central dans la reconstitution de la MEC. Notre équipe a déjà montré que les Wmyo stimulent l’angiogénèse de façon plus importante que les Fb. De plus, les Wmyo produisent des microvésicules (MV) : des vésicules produites par bourgeonnement de la membrane plasmique des cellules qui jouent un rôle dans la communication intercellulaire. En analysant le protéome de ces MV, l’équipe a démontré que les MV contiennent des protéines impliquées dans l’angiogénèse. Mon hypothèse est que les MV produites par les Wmyo pouvaient influencer l’angiogenèse. Mes objectifs étaient d’évaluer le rôle des MV produites par les Wmyo sur l’angiogenèse en évaluant la réponse des cellules endothéliales (CE) selon les trois mécanismes fondamentaux de la formation des capillaires sanguins : la prolifération et la migration des CE, ainsi que la formation de structures tubulaires. Pour finir, les mécanismes d’interaction et d’action des MV sur les CE cibles ont été étudiés. Mes résultats ont prouvé que la présence de MV isolées à partir de Wmyo induit une augmentation significative et dose-dépendante de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales microvasculaires de peau (CEMV) tout en favorisant la formation de structures tubulaires sur Matrigel®. Finalement, l’internalisation des MV dans les CEMV par la voie de l’endocytose est probable, et l’action des MV sur la migration des CE semble être dépendante d’une traduction protéique. En conclusion, nous avons démontré que les MV produites par les Wmyo sont favorables au développement angiogénique, élargissant le rôle des Wmyo pendant la guérison de plaie. Nous avons également prouvé que les mécanismes d’action des MV sont liés à l’endocytose des MV et de la traduction protéique. / The healing process is complex and highly regulated by many factors. The differentiation of dermal fibroblasts (Fb) into myofibroblasts (Wmyo) is very important for wound healing. The Wmyo accelerates wound closure by their contraction. Also, these cells play a central role in the reconstruction of the extracellular matrix. Our team has already shown that Wmyo strongly stimulate angiogenesis, more than Fb and that Wmyo produce microvesicles (MVs). In literature, MVs produced by budding of the plasma membrane of the cells play a role in intercellular communication. By analyzing the proteome of these MVs, I have demonstrated that MVs contain proteins capable of stimulating angiogenesis. Our hypothesis was that MVs produced by Wmyo could influence angiogenesis. Our objectives were to evaluate the role of MV produced by Wmyo on angiogenesis by evaluating the response of endothelial cells (EC) according to the three fundamental mechanisms of blood capillary formation: proliferation and migration of endothelial cells, as well as the formation of tubular structures. Finally, we have studied their mechanism of interaction and action on the target EC. Our results showed that the presence of MVs isolated from Wmyo induces a significant and dose-dependent increase of the proliferation and migration of microvascular endothelial cells of the skin (MVEC) while promoting the formation of tubular structures on Matrigel ®. Also, the internalization of MVs is through endocytosis, and MVs action on EC migration seems to be dependent on protein translation. In conclusion, we have shown that MVs produced by Wmyo are favorable to an angiogenic development, widening the role of Wmyo during wound healing. We have also shown that the interaction of MVs with EC seems to include the pathway of endocytosis and their role seems to pass via protein translation.

Notre projet visait en premier à étudier la protéolyse sécrétée par l'endomètre eutopique provenant de femmes atteintes de la maladie et la comparer avec l'endomètre eutopique provenant de femmes saines. Nous avons démontré une augmentation dans l'activité protéolytique et nous avons identifié une augmentation de la sécrétion et de l'expression de la MMP-9 par l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de la maladie. Nous avons par la suite étudié l'effet de l'activité protéasique sur la dégradation de l'IL1 rll. Nous avons démontré que l'endomètre eutopique provenant de femmes souffrant de l'endométriose cause la dégradation de l'IL-lrlI. La troisième partie du projet consistait en l'identification de molécules bioactives sécrétées par les cellules endométriosiques qui seraient responsables de l'angiogénèse retrouvée chez les femmes souffrant de la maladie. Nous avons réussi à identifier la nm23b, une protéine qui possède une influence angiogénique chez certains cancers lorsqu'elle est surexprimée.

Une tumeur nécessite un approvisionnement en oxygène et en nutriments pour sa croissance mais aussi pour la dissémination à distance vers d’autres organes. L’angiogenèse tumorale est le phénomène exploité par la tumeur pour accomplir ses besoins. Les «Tip cells » situées à l’extrémité des capillaires en bourgeonnement initient et guident la croissance des néovaisseaux. Ces cellules sont considérées actuellement comme une cible thérapeutique pertinente pour les médicaments anti-angiogéniques. De nombreuses études ont permis d’identifier un cluster de marqueurs moléculaires exprimés de manière privilégiée au niveau des « Tip cells ». Un de ces marqueurs appelé endocan, a été identifié au laboratoire, et a fait objet du travail réalisé pendant la thèse. Endocan est un protéoglycane circulant surexprimé dans de nombreux cancers humains dont l’expression est fréquemment associée à un mauvais pronostic. Par son glycane, endocan intervient dans la croissance tumorale en augmentant l’effet des facteurs de croissance, mais aussi la migration des cellules endothéliales. Mon travail de thèse s’est orienté sur la caractérisation biochimique et fonctionnelle d’endocan murin afin d’avoir un modèle animal utile pour une meilleure compréhension de l’activité pro-tumorale d’endocan humain. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent qu’endocan murin est un protéoglycane de type chondroitine sulfate, mais partiellement glycosylé. Ce déficit de glycosylation est gouverné par des domaines peptiques distants codés par l’exon 1 et l’exon 2 et qui distinguent l’endocan murin de son homologue humain. Dans un modèle de xénogreffe tumorale chez la souris SCID, nous avons démontré qu’endocan murin ne présente aucun pouvoir pro-tumoral. Contrairement à l’endocan humain, il ralentit la vitesse de croissance tumorale. Cette propriété anti-tumorale est liée à la présence d’une forme non glycosylée. Nous avons pu montrer à travers plusieurs modèles de xénogreffes tumorales que cette propriété de freinage de la croissance tumorale s’étend aussi au core protéique d’endocan humain. De plus, nous avons pu démonter qu’une administration systémique d’endocan non glycosylé est significativement associée à un ralentissement de la croissance tumorale. Ceci établit la relation de causalité entre le polypeptide d’endocan et la propriété anti-tumorale observée dans les différents modèles animaux. Le polypeptide d’endocan ne modifie pas in vitro la prolifération ni la viabilité des cellules HT-29 ce qui laisse penser à un mécanisme d’action indirect. Sur le plan pathologique, nous avons montré que les formes non glycosylée d’endocan humain et murin sont associées à une réaction inflammatoire stromale constituée d’une infiltration pan-leucocytaire. La déplétion des leucocytes CD122+ (essentiellement les cellules NK murines) abolit partiellement l’effet anti-tumoral induit par l’endocan non glycosylé. Nos résultats ajoutent endocan au concert des molécules endothéliales tumorales qui participent au contrôle de la réaction inflammatoire stromale. / Solid tumor requires a supply of oxygen and nutrients for growth but also for metastasizing to another organ. Tumor angiogenesis is the phenomenon exploited by tumor to fulfill these needs. The"Tip cells" located at the end of sprouting capillaries initiate and guide the growth of neovessels. These cells are currently considered as an important therapeutic target for anti-angiogenic drugs. Many studies have identified a cluster of molecular markers selectively expressed by the \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\"Tip cells.\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\" One of these markers called “endocan”, has represented the subject of the thesis work.Endocan is a circulating proteoglycan overexpressed in many human carcinomas, and expression is often associated with poor prognosis. It is suspected to play an important role in tumor development. Through its glycan chain, endocan modulates the effect of growth factors, and also the migration of endothelial cells. My thesis work has focused on the biochemical and functional characterization of mouse endocan in order to obtain a useful animal model for better understanding of the pro tumoral activity of human endocan. The work presented in this manuscript shows that mouse endocan is a chondroitin sulfate proteoglycan but much less glycanated than human endocan. Our data indicate that combinatorial distant domains from the O-glycanation site, located within exons 1 and 2 determine the glycanation pattern of endocan. In SCID mouse model of tumor xenograft we demonstrated that mouse endocan does not exhibit a pro tumoral activity. In opposite to the human homologue, overexpression of mouse endocan in HT-29 cells delayed the tumor appearance and reduced the tumor growth rate. This tumor growth inhibition was mostly supported by non glycanated mouse endocan. Unexpectedly, human non glycanated endocan overexpressed in HT-29, A549, or K1000 cells also delayed the tumor appearance and reduced the tumor growth. Moreover, systemic delivery of human non glycanated endocan also reproduced HT-29 tumor delay. In vitro, endocan polypeptide did not affect HT-29 cell proliferation, nor cell viability.Interestingly, a stromal inflammatory reaction was observed only in tumors overexpressing endocan polypeptide. In addition, depletion of CD122+ cells was able to delete partially the tumor delaying effect of endocan polypeptide. These results reveal a novel pathway for endocan in the control of tumor growth, which involves innate immune cells.

L'angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de capillaires préexistants, est un processus essentiel au développement et à la croissance des tumeurs. Bon nombre de protéines ont été étudiées afin d'élucider les voies de signalisation impliquées dans l'angiogenèse, dont la métalloprotéase membranaire de type 1 (MT1-MMP). Cette protéine est reconnue pour jouer un rôle crucial dans la migration cellulaire, détruisant la matrice extracellulaire pour permettre aux cellules de migrer et ce, dans différents types cellulaires. Cependant, les mécanismes impliqués dans le contrôle de son activité demeurent incompris. Dans la présente étude, nous avons observé, en utilisant des procédures d'immunoprécipitation et de microscopie confocale, que la stimulation des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines (HUVECs) avec la sphingosine-1-phosphate (S1P), un lipide qui induit la migration des cellules endothéliales (CEs), provoque le transfert de la MT1-MMP à la périphérie cellulaire et son association avec p130Cas (Crk-associated substrate). p130Cas est une protéine d'arrimage impliquée dans les voies de signalisation de la motilité cellulaire et est également reconnue pour se relocaliser dans des replis membranaires suite à une stimulation à la S1P. Ces résultats suggèrent fortement que l'identification du complexe MT1-MMP/p130Cas au front principal des CEs migrantes pourrait être un mécanisme efficace par lequel la protéolyse péricellulaire est reliée à l'activation des voies de signalisation, permettant la migration coordonnée des CEs au cours de l'angiogenèse. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Angiogenèse, MT1-MMP, p130Cas, Migration, Sphingosine 1-phosphate.

Le rêve de l'ingénierie tissulaire de créer des substituts biologiques pleinement fonctionnels à l'extérieur du corps est entravé par nos capacités à induire une vascularisation efficace. Les biomatériaux à base de collagène sont largement utilisés pour fournir un environnement biomimétique qui soutient la migration et la croissance des cellules endothéliales (CE). Cependant, des signaux supplémentaires sont nécessaires pour déclencher la formation de structures capillaires à partir des CE, qui sont considérées comme des précurseurs des vaisseaux sanguines pour la vascularisation. Les ions cuivre (Cu²⁺), régulateurs essentiels de l'angiogenèse physiologique, ont prouvé leur efficacité pour induire vascularisation in vitro et in vivo, mais ils doivent être libérés de manière contrôlée pour éviter tout effet cytotoxique. L'acide tannique (TA) est un composé polyphénolique avec deux rôles cruciaux dans le système collagène-Cu²⁺ : ils chélatent les Cu²⁺ et ils influencent positivement les propriétés physiques des biomatériaux à base de collagène vers les exigences précédemment établies pour les échafaudages angiogéniques. Par conséquent, l'objectif de ce travail est de développer un système de libération contrôlée des Cu²⁺ à base de collagène, basé sur la double capacité de complexation du TA. Le développement des Coll TA-Cu hydrogels, ainsi que leur caractérisation concernant la libération de Cu²⁺, les propriétés physiques de l'échafaudage et la validation biologique ont été effectués. Les résultats indiquent que le TA peut contrôler efficacement la libération de Cu²⁺ des gels Coll-TA-Cu, convenant à la fenêtre de concentration efficace de Cu²⁺ pour la stimulation des CE. De plus, l'TA améliore les propriétés mécaniques et la structure des hydrogels, répondant aux caractéristiques des matériaux angiogéniques précédemment décrits dans la littérature. Ensemble, nous développons une stratégie potentielle pour la stimulation des CE vers les processus angiogéniques et jetons les bases de futurs travaux dans cette perspective. / The tissue-engineering dream of creating fully functioning tissue substitutes outside the body is hindered by our abilities to induce efficient vascularization. Collagen-based biomaterials are widely used to provide with a biomimetic environment that support endothelial cell (EC) migration and growth. However, additional signals are required to trigger the formation of capillary structures from ECs, which are considered as precursors of vascularization vessels. Copper ions (Cu²⁺), being crucial regulators of physiological angiogenesis, have proven in vitro and in vivo effectiveness in inducing vascularization, when released in a controlled way. Tannic acid (TA) is a polyphenol compound with two crucial roles in the collagen-Cu²⁺ system: they chelate Cu²⁺ and they positively influence the physical properties of collagen-based biomaterials toward the requirements previously stablished for angiogenetic scaffolds. Therefore, the aim of this work was to develop a collagen-based Cu²⁺-controlled release system, based on the dual complexation ability of TA. The development of the Coll-TA-Cu hydrogels, as well as their characterization regarding Cu²⁺ release, physical properties of the scaffold and biological validation have been performed. Results indicate that TA can effectively control the release of Cu²⁺ from Coll-TA-Cu gels, suiting the window of effective Cu²⁺ concentration for ECs metabolic stimulation. Additionally, TA improves the mechanical properties and structure of the hydrogels, meeting the features of angiogenetic materials previously described in literature. Altogether, this research highlighted a potential strategy for ECs stimulation toward angiogenetic processes and set the basis for future work in this perspective.

L’inflammation neurogène est un processus inflammatoire induisant la libération de neuropeptides, en particulier la Substance P et le Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), par les neurones sensoriels. Lors de ce processus, l’angiogenèse et la réépithélialisation, sont essentielles pour que l’inflammation diminue suite à une lésion. Dans le cadre de pathologies telle que le diabète, les patients sont souvent atteints de neuropathies en plus de souffrir d’une mauvaise guérison des plaies où l’angiogenèse est diminuée. Pour mieux comprendre ses phénomènes, deux modèles ont été reconstruits par génie tissulaire à partir d’éponge de collagène et de chitosane : l’un permettant de mimer un derme endothélialisé innervé reconstruit, et le second est un modèle permettant de suivre la réépithélialisation dans un modèle glyqué par du glyoxal, au cours du temps. À la vue de nos résultats, la Substance P semble être un neuropeptide jouant un rôle majeur dans l’angiogenèse et la réépithélialisation. / Neurogenic inflammation is an inflammatory process, characterized by the release of neuropeptides, particularly substance P and Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), in sensory neurons. During this process, angiogenesis and reepithelialization following an injury are essential to reduce inflammation. Within certain diseases, such as diabetes, angiogenesis is diminished, and patients are often suffering of diabetic neuropathies and poor wound healing. To understand that process, two models were reconstructed using tissue engineering with a collagen and chitosan sponge: one model mimics a reconstructed endothelialized and innervated dermis, and the second one follows over time re-epithelialization in a glycated model using glyoxal. Based on our results, substance P seems to be a neuropeptide playing a major role in both mechanisms.

L’atteinte des muscles locomoteurs est une manifestation systémique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Ce mémoire a pour objectif général l’étude des microARN (miR) impliqués 1) dans la myogenèse et 2) dans l’angiogenèse musculaire squelettique. Tout d’abord, l’expression de miR-1 influence la myogenèse dans les muscles locomoteurs chez des patients atteints d’une MPOC, un effet qui ne serait pas médié par IGF-1 ni par HDAC4. Ensuite, nous avons montré que l’expression de miR-1 semble négativement reliée à l’expression de VEGF dans le vastus lateralis chez les patients atteints d’une MPOC. L’ensemble de ces résultats suggère que miR-1 joueraient un rôle important dans les voies de signalisation impliquée dans la régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse des muscles locomoteurs dans la MPOC. / Limb muscle dysfunction is a systemic manifestation of COPD. This master’s thesis has for objective the investigation of microRNAs (miRs) involved 1) in myogenesis and 2) in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. First, we showed that miR-1 appears to influence myogenesis in COPD, but not through IGF-1 or by HDAC4. We also showed that miR-1 negatively influences protein expression of VEGF in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. Overall, these results suggest that miR-1 may play an important role in the regulation of limb muscle myogenesis and angiogenesis in COPD.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.