Le système vibrissal chez le rat est un modèle sensoriel particulièrement utile à étudier, car il représente un organe tactile excessivement développé et qui est nécessaire au comportement exploratoire de l'animal. L'organisation des vibrisses est représentée à chacun des niveaux de traitement de l'information, c'est-à-dire les noyaux du trijumeau, le noyau ventral postéro-médian (VPM) du thalamus et le cortex somatosensoriel primaire (SI). Les objectifs de ce mémoire consistent à classifier morphologiquement et électrophysiologiquement (in vitro) les neurones du SpVi, étudier les effets électrophysiologiques de l'acétylcholine sur les différentes populations neuronales et sur les transmissions synaptiques, ainsi que déterminer, de façon immunohistochimique, le ou les type(s) de récepteurs muscariniques impliqué(s) dans ces réponses.

Les canaux ioniques de détection d'acide (ASIC) font partie de la famille des canaux ioniques degenerin-épithéliaux Na⁺ (DEG-ENaC), dont les principaux ligands connus sont les protons. Les canaux ASIC sont préférentiellement perméables au sodium (Na⁺) et, dans une moindre mesure, à d'autres cations, tels que le potassium (K⁺), le lithium (Li⁺) et le proton (H⁺). Les sous-unités ASIC peuvent être combinées pour donner des canaux homotrimaires ou hétérotrimaires avec différents seuils d'activation activation par l'acidite, ce qui conduit à une sensibilité distincte au pH des canaux ASIC en fonction de leur composition, ce qui fait d'eux des détecteurs de pH polyvalents. Quatre gènes (Asic1-4) exprimés dans tout le système nerveux, codant pour au moins 6 sous-unités (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 et ASIC4) par épissage alternatif, ont été découverts chez les rongeurs et les humains. Plus précisément, au niveau des ganglions rachidiens du système nerveux périphérique, nous avons signalé que les ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b et ASIC3 jouent un rôle important dans plusieurs fonctions dont la nociception. Même si des études antérieures ont exploré l'implication de ces canaux dans plusieurs fonctions somatosensorielles, une analyse détaillée de leur mode d'expression dans des populations distinctes de neurones sensoriels primaires n'a pas été réalisée à ce jour en raison de la disponibilité limitée d'anticorps spécifiques commerciaux. La première étude, présentée au chapitre 1, visait à révéler le profil d'expression complet des cinq sous-unités ASIC dans trois populations différentes de neurones sensoriels primaires. Une approche d'hybridation in situ (RNAscope) a été utilisée pour cibler les sous-unités ASIC, combinée à l'immunohistochimie pour révéler des populations spécifiques. Plus précisément, je me suis concentrée sur deux types principaux de nocicepteurs ciblant les nocicepteurs non peptidergiques non myélinisés expriment le récepteur à l'isolectine B4 (IB4), et les nocicepteurs peptidergiques non myélinisés exprimant le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). De plus, j'ai ciblé les neurones multimodaux myélinisés en utilisant le neurofilament 200 (NF200). Compte tenu du rôle des ASIC dans la nociception et de leur implication dans la douleur neuropathique, j'ai également étudié comment la lésion des nerfs périphériques (induite par le menottage du nerf sciatique) affecte l'expression de chaque sous-unité dans différents segments des ganglions de la racine dorsale au sein des deux populations nociceptives. Mes résultats ont mis en évidence un profil d'expression complexe des ASIC dans des conditions naïves en fonction de la population étudiée, et une régulation différentielle des sous-unités ASIC spécifique à la région et au type de cellule après l'induction d'une lésion du nerf périphérique. La deuxième étude consiste en une investigation détaillée du profil d'expression des sous-unités ASIC1, ASIC2 et ASIC3 dans les ganglion rachidien humain. Plus spécifiquement, j'ai mené plusieurs expériences sur la co-expression des ASIC dans les neurones sensoriels primaires, en plus de l'exploration de leur profil d'expression dans les nocicepteurs peptidergiques et non peptidergiques. Cette étude, en conjonction avec mes travaux précédents, a mis en évidence des divergences et des similitudes entre les espèces qui devraient être prises en considération au cours du processus translationnel de cibles analgésiques précliniques jusqu'en traitements cliniques efficaces. / Acid-Sensing Ion Channels (ASICs) are members of the degenerin-epithelial Na⁺ channel (DEG-ENaC) family of ion channels with protons being their main known ligands. ASIC channels are preferentially permeable to sodium (Na⁺), and to a lesser extent, other cations, such as potassium (K⁺), lithium (Li⁺), and proton (H⁺). ASIC subunits can be combined giving homotrimeric or heterotrimeric channels with various acidity activation threshold, leading to distinct pH sensitivity of ASIC channels based on their composition, which makes them versatile pH sensors. Four genes (Asic1-4) expressed throughout the nervous system, encode at least 6 subunits (ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 and ASIC4) through alternative splicing, and have been discovered in rodents and humans, among other species. More specifically, in the dorsal root ganglia (DRG) of the peripheral nervous system (PNS) of rodents, ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a, ASIC2b, and ASIC3 have been reported, playing an important role in several functions including nociception. Even though previous studies have explored the channels' involvement in several somatosensory functions, a detailed analysis of their expression pattern in distinct populations of primary sensory neurons has not been conducted up to date due to the limited commercial availability of specific antibodies. The first study presented in Chapter 1, aimed to reveal the comprehensive expression pattern of the five ASIC subunits in three different populations of primary sensory neurons. An in situ hybridization approach (RNAscope) was used to target the ASIC subunits, combined with immunohistochemistry to reveal specific populations. Namely, I focused on two main types of nociceptors targeting non-myelinated non-peptidergic nociceptors with Isolectin B4 (IB4), and peptidergic non-myelinated nociceptors with calcitonin gene-related peptide (CGRP). Moreover, I targeted myelinated multimodal neurons using neurofilament 200 (NF200). Considering the role of ASICs in nociception and their involvement in neuropathic pain, I also investigated how peripheral nerve injury (induced by placing a tight cuff around the sciatic nerve) affects the expression of each subunits in different DRG segments within the two nociceptive populations. My results uncovered a complex expression pattern of ASICs in naïve conditions depending on the population under investigation, and a regional and cell type specific differential regulation of ASIC subunits after induction of peripheral nerve injury. The second study consists of a detailed investigation of the expression pattern of ASIC1, ASIC2 and ASIC3 subunits in human DRG. More specifically I conducted several experiments investigating the co-expression of ASICs in primary sensory neurons in addition to exploring their expression pattern in peptidergic and non-peptidergic nociceptors. This study, in conjunction with my previous work, uncovered species divergence and similarities that should be taken under consideration during the translational process of successful preclinical analgesic targets to effective clinical treatments.

L’inflammation neurogène est un processus inflammatoire induisant la libération de neuropeptides, en particulier la Substance P et le Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), par les neurones sensoriels. Lors de ce processus, l’angiogenèse et la réépithélialisation, sont essentielles pour que l’inflammation diminue suite à une lésion. Dans le cadre de pathologies telle que le diabète, les patients sont souvent atteints de neuropathies en plus de souffrir d’une mauvaise guérison des plaies où l’angiogenèse est diminuée. Pour mieux comprendre ses phénomènes, deux modèles ont été reconstruits par génie tissulaire à partir d’éponge de collagène et de chitosane : l’un permettant de mimer un derme endothélialisé innervé reconstruit, et le second est un modèle permettant de suivre la réépithélialisation dans un modèle glyqué par du glyoxal, au cours du temps. À la vue de nos résultats, la Substance P semble être un neuropeptide jouant un rôle majeur dans l’angiogenèse et la réépithélialisation. / Neurogenic inflammation is an inflammatory process, characterized by the release of neuropeptides, particularly substance P and Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP), in sensory neurons. During this process, angiogenesis and reepithelialization following an injury are essential to reduce inflammation. Within certain diseases, such as diabetes, angiogenesis is diminished, and patients are often suffering of diabetic neuropathies and poor wound healing. To understand that process, two models were reconstructed using tissue engineering with a collagen and chitosan sponge: one model mimics a reconstructed endothelialized and innervated dermis, and the second one follows over time re-epithelialization in a glycated model using glyoxal. Based on our results, substance P seems to be a neuropeptide playing a major role in both mechanisms.

Le Syndrome de l'Intestin Irritable (SII) est caractérisé par des douleurs abdominales chroniques, des diarrhées, des constipations ou l'alternance des deux. Les neurones sensitifs des patients seraient surexcitables et ainsi à l'origine de l'hypersensibilité viscérale ressentie. Parmi les médiateurs impliqués dans le SII, les protéases ont un rôle prépondérant notamment car il a été observé une augmentation de leur activité dans des surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII. Ces protéases sont capables d'activer les " Protease-Activated Receptors " (PARs) dans les neurones sensitifs de souris. L'activation des neurones sensitifs murins peut être déclenchée selon un mécanisme dépendant de PAR2 et générant une hypersensibilité viscérale, mais inhibée par un mécanisme dépendant de PAR4. Dans certaines cellules (plaquettes), les PARs ont des rôles très différents entre la souris et l'homme. L'expression et la signalisation des PARs dans les neurones sensitifs humains étant jusqu'alors inconnues, cette thèse a eu pour objectif général d'étudier la signalisation des PARs et d'identifier les effets de médiateurs présents dans les tissus de patients atteints du SII, sur leur capacité à activer des neurones sensitifs humains. Le but ultime était d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII chez l'homme. Le premier objectif a été de mettre au point la culture de neurones humains des ganglions spinaux dorsaux (GSD) thoraciques, contenant des projections coliques de neurones sensitifs. Une culture de neurones sensitifs d'une pureté de 90% a été obtenue, ces neurones étaient viables et fonctionnels, mobilisant du calcium intracellulaire en réponse à différents agonistes pro-nociceptifs. L'expression des PARs a été étudiée dans ces cultures et comparée à celle dans des tissus de GSD frais. PAR1, PAR2 et PAR4 de même que d'autres récepteurs canaux de la famille des " Transcient Receptors Potential " (TRPs) étaient exprimés de façon comparable dans les GSD fraichement isolés et dans les cultures de neurones, validant ainsi le phénotype physiologique des neurones en culture. L'effet des agonistes des PARs a ensuite été étudié sur la signalisation calcique dans ces cultures de neurones sensitifs humains. De tous les agonistes peptidiques des PARs utilisés, seul le peptide activateur de PAR1 a conduit à une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains, tandis que le peptide agoniste de PAR4 l'a réduite. Comme le peptide activateur de PAR1, la thrombine, une protéase capable d'activer à la fois PAR1 et PAR4 a induit une augmentation du flux calcique dans les neurones sensitifs humains. La mobilisation calcique induite par la thrombine a été inhibée par un antagoniste de PAR1 et potentialisée par un antagoniste de PAR4. La thrombine exerce donc un double effet contradictoire sur les neurones sensitifs humains, induisant un signal calcique par l'activation de PAR1 et l'inhibant par l'activation de PAR4. Les surnageants de biopsies coliques de patients atteints du SII mais pas ceux de contrôles sains, ont provoqué un flux calcique dans les neurones sensitifs humains par un mécanisme dépendant de l'activation de PAR1. Nos résultats mettent en évidence l'importance de réduire la sensibilisation des neurones sensitifs humains dépendante de l'activation de PAR1 dans le SII. Notre technique de culture de GSD humains offre de nouvelles applications en neurosciences et nos résultats permettent d'envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques quant à l'utilisation d'un antagoniste de PAR1 pour le traitement de la douleur viscérale associée au SII. / Irritable Bowel Syndrome (IBS) is characterized by chronic abdominal pain, diarrhea and/or constipation. Sensory neurons from IBS patients are considered to be over-activated, being thereby responsible of the experienced visceral pain. Among mediators involved in IBS, proteases seem to have a prominent role. First, proteolytic activity is increased in the supernatants of colonic biopsies from IBS patients. Second, these proteases activate " Proteases-Activated Receptors " (PARs) in rodent sensory neurons. Rodent primary afferent activation can be induced by a PAR2-dependent mechanism, which generates visceral hypersensitivity. This mechanism can be inhibited by a PAR4-dependent mechanism. In some cell types such as platelets, PARs may have very different functions in rodent versus human. The expression and the signalization of PARs in human sensory neurons have never been explored. The general aim of this thesis was to study the signalization of PARs and to identify the effect of mediators present in tissues from IBS patients, on their ability to activate human sensory neurons. The final objective was to identify new possible therapeutic targets to treat visceral pain associated with IBS. The first objective was to establish a protocol for culturing human sensory neurons isolated from thoracic dorsal root ganglia (DRG). Thoracic DRG contain the stroma of sensory neurons projecting from the colon. The culture of human sensory neurons was 90% pure with viable and functional neurons, which were able to induce calcium flux in response to different pro-nociceptive agonists. PAR expression was studied in cultures and compared to fresh DRG tissues. PAR1, PAR2 and PAR4 as well as others receptors from the " Transcient Receptors Potential " (TRPs) channel family were similarly expressed in neurons from fresh DRG tissues and in cultured sensory neurons, thereby validating the physiological phenotype of human DRG neurons in culture. The effect of PAR agonists was studied by imaging calcium mobilization in human sensory neuron cultures. From all PAR agonist peptides used, only PAR1 agonist peptide was able to increase calcium signaling in human sensory neurons, while PAR4 agonist peptide was able to decrease this calcium signaling. Similar to PAR1 agonist peptide, thrombin a protease capable of activating both PAR1 and PAR4, induced an increase of calcium flux in human sensory neurons. Thrombin-induced calcium mobilization was inhibited by a PAR1 antagonist and was potentiated by a PAR4 antagonist. Thus, thrombin has a contradictory double effect on human sensory neurons, inducing calcium signaling through PAR1 activation and inhibiting calcium signaling through PAR4 activation. In addition, supernatants of colonic biopsies from IBS patients but not from healthy controls, provoked an increased calcium signaling in human sensory neurons. This effect was dependent on the activation of PAR1. In the context of IBS, our results highlight the importance of targeting PAR1-induced sensitization in human sensory neurons. The DRG culture technique we have established offers important and new applications in the domain of neurosciences. All together, these data point to new therapeutic possibilities for the use of PAR1 antagonist in the treatment of visceral pain associated with IBS.

Thèse de doctorat : Sciences du vivant. Neurosciences : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 17 p.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2013-2014. / La peau est un organe densément innervé et vascularisé. L’établissement du réseau nerveux dépend de la sécrétion de signaux diffusibles dans la peau qui instruisent à distance certains neurones de s’y arboriser. Ces signaux sont les facteurs neurotrophiques. L’établissement du réseau vasculaire dépend aussi de la présence de signaux instructifs. Notre objectif général était de mieux comprendre l’influence des signaux neurotrophiques et aussi nerveux dans le contexte cutané. Les travaux présentés dans cette thèse décrivent de nouvelles interactions paracrines. Alors que certaines de ces interactions depuis la peau vers les neurones sensoriels et certaines depuis les neurones sensoriels vers le réseau vasculaire pour la vasodilatation sont déjà établies, nous décrivons l’influence des facteurs neurotrophiques sur le réseau vasculaire et l’influence des neurones sensoriels sur la réépithélialisation. Nous avons premièrement émis l’hypothèse qu’en plus d’influencer les neurones, les facteurs neurotrophiques influencent le réseau vasculaire. Nous montrons que le NGF, le BDNF, le NT-3 et le GDNF sont tous exprimés dans l'épiderme, que le NGF et le NT-3 sont exprimés par les fibroblastes et que le BDNF est produit par les cellules endothéliales. Les cellules de Schwann, également retrouvées dans la peau, produisent du NGF, BDNF et GDNF. Nous montrons que ces peptides sont de très puissants facteurs angiogéniques en utilisant un modèle de derme endothélialisé humain reconstruit par génie tissulaire. Une augmentation de 40 à 80 % du nombre de pseudocapillaires fut observée après l'addition de 10 ng/ml de NGF, 0,1 ng/ml de BDNF, 15 ng/ml de NT-3, et 50 ng/ml de GDNF. Cet effet angiogénique dépend de la liaison aux récepteurs de facteurs neurotrophiques TrkA, TrkB, GFRa-1 et c-ret, qui sont tous exprimés par les cellules endothéliales humaines. Cet effet a été bloqué pour les récepteurs Trk par l’addition de l'inhibiteur compétitif K252a. Ensuite, nous avons dans un deuxième temps émis l’hypothèse que les neurones sensoriels influencent directement la réépithélialisation. Pour vérifier cela, nous avons développé un nouveau modèle de réépithélialisation par génie tissulaire. Il est constitué d’un équivalent épidermique troué exprimant une protéine fluorescente verte qui a été empilé sur un équivalent dermique servant de substrat pour l’épiderme qui referme alors naturellement la plaie. L’équivalent est endothélialisé et innervé ou non par les neurones sensoriels de souris. Nous avons observé que la réépithélialisation est plus rapide en présence de neurones sensoriels. Nous avons démontré que les neurones sensoriels sécrètent une petite protéine dans notre modèle, soit de la substance P, et que les kératinocytes expriment le récepteur cellulaire NK1 de la substance P. Enfin, nous montrons que la substance P contribue à augmenter la vitesse de fermeture des plaies induites par les neurones à l'aide d’un agoniste et d’un antagoniste du récepteur NK1. L'ensemble des résultats procure une meilleure compréhension de l’importance des contextes neurotrophiques et nerveux dans la peau. Nos résultats pourraient laisser présager que d’améliorer la régénération nerveuse cutanée lorsqu’elle est déficiente améliorerait aussi l’homéostasie du tissu cutané. / The skin is an organ densely innervated and vascularized. The establishment of the cutaneous nervous system depends on the secretion of neurotrophic factors by the skin. Meanwhile, the establishment of the vascular network also depends on soluble instructive cues. The work presented in this thesis describes new paracrine interactions. While interactions from skin to sensory neurons for the development of innervation and interactions from sensory neurons to blood vessel for vasodilation of the vasculature are described elsewhere, we demonstrate here the influence of neurotrophic factors on the vascular network and the influence of sensory neurons on the reepithelialization of wounds. Our overall goal was to clarify the influence of the neurotrophic and nervous contexts on the homeostasis of the skin. First, we hypothesized that in addition to their neuronal contribution, neurotrophic factors also influence the vascular network. We show that NGF, BDNF, NT-3 and GDNF are expressed in the epidermis, while NGF and NT-3 are expressed by fibroblasts and BDNF by endothelial cells. Finally, Schwann cells produce NGF, BDNF and GDNF. We show that these peptides are very potent angiogenic factors using a model of human endothelialized reconstructed dermis by tissue engineering. An increase of 40 to 80% of the number of capillary-like tubes was observed after the addition of 10 ng/ml NGF, 0.1 ng/ml of BDNF, 15 ng/ml of NT-3, and 50 ng/ml of GDNF. This angiogenic effect depends on the neurotrophic factor receptor TrkA, TrkB, GFRa-1 and c-ret that are all expressed by human endothelial cells. This effect was blocked by adding the Trk inhibitor K252a for NGF, BDNF and NT-3. Second, we hypothesized that sensory neurons directly influence reepithelialization by secreting the neuropeptide substance P. To verify this, we developed a new model of reepithelialization. It consists of a perforated epidermal equivalent expressing a green fluorescent protein stacked on a dermal equivalent that is used as a bed for reepithelialization. The reconstructed skin is endothelialized and innervated or not with sensory neurons of mouse. Sensory neurons produce substance P in the model and keratinocytes express the NK1 cell receptor for substance P. Keratinocyte migration was quantified by fluorescence. Reepithelialization was faster in presence of sensory neurons and we show that substance P contributes to this effect with agonist and antagonist of the NK1 cell receptor. The overall results provide a better understanding of the importance of the neurotrophic and sensory contexts in the skin. Thus, cutaneous innervation does not only contribute to the sensory detection. Our findings may suggest that improving nerve regeneration would improve skin long term tissue homeostasis.