Erytropoietin (EPO) är ett endogent glykoproteinhormon som stimulerar produktionen av erytrocyter. Erytrocyternas huvuduppgift är att transportera syre till vävnader och på detta sätt främja aerob metabolism vilket genererar energi till musklerna. På 80-talet framställdes för första gången rekombinant humant EPO (rHuEPO) vilket på senare år använts illegalt som dopingmedel. Denna typ av doping klassas följaktligen som bloddoping och 1990 förbjöds rHuEPO av World Anti-Doping Agency (WADA). Många fall av rHuEPO doping har emellertid uppdagats under åren där syftet med användningen hos atleterna har varit att bland annat öka sin uthållighetskapacitet och således prestationsförmåga.   Syftet med detta fördjupningsprojekt var att undersöka vilka samt hur kraftfulla effekter rHuEPO har på parametrar som förbättrar prestation. Metoden som tillämpades för projektet var en systematisk litteraturöversikt där vetenskapliga originalstudier, relevanta för syftet, granskades och sammanställdes. Resultatet visade på att rHuEPO ökar VO2max vilket är en indikation på en atlets kardiorespiratoriska kondition. Även hematologiska parametrar som total hemoglobinmassa (tHb), hemoglobinkoncentration (HGB) samt hematokrit (HTC) ökade vilka alla tre är involverade i syretransporten i cirkulationssystemet. Resultatet visar således på att en kur av rHuEPO har positiva effekter parametrar som är viktiga för en atlets prestation. Om den effekt som resultatet visade på prestation appliceras på verkligheten skulle det innebära att en längdskidåkare i Vasaloppet 2020 skulle komma på första plats istället för 73:a.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_thais_farias_collares.pdf: 1094762 bytes, checksum: 647dd933472bf9127c0164ee875617ea (MD5) Previous issue date: 2013-10-17 / The history of sports competition has been related to the use of methods for physical training associated with physiological methods to increase athlete performance. Ethical issues involving the high performance sport and doping are confused with the history of competitive sports. The World Anti - Doping Agency (WADA) prohibits the use of substances or methods to artificially increase sports performance. Currently, 258 substances are listed by WADA and athletes around the world are subjected to tests proving the non-use of doping. EPO is a glycoprotein hormone that has as its main physiological effect induction of erythropoiesis and thereby improving the capacity to transport oxygen in the blood. For these reason EPO has been included in WADA list. The analytical differentiation of endogenous erythropoietin from its recombinant counterpart, using isoelectric focusing and double blotting is a milestone in the detection of doping with recombinant erythropoietin. However, several analogs of the original recombinant EPO are not easily detectable by standard IEF method, requiring the development of alternatives for the detection of doping. In order to improve the current methods of EPO detection, monoclonal and polyclonal antibodies against EPO were obtained and used in various techniques for detection of EPO in biological samples. However, the specificity of these antibodies has been quite controversial and discussed. Therefore, it is necessary to obtain antibodies capable of reacting specifically with the EPO. In this study, rHuEPO was inoculated in New Zealand rabbits to generate a polyclonal antibody (pAb anti-rHuEPO). The pAb was characterized for its potential in detecting rHuEPO using different approaches. The pAb anti- rHuEPO identified the expression of recombinant protein in eukaryotic cells and was able to detect rHuEPO in a suspension at 0.1 μg/mL, showing its potential as a tool for detection of doping by rHuEPO. / A história da competição esportiva sempre esteve relacionada à utilização de metodologias de treinamento físico associadas a métodos de incremento fisiológico do atleta, visando sua máxima performance. Questões éticas envolvendo o esporte de alto rendimento e o doping se confundem com a própria história do esporte competitivo. A Agência Mundial Anti-Doping (WADA) proíbe o uso de substâncias ou métodos capazes de aumentar artificialmente o desempenho esportivo. Atualmente, 258 substâncias estão na lista da WADA e atletas do mundo inteiro são submetidos a testes comprobatórios da não utilização do doping. Entre essas substâncias ilícitas para uso por atletas destaca-se a eritropoetina (EPO). A EPO é um hormônio glicoproteico que possui como principal efeito fisiológico a indução da eritropoiese e consequente melhoria da capacidade de transporte de oxigênio no sangue. A diferenciação analítica da eritropoetina endógena produzida a partir de sua contraparte recombinante usando focalização isoelétrica e duplo blotting é um marco na detecção do doping com eritropoetina recombinante. Anticorpos monoclonais e policlonais específicos anti-EPO foram obtidos e utilizados em várias técnicas para a detecção da EPO em amostras biológicas a fim de melhorar os métodos atuais de detecção. Contudo, a especificidade destes anticorpos tem sido bastante controversa e discutida. Portanto, a obtenção de anticorpos específicos capazes de reagir especificamente com a EPO faz-se necessária. Neste estudo, a rHuEPO foi utilizada para imunizar coelhos New Zealand para gerar um anticorpo policlonal (pAb anti-rHuEPO). O pAb foi caracterizado quanto ao seu potencial na detecção da rHuEPO usando diferentes metodologias. O pAb anti-rHuEPO identificou a expressão da proteína recombinante em células eucarióticas e foi capaz de detectar rHuEPO em suspensão até 0,1 μg/mL, comprovando seu potencial como ferramenta para detecção do doping por rHuEPO.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_thais_farias_collares.pdf: 421000 bytes, checksum: d922362fc9456c8a75d15a49744bf882 (MD5) Previous issue date: 2010-05-28 / The administration of recombinant proteins is being used in sport as gene doping. In medicine, a recent therapeutic technique is the genetic therapy, which, up to this moment, shows results that indicate its efficiency in the treatment of some diseases. Recently, the potential for misuse of gene therapy among athletes has called the attention of scientists and sports regulating organs. The transfer of genes that could enhance athletic performance was named gene doping. The most important candidate genes for gene doping are Erythropoietin (EPO), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor I (IGF-1) and myostatin blockers. Nevertheless, gene therapy presents adverse indicators, such as inflammatory response and lack of control of gene activation. It is probable that in healthy individuals such problems would be aggravated. There are still no conclusive tests capable of detecting gene doping. However, recent researches have studied promising strategies. The reflection of the use of EPO on reproductive parameters in vivo has not yet been described. On the other hand, in vitro studies with cultured cells have shown that erythropoietin stimulates steroidogenesis in Leydig cells, triggering an increase in testosterone production. The objective of this study is to evaluate the effects of the administration of recombinant erythropoietin (rHuEpo) and erythropoietin gene transfer in reproductive parameters of rabbits. Fifteen rabbits were divided in 3 groups: group I (rHuEpo) received subcutaneously 25UI/kg of recombinant human erythropoietin, three times a week for 5 weeks; group II (pTarget/Epo) received a single dose of recombinant vector with the gene of the rabbit erythropoietin; group III (pTarget) received a single dose of empty pTarget vector (control). Throughout the experiment, reproductive and blood parameters were monitored, such as: sperm motility, spermatic vigor, sperm concentration, sperm viability, sperm morphology, erythrocytes and hematocrit level. Erythropoietin gene transfer and rHuEpo administration caused a significant increase in the number of erythrocytes. The animals which received rHuEpo showed an increase in the hematocrit level, reaching numbers between 41,34 and 52,32. The statistical analysis proved that the treatment and the time did not interfer on sperm motility, sperm concentration and spermatic vigor (P<0.05). The percentage of morphologically normal cells in group I as well as in group II decreased over time, however, there was no statistical difference between the treatments (P<0.05). This study is the first to show the answers to the use of gene doping with the erythropoietin gene and the rHuEpo administration in reproductive and blood parameters. / A administração de proteínas recombinantes vem sendo utilizada no esporte como um meio de doping. Na medicina, um método terapêutico bastante recente é a terapia gênica, que até o momento, possui resultados indicando sua eficiência no tratamento de algumas doenças. Recentemente, o potencial para uso indevido desta terapia entre atletas tem despertado a atenção de cientistas e órgãos reguladores do esporte. A transferência de genes que poderiam melhorar o desempenho esportivo de atletas saudáveis foi denominada de doping genético. Os principais genes candidatos são eritropoetina (EPO), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) e bloqueadores da miostatina. Porém a terapia gênica apresenta indicadores adversos, como resposta inflamatória e falta de controle da ativação do gene. Em indivíduos saudáveis, é provável que essa situação seja agravada. Ainda não existem testes conclusivos para a detecção do doping genético, no entanto alguns estudos recentes têm o intuito de investigar algumas estratégias que apontam como promissoras. O reflexo do uso da EPO sobre parâmetros reprodutivos in vivo ainda não tem sido descritos, por outro lado, estudos in vitro com cultivo de células têm demonstrado que a eritropoetina estimula a esteroidogênese nas células de Leydig desencadeando um aumento na produção de testosterona. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da administração de rHuEpo (eritropoetina recombinante) e da transferência gênica com eritropoetina em parâmetros reprodutivos de coelhos. Quinze coelhos foram divididos em 3 grupos: grupo I (rHuEpo) receberam por via subcutânea 25UI/kg de eritropoetina humana recombinante, três vezes por semana durante cinco semanas, grupo II (pTarget/Epo) receberam dose única de vetor recombinante com o gene da eritropoetina de coelho; grupo III (pTarget) receberam dose única de vetor pTarget vazio (controle). Parâmetros sanguíneos e reprodutivos foram monitorados durante o experimento, tais como: motilidade, vigor espermático, concentração espermática, viabilidade espermática, morfologia espermática, hemácias e hematócrito. A transferência gênica com eritropoietina e a administração de rHuEpo causaram um aumento significativo no número de eritrócitos. Os animais que receberam rHuEpo obtiveram um aumento no hematócrito, alcançando valores entre 41,34 e 52,32. A análise estatística mostrou que os tratamentos e o tempo não interferiram na motilidade, concentração espermática e vigor espermático (P <0,05). A porcentagem de células com morfologia normal, tanto do grupo I como do grupo II diminuiu no decorrer do tempo, mas não houve diferença estatística entre os tratamentos (P<0,05). Este é o primeiro estudo que relata as respostas do uso do doping genético com o gene da eritropoetina e da administração de rHuEpo em parâmetros sanguíneos e reprodutivos.