Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T21:13:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328413.pdf: 6003694 bytes, checksum: cbbd067975d73d6c668de99d7111401e (MD5) Previous issue date: 2014 / A família das trans-sialidases (TS) é a maior família gênica de Trypanosoma cruzi. O grupo II da superfamília TS reúne diversas glicoproteínas (entre elas, a gp82 e a gp85) presentes na superfície das formas tripomastigotas do T. cruzi. A gp82 está envolvida no processo de adesão do parasito à célula hospedeira e a gp85 na adesão e penetração. Embora sialidases estejam presentes no T. rangeli, a função destas proteínas no ciclo de vida deste parasito ainda não foi esclarecida. Em função disso, o objetivo deste estudo foi estudar os genes de T. rangeli relacionados à superfamília das TS e avaliar a expressão heteróloga da gp82 de T. cruzi por T. rangeli (T. rangeli-gp82). Inicialmente, foram identificadas no genoma do T. rangeli oito ORFs completas similares a gp82 e gp85 de T. cruzi. Por se tratar de várias cópias gênicas, diferentes sequências foram analisadas a partir de amplificação e clonagem destes genes em duas cepas de T. rangeli. As sequências avaliadas continham de um a dois motivos Asp, um motivo subterminal, sítio de ancoramento a GPI e um domínio que pertence a superfamília das glucanases/lectina tipo Concanavalina A. Após a obtenção da cepa recombinante T. rangeli-gp82, observou-se que a gp82 foi expressa na superfície dos parasitos de forma semelhante ao T. cruzi. Além disso, a expressão da gp82 não interferiu nos padrões de crescimento e de diferenciação in vitro do T. rangeli. Em ensaios de interação destes parasitos com células Vero, verificamos um maior número de parasitos da cepa T. rangeli-gp82 nas células hospedeiras em relação à cepa selvagem, além de um maior número de parasitos aderidos às células em relação as demais cepas analisadas. Tanto as formas epimastigotas quanto tripomastigotas de T. rangeli-gp82 foram capazes de mobilizar cálcio intracelular. Estes resultados diferem do observado na interação com células THP-1, onde não verificamos diferença significativa entre T. rangeli-gp82 e as demais cepas analisadas. Em triatomíneos, verificamos que a cepa T. rangeli-gp82 apresenta desenvolvimento semelhante à cepa selvagem, sendo capaz de colonizar a hemolinfa e invadir as glândulas salivares de R. prolixus. Em camundongos, tripomastigotas de todas as cepas de T. rangeli foram observados na corrente sanguínea de animais C57BL/6 infectados via intraperitoneal, porém não foi observada proliferação, sendo a cinética parasitêmica similar para todas as cepas do T. rangeli. Quando estes camundongos foram desafiados com T. cruzi, não observamos alteração na parasitemia deste parasito em relação à infecção controle, entretanto houve uma diminuição do parasitismo tecidual por este parasito nos animais pré-infectados com as três cepas de T. rangeli, principalmente T. rangeli-selvagem e GFP. Com estes resultados, podemos inferir que a proteína gp82 facilita a adesão e penetração do parasito a célula hospedeira, entretanto a expressão desta proteína pelo T. rangeli não promove uma proteção substancial contra a infecção por T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:18:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223531.pdf: 979006 bytes, checksum: 09cf3ec36da16e960e9f315e1d955827 (MD5) / O Trypanosoma rangeli é um protozoário flagelado, pertencente à Ordem Kinetoplastida, capaz de infectar triatomíneos, mamíferos silvestres e domésticos, bem como o homem nas Américas Central e do Sul. Quando comparado a organismos do mesmo gênero, é notória a falta de informações existentes acerca deste parasito, sobretudo a nível molecular. No presente estudo, apresentamos os resultados obtidos a partir da geração e seqüenciamento de 4 bibliotecas de cDNA de formas tripomastigotas da cepa Choachi de T. rangeli, utilizando a técnica ORESTES. O seqüenciamento dos clones obtidos resultou na geração de 2.475 ORESTES, das quais 1.295 (52,3%) apresentaram alta qualidade (Phred=15). O agrupamento das seqüências resultou em 758 seqüências não redundantes com tamanho médio de 341pb e conteúdo G+C de 54%. Destas seqüências, apenas 2,5% apresentaram similaridade com seqüências deste parasito, 61,21% com outros tripanosomatídeos e somente 5,28% com outros organismos. Além disso, 31% das ORESTES geradas não apresentaram similaridade com seqüências depositadas nos bancos de dados públicos consultados, as quais podem estar representando genes únicos do T. rangeli, os quais ainda não foram caracterizados, genes desconhecidos ou mesmo artefatos da técnica. Estes resultados representam as primeiras seqüências do transcriptoma desta forma evolutiva do parasito.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340762.pdf: 2249783 bytes, checksum: 26401702acb67e78e563d1df40ac6d86 (MD5) Previous issue date: 2016 / O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada.<br> / Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-03-28T04:11:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344593.pdf: 4945044 bytes, checksum: be573a4fe45eca3dde59625b082bf902 (MD5) Previous issue date: 2016 / Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado pertencente à Ordem Kinetoplastea, grupo ancestral de protistas que contém grande diversidade de espécies, entre elas organismos de vida livre e parasitos com distintos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Um dos objetivos deste trabalho foi caracterizar in silico enzimas envolvidas direta ou indiretamente na defesa antioxidante de T. rangeli, além de compará-las a suas ortólogas junto a diferentes espécies de Kinetoplastídeos. Dos genes analisados, não foram identificados em T. rangeli: cisteína sintase, ornitina decarboxilase, glutamilespermidina sintase e ascorbato peroxidase, embora o primeiro e o último tenham sido identificados como pseudogenes. Todos os genes foram identificados em Bodo saltans, sugerindo que os mecanismos antioxidantes evoluíram antes do aparecimento do parasitismo nesse grupo. De forma geral, observou-se que a variabilidade de enzimas no sistema antioxidante a nível genômico entre tripanosomatídeos relaciona-se a adaptações específicas ao parasitismo em ampla gama de hospedeiros e sua transmissão pelos vetores e não somente ao isolamento geográfico. Entre as enzimas analisadas, duas destacam-se em relação a infectividade e virulência em tripanosomatídeos patogênicos, a tripanotiona redutase (TRed) e triparedoxina peroxidase em suas isoformas citosólica (TRPxcit) e mitocondrial (TRPxmit). O gene da TrTRed possui uma ORF de 1.473 pb (~490 aa/ 53 kDa) estando presente em cópia única no genoma haploide de T. rangeli. A análise da proteína predita da TrTRed revelou a presença de dois domínios relacionados à ação oxidoredutase. O gene da TrTRPxcit apresentou-se com 549 pb gerando uma proteína com 182 aminoácidos (~ 20 kDa), enquanto para TrTRPxmit a ORF possui 681pb que prediz uma sequência de 266 aminoácidos (~25 kDa). A análise das sequências aminoacídicas deduzidas da TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou a presença dos domínios VCP e ICP, respectivamente, além das cisteínas peroxidásica (Cp) e de resolução (Cr). A análise da expressão gênica e proteíca de TrTREd, TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou ausência de expressão significativa estágio-específica, porém a espressão da TRed é significativamente maior em T. cruzi do que em T. rangeli. O estresse oxidativo gerado pela adição de H2O2 não induziu alterações significativas na expressão de nenhuma proteína analisada. A presença de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) e glutationa reduzida (GSH) no meio induziu a proliferação de epimastigotas in vitro, mas não alterou o perfil de expressão da TrTRed ao longo do tempo. A síntese de NADPH foi reduzida e a produção endógena de H2O2 é maior em T. rangeli quando comparada a T. cruzi. Estudos enzimáticos em extratos de T. rangeli mostraram maior atividade da TRed em epimastigotas do que em tripomastigotas. A superexpressão da proteína TrTRed não influenciou o crescimento ou o processo de diferenciação em tripomastigotas in vitro e os parasitos transfectados (TRed+) mostraram aumento na resistência ao estresse induzido pelo H2O2. Conclui-se que o T. rangeli apresenta uma maquinaria de defesa antioxidante semelhante ao T. brucei e ao T. cruzi em função de presença/ausência de genes e quanto à similaridade nas sequências, respectivamente. Além disso, a TrTRed parece não ser a principal envolvida na resposta do T. rangeli ao ambiente oxidante em células do hospedeiro vertebrado, mas possui papel crucial durante a infecção do hospedeiro invertebrado.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli belongs to the Order Kinetoplastea, an ancestral group of protists containing a variety of free-living and parasitic species with distinct mechanisms of antioxidant defence. In this study we have characterized in silico the enzymes directly or indirectly involved on the T. rangeli response t oxidative stress and to comparatively characterize to its orthologs on other kinetoplastids. Ornithine decarboxylase, glutamyl spermidin synthase were not found on the T. rangeli genome while cysteine synthase and ascorbate peroxidase were found as pseudogenes. Since all genes related to antioxidant defence were found on Bodo saltans we hypothesize that such mechanism has evolved prior the parasitic lifestyle. As a rule, we have observed that genomic variability among the antioxidant system genes from trypanosomatids are related to specific adaptations to a parasitic lifestyle between distinct hosts and vectors instead of geographical isolation. Among the studied enzymes, the trypanotion reductase (TRed) and the cytosolic (TRPxcit) and mitochondrial (TRPxmit) forms of tryparedoxin peroxidase are related to virulence and infectivity. The T. rangeli TRed (TrTRed) is a singe-copy gene and has an ORF of 1.473 bp (~490 aa/ 53 kDa) and the predicted TrTRed proteins revealed two oxidoreductase-related domains. The TrTRPxcit gene is 549 bp long coding to a 182 aa protein (~ 20 kDa) while the TrTRPxmit is 681 bp long, predicting to 266 aa protein (~25 kDa). Both TrTRPxcit and TrTRPxmit proteins revealed the presence of the VCP and ICP domains, respectively, along the peroxidatic cysteine (Cp) and resolving cysteine (Cr). The transcription and expression profiles of TrTREd, TrTRPxcit and TrTRPxmit revealed the no stage-specific differences, but was significatly higher in T. cruzi than T. rangeli. No differences on expression were observed for any of the analyzed genes when parasites were exposed to an H2O2-induced stress. Addition of antioxidants such as NAC and GSH on the culture media induced proliferation of epimastigotes in vitro, not altering the TrTRed expression overtime. NADPH generation is lower and production of endogenous H2O2 is higher in T. rangeli Choachí strain than in T. cruzi Y strain epimastigotes. Enzymatic assays revealed an increased activity of TRed on T. rangeli epimastigotes than trypomastigotes. Overexpression of TrTRed has no influence on the growth or on the in vitro differentiation to trypomastigotes, but transfectants revealed an increased resistance to a H2O2-induced stress. Based on the presence/absence of genes and on the sequence similarity, the T. rangeli antioxidant machinery is related to T. brucei and to T. cruzi, respectively. Also, TrTRed seems not to be the main enzyme involved on the T. rangeli response to the oxidative stress on the mamalian host, but having crucial relevance on the infection of the insect vectors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T12:39:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O Trypanosoma rangeli é um parasita hemoflagelado que infecta uma grande variedade de espécies de mamíferos, incluindo o homem, nas Américas Central e do Sul. Devido a possibilidade da ocorrência de reações sorológicas cruzada com o T. cruzi, diversos estudos tem se voltado para a obtenção de formas tripomastigotas de T. rangeli. Recentemente nosso grupo padronizou a diferenciação do T. rangeli in vitro incubando parasitas em meio DMEM obtendo-se cerca de 80% de formas tripomastigotas. Testando individualmente cada um dos aminoácidos presentes no meio DMEM, parasitas incubados em L-glutamina apresentaram taxas de diferenciação superiores a 80%, enquanto que a incubação com outros aminoácidos induziram baixas diferenciações e/ou altas mortalidades. A adição de DFMO, um inibidor específico e irreversível da ornitina descarboxilase (ODC), reduziu drasticamente as taxas de diferenciação, que foram recuperadas apenas após a adição de putrescina, sugerindo que a ODC é uma enzima chave na regulação da diferenciação do T. rangeli in vitro. Porém, a incubação de parasitas com as poliaminas putrescina, espermidina e espermina, sem L-glutamina, ocasionou altas mortalidades, sugerindo a importancia da L-glutamina para a manutenção do T. rangeli. Também padronizamos duas metodologias distintas para produção e purificação de tripomastigotas de cultura e sangüíneos pelas metodologias de cromatografia de troca iônica, utilizando CM-celulose, e centrifugação diferencial de gradiente, utilizando Histopaque - 1077® respectivamente. A recuperação de tripomastigotas de cultura ficou em torno de 20% e dos tripomastigotas sangüíneos ficou em torno de 40%. Nossos resultados abrem novas perpectivas para estudos da biologia deste parasita, principalmente em relação a regulação gênica e expressão de proteínas de interesse para o diagnóstico diferencial entre T. rangeli e T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T05:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 200174.pdf: 780725 bytes, checksum: 5105c9e6dff3c5b93f852902d1aee0fc (MD5) / O Trypanosoma rangeli, bem como o T. cruzi, são protozoários parasitas da Ordem Kinetoplastida sendo amplamente distribuídos nas Américas Central e do Sul, onde compartilham reservatórios, vetores em regiões geográficas distintas. Infecções produzidas pelo T. cruzi resultam na doença popularmente conhecida como mal de Chagas enquanto que as infecções causadas pelo T. rangeli parecem não ser patogênicas para seres humanos. Apesar disso, cerca de 60% da constituição antigênica solúvel destes parasitas é compartilhada o que pode determinar reações sorológicas cruzadas, dificultando o diagnóstico específico e mascarando a epidemiologia da doença de Chagas humana. As metodologias rotineiramente utilizadas no diagnóstico da doença de Chagas não são capazes de distinguir entre as duas espécies fazendo-se necessária a abertura de novas estratégias que nos permitam distinguí-las de maneira fácil, rápida e economicamente viável. No presente trabalho apresentamos os resultados obtidos à partir da construção e seqüenciamento de três bibliotecas de cDNA de formas epimastigotas da cepa Choachi de T. rangeli que resultaram na obtenção de 656 ESTs, dentre as quais apenas 20 ESTs foram homólogas à seqüências de T. rangeli e 245 não apresentaram homologia com seqüências dos bancos de dados pesquisados. Estes resultados demonstram a importância do uso deste tipo de estratégia para obtenção de novas informações à respeito do T. rangeli, servindo como base para a identificação de alvos diagnósticos ou para estudos da e suas interações com seus hospedeiros.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T07:38:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 190708.pdf: 1203767 bytes, checksum: 476a33b37e262bc8eabf659f27b8d289 (MD5) / O Trypanosoma rangeli, assim como o T. cruzi, são protozoários hemoflagelados, parasitas de uma grande variedade de mamíferos domésticos e silvestres, incluindo humanos, numa ampla extensão da América do Sul e Central. Apesar da aparente apatogenicidade para mamíferos, o T. rangeli determina reações sorológicas cruzadas com T. cruzi, dificultando desta forma o diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Uma grande heterogeneidade intra-populacional destes parasitas foi comprovada pelas marcantes diferenças no comportamento biológico tanto em hospedeiros vertebrado como invertebrados e, mais recentemente, por vários marcadores moleculares. Nesse sentido, o presente estudo avaliou comparativamente os espaçadores ITS-1 e ITS-2 que flanqueiam a subunidade 5,8S do gene do RNA ribossomal (rRNA) entre diferentes cepas de T. rangeli isoladas de hospedeiros e origens geográficas distintas. Tendo revelado um baixo nível de variabilidade de ambos os espaçadores entre as cepas estudadas, os resultados revelaram a existência de polimorfismos de mononucleotídeos (SNP's) na subunidade 5,8S do gene do rRNA. Apesar da observação que o espaçador ITS-1 demonstrou-se menos polimórfico que o ITS-2, não foi possível realizar nenhuma inferência epidemiológica. A inclusão de seqüências homólogas do gene do rRNA de cepas de T. cruzi e Leishmania sp. demonstrou a possível utilização deste marcador na diferenciação interespecífica de tripanosomatídeos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T16:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 274888.pdf: 2762357 bytes, checksum: 1bc3459f95132c9e903cdaa20d8a4261 (MD5) / O presente estudo realizou a identificação e análise de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP) no gene do mini-exon (spliced leader) e na região intergênica do gene da histona H2A, e de sequências repetitivas (microssatélites) em formas epimastigotas e tripomastigotas das cepas SC-58 e Choachí de T. rangeli. Para a análise de microssatélites três abordagens foram utilizadas: a pesquisa em bibliotecas de EST/ORESTES (Expressed Sequence Tags/Expressed Sequence Tags), a pesquisa em bibliotecas genômicas geradas pela metodologia PIMA e a amplificação via PCR de loci previamente identificados em outras espécies. Os microssatélites identificados foram avaliados quanto à abundância, frequência e viabilidade como marcadores genéticos. Os loci identificados por PCR foram avaliados através da genotipagem de 20 cepas e dois clones de T. rangeli. A ocorrência de SNP foi investigada através da clonagem e sequenciamento do produto de amplificação do gene do spliced leader e da região intergênica do gene da histona H2A de formas epimastigotas de diferentes cepas de T. rangeli. Os resultados obtidos com estes marcadores permitiram o estudo da estrutura populacional do T. rangeli, gerando análises filogenéticas consistentes. Os resultados demonstram que o T. rangeli, assim como o T. cruzi, apresenta uma estrutura populacional predominantemente clonal, e a subdivisão populacional pode ser em parte explicada pela classificação nas linhagens KP1+ e KP1-. Uma subdivisão da população KP1- foi detectada e confirmada utilizando os marcadores microssatélites identificados, sugerindo eventos recentes de evolução, provavelmente influenciados pela troca de hospedeiros durante o ciclo de vida, pela localização geográfica e/ou por uma co-evolução do parasito com suas espécies vetores simpátricas. Novas sequências tipo EST (Expressed Sequence Tags), ORESTES (Open Reading Frame EST) e GSS (Genome Survey Sequences) do T. rangeli foram geradas no âmbito do presente estudo. A análise destas sequências, assim como a análise dos microssatélites e de SNP, trará novas perspectivas para compreensão do desconhecido ciclo do parasito em seus hospedeiros mamiferos, assim como para o diagnóstico específico de infecções causadas por T. cruzi e/ou T. rangeli.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277022.pdf: 4321942 bytes, checksum: 61f110123aa6e16130d34cb59a61133a (MD5) / DNA topoisomerases são enzimas que participam de diversos processos celulares tais como: replicação, transcrição, recombinação e segregação dos cromossomos. Atuando na clivagem transitória de uma fita (tipo I) ou ambas as fitas (tipo II) da molécula de DNA, as topoisomerases são alvos de agentes bactericidas e de drogas antitumorais e podem ser um importante alvo para quimioterapia de doenças causadas por parasitos. Neste estudo, descrevemos e caracterizamos os genes que codificam as topoisomerases tipo II de Trypanosoma rangeli (TrTop2). Os genes TrTop2 apresentaram um quadro aberto de leitura com 3.696 (TrTop2mt) e 4.368 pares de bases (TrTop2?), codificando polipeptídios preditos de 1.232 (138,8 kDa) e 1.456 (164,1 kDa) aminoácidos, respectivamente. Ambos os genes apresentaram uma alta similaridade da sequência protéica com topoisomerases ortólogas de outros tripanosomatídeos, sobretudo com T. cruzi (96% e 85%). Entre os dois genes a similaridade a nível de aminoácidos foi de 56%, sendo ambos de cópia única no genoma do T. rangeli. Anticorpos dirigidos a fragmentos protéicos de ambas as proteínas foram utilizados em ensaios de western blot e revelaram bandas de aproximadamente 130 kDa em extratos protéicos totais de T. rangeli. Embora com tamanho similar, foram identificadas proteínas distintas quando avaliadas por eletroforese 2D (pI 6,4 e 7,6). Através de géis de poliacrilamida em condições não desnaturantes foi possível determinar que ambas as proteínas nativas formam um complexo protéico de alto peso molecular indicando uma possível interação entre proteínas ou subunidades. Ensaios de imunolocalização com os distintos anticorpos contra DNA topoisomerases II apontaram diferentes padrões de localização celular, com reconhecimento no núcleo ou no cinetoplasto em formas epimastigotas e em alguns casos dispersa no citoplasma de formas tripomastigotas. A novobiocina, inibidor de topoisomerases tipo II procarióticas, foi ativo in vitro contra o T. rangeli. Acima de 300 ?g/ml observa-se uma redução no crescimento dos parasitos com alterações morfológicas e estruturais a nível nuclear e do cinetoplasto. Acima de 150 ?g/ml observa-se completa inibição da diferenciação celular in vitro. Utilizando as proteínas mtHSP70, DHLADH e a DNA topoisomerase II mitocondrial (TrTop2mt) como marcadores biológicos, foi observado redução da expressão das mesmas durante a diferenciação do T. rangeli, assim como nos tratamentos com novobiocina. Conclui-se que eventos relacionados as DNA topoisomerases II podem ser essenciais na redução do crescimento e da diferenciação celular do T. rangeli.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328690.pdf: 5322895 bytes, checksum: c75d85937a50f1f8681ed05a0e4a837d (MD5) Previous issue date: 2014 / O Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado amplamente distribuído nas Américas onde ocorre em simpatria com o Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Apesar da ampla distribuição geográfica e da diversidade de hospedeiros invertebrados e mamíferos, incluindo seres humanos, as informações a respeito do ciclo biológico do T. rangeli nestes hospedeiros são ainda controversas. Ainda que o genoma do T. rangeli esteja em fase de publicação, são raras as abordagens proteômicas no estudo dos sistemas biológicos, permitindo o estudo de proteínas isoladas a partir da análise do proteoma total. Desta forma, a demanda por estudos de proteômica objetivando abordar o complexo e desconhecido ciclo de vida deste parasita nos levou a avaliar neste estudo o perfil de proteínas de T. rangeli durante o processo de diferenciação celular in vitro e selecionar algumas proteínas de interesse para uma análise molecular inicial. Extratos de proteínas solúveis foram obtidos durante o processo de diferenciação celular in vitro de formas epimastigotas a tripomastigotas. Três estratégias proteômicas foram utilizadas e um total de 1.455 proteínas não redundantes de T. rangeli foram identificadas, das quais quatro foram exclusivamente identificadas por eletroforese 2DE, 724 por eletroforese 1DE e 41 através uma abordagem sem o uso de gel. Entre essas proteínas, foram selecionadas 13 para dar continuidade ao estudo e, destas, quatro apresentaram regulação na expressão durante o período de diferenciação celular e podem se tornar marcadores importantes que irão auxiliar a entender a biologia de T. rangeli e os mecanismos moleculares durante o processo de diferenciação.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli is a hemoflagelate parasite occurring in sympatry with Trypanosoma cruzi, agent of Chagas disease, in a wide area in Central and South America. Despite this sympatric distribution and the diversity of invertebrate and mammalian hosts, including humans, information about the biological cycle of T. rangeli on these hosts is still scarce and controversial. The T. rangeli genome has been sequenced and is about to be published by our group but little proteomic data is so far available to address the complex and unknown life cycle this parasite. Thus, the aim of this study was to evaluate the protein profile of T. rangeli during the in vitro cellular differentiation and select some proteins of interest for an initial molecular analysis. Soluble protein extracts were obtained from parasites during the in vitro differentiation process of epimastigotes forms to trypomastigotes. Three proteomic approaches were used and a total of 1,455 non-redundant T. rangeli proteins were identified. Among these, four were identified exclusively by 2DE electrophoresis, 724 by 1DE gel based and 41 proteins via a gelfree approach. Several proteins revealing variation on their expression profiles were selected to continue this study, among which, four showed regulation of expression during cell differentiation and may become important stage-specific proteins that could help to understand T. rangeli biology and the molecular mechanisms during the differentiation process.