Abstrate: Ras proto-oncogenes are members of the superfamily of GTP-binding proteins. Many tyrosine kinase receptors, including those for epidermal growth factor, insulin, and nerve growth factor, signal through RAS proteins. The product of members of this oncogene family (H-, K-, N-ras) is a 21 kD protein with nucleotide binding activity, involved in the transduction of information from the cell surface to the nucleus. The three RAS proteins exit in two states: a resting state in which they are bound to GDP and an active state in which they bind GTP. The most common form of mutational activation of Ras oncogenes in human tumors is through single base substations affecting either the GTP-binding of main (codons 12 and 13) or the GTPase domain (codon 61) of the protein. Thus, mutant RAS proteins result in constitutive activation of the downstream signaling cascade because their affinity for GTP is increased or their GTPase activity is decreased, so that the protein cannot return to the resting state. To investigate we have screened 89 thyroid tumor specimens, which include 8 follicular carcinomas (FC), 42 papillary carcinoma (PTC), 2 anaplastic carcinoma (AC),5 Hurthle cell adenoma (HA), 12 follicular adenoma (FA) and 20 nodular goiter (NG), for mutation in three Ras genes using PCR and automatic sequencing. Four tumors contained Ras gene mutation. Of these, three were identified among FC (37.5%), which mutation were in the codon 61 of each Ras genes. One mutation were at codon 61 of N-ras in FA specimens (8.3%). In addition, 33.7% (30/89) of specimens contain H-ras codon 27 polymorphism. In conclusion, our data indicated that the prevalence rates of Ras gene mutation were 5.8% and 2.7% in thyroid carcinoma and thyroid benign adenoma, respectively. Other environmental or genetic factors might also involved in the thyroid tumorigenesis and worth further investigation. The data were further confirmed using the combination of the PCR and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Four more cases of possible Ras mutation were detected which did not revealed by automatic sequencing , indicating that DGGE is a more sensitive method in detecting single nucleotide mutation. DGGE analysis should increase the detection rate of Ras gene mutation in our analysis.

Algumas áreas do canal de Piaçaguera, localizado na Baixada Santista, SP-Brasil, apresenta alto nível contaminação por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) entre outros contaminantes nos sedimentos. O objetivo do presente estudo foi verificar diferentes biomarcadores de exposição em bile e de efeitos genotóxicos em sangue de peixes, coletados in situ, que poderiam ser utilizados como ferramenta de monitoramento. O canal de Bertioga foi selecionado como região de referência. Embora não seja uma região sem nenhuma interferência de contaminantes, os sedimentos apresentam baixos valores para HPA, metais e atividade mutagênica. A espécie Mugil curema foi selecionada por ser freqüentemente encontrada em ambas as regiões de estudo. Observamos que os peixes coletados no canal de Piaçaguera apresentaram maior porcentagem de micronúcleos e danos ao DNA (ensaio cometa) no sangue quando comparados com a região de referência. Para o teste de micronúcleo, realizamos leituras de 1000 e 4000 células/indivíduo e não foram observadas diferenças estatísticas, sugerindo que o número de 1000 células poderia ser suficiente para gerar dados confiáveis para a espécie Mugil curema. A avaliação de mutagenicidade da bile foi realizada pelo teste Salmonella/microssoma combinado à extração de bile utilizando Blue rayon (BR) com as linhagens TA98, TA100 e YG1041 com e sem S9 (ativação metabólica). As maiores respostas mutagênicas foram observadas para os peixes coletados no canal de Piaçaguera. A mutagenicidade com a linhagem YG1041 na presença de S9 foi mais elevada quando comparado à mutagenicidade observada na ausência de S9 e também em comparação com a sua linhagem parental TA98, indicando a provável presença de compostos da classe das aminas aromáticas na bile como responsáveis pelos efeitos observados. A quantificação de metabólitos equivalentes de HPA foi realizada por HPLC/fluorescência na bile bruta e embora os resultados não se correlacionem com a mutagenicidade, altos níveis também foram encontrados para os peixes coletados no canal de Piaçaguera em comparação com Bertioga. O protocolo de amplificação do gene ras para a espécie Mugil curema foi estabelecido e os genes foram seqüenciados para verificação da presença de mutações. Não foram observadas mutações nos poucos peixes analisados e mais estudos são necessários para verificar a utilização deste biomarcador. O teste de micronúcleo, ensaio cometa e análise de mutagencidade em bile extraída por Blue rayon parecem ser ferramentas biológicas adequadas para monitoramento da qualidade ambiental de estuários contaminados. / Some areas of the Piaçaguera channel at Baixada Santista, SP, Brazil present high levels of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) among other contaminants in the sediment. The aim of the present study was to verify if biomarkers of exposure in bile and effect in blood of fishes collected in the field could be used as a monitoring tool. We selected Bertioga channel as a reference area. Although it is not a pristine area, the sediment presents low values of PAHs, metals and mutagenic activity. We selected the fish species Mugil curema, because they are frequently found in both areas during the entire year. We observed that the fish collected at the Piaçaguera channel showed a higher percentage of micronuclei and DNA damage (comet assay) in blood when compared to the Bertioga channel. The micronucleus readings were done in 1000 and 4000 cells/fish and no statistical difference was observed, suggesting that the number of 1000 cells would be sufficient to generate reliable data for the species Mugil curema , in the studied area. The mutagenicity of the bile was performed using the Salmonella/microsome assay combined with Blue rayon (BR) extraction with TA98, TA100 and YG1041 strains with and without rat liver S9. We observed that the mutagenic responses were higher in fish collected in Piaçaguera. The mutagenicity in YG1041 with S9 in fishes collected in the Piaçaguera channel was higher when compared to the mutagenicity observed in the absence of S9 and also higher than the response with the parental strain TA98. The results suggest that mutagenic polycyclic compounds, probably from the class of the aromatic amines are causing the observed effect. PAH metabolites-equivalent were also determined using HPLC/fluorescence in crude bile, and although the results did not correlate with the mutagenicity, higher levels were observed in fish collected in the Piaçaguera channel when compared to Bertioga. A protocol for amplification of the ras gene for the Mugil curema species was established and gene sequenced. No mutations were observed in the liver of the few fishes analyzed, and more studies are required to verify the utility of this biomarker in this fish. The micronuclei, comet assay and mutagenicity in bile extracted with blue rayon seem to be suitable biological tools to monitor the environmental quality of contaminated estuaries.

Algumas áreas do canal de Piaçaguera, localizado na Baixada Santista, SP-Brasil, apresenta alto nível contaminação por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) entre outros contaminantes nos sedimentos. O objetivo do presente estudo foi verificar diferentes biomarcadores de exposição em bile e de efeitos genotóxicos em sangue de peixes, coletados in situ, que poderiam ser utilizados como ferramenta de monitoramento. O canal de Bertioga foi selecionado como região de referência. Embora não seja uma região sem nenhuma interferência de contaminantes, os sedimentos apresentam baixos valores para HPA, metais e atividade mutagênica. A espécie Mugil curema foi selecionada por ser freqüentemente encontrada em ambas as regiões de estudo. Observamos que os peixes coletados no canal de Piaçaguera apresentaram maior porcentagem de micronúcleos e danos ao DNA (ensaio cometa) no sangue quando comparados com a região de referência. Para o teste de micronúcleo, realizamos leituras de 1000 e 4000 células/indivíduo e não foram observadas diferenças estatísticas, sugerindo que o número de 1000 células poderia ser suficiente para gerar dados confiáveis para a espécie Mugil curema. A avaliação de mutagenicidade da bile foi realizada pelo teste Salmonella/microssoma combinado à extração de bile utilizando Blue rayon (BR) com as linhagens TA98, TA100 e YG1041 com e sem S9 (ativação metabólica). As maiores respostas mutagênicas foram observadas para os peixes coletados no canal de Piaçaguera. A mutagenicidade com a linhagem YG1041 na presença de S9 foi mais elevada quando comparado à mutagenicidade observada na ausência de S9 e também em comparação com a sua linhagem parental TA98, indicando a provável presença de compostos da classe das aminas aromáticas na bile como responsáveis pelos efeitos observados. A quantificação de metabólitos equivalentes de HPA foi realizada por HPLC/fluorescência na bile bruta e embora os resultados não se correlacionem com a mutagenicidade, altos níveis também foram encontrados para os peixes coletados no canal de Piaçaguera em comparação com Bertioga. O protocolo de amplificação do gene ras para a espécie Mugil curema foi estabelecido e os genes foram seqüenciados para verificação da presença de mutações. Não foram observadas mutações nos poucos peixes analisados e mais estudos são necessários para verificar a utilização deste biomarcador. O teste de micronúcleo, ensaio cometa e análise de mutagencidade em bile extraída por Blue rayon parecem ser ferramentas biológicas adequadas para monitoramento da qualidade ambiental de estuários contaminados. / Some areas of the Piaçaguera channel at Baixada Santista, SP, Brazil present high levels of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) among other contaminants in the sediment. The aim of the present study was to verify if biomarkers of exposure in bile and effect in blood of fishes collected in the field could be used as a monitoring tool. We selected Bertioga channel as a reference area. Although it is not a pristine area, the sediment presents low values of PAHs, metals and mutagenic activity. We selected the fish species Mugil curema, because they are frequently found in both areas during the entire year. We observed that the fish collected at the Piaçaguera channel showed a higher percentage of micronuclei and DNA damage (comet assay) in blood when compared to the Bertioga channel. The micronucleus readings were done in 1000 and 4000 cells/fish and no statistical difference was observed, suggesting that the number of 1000 cells would be sufficient to generate reliable data for the species Mugil curema , in the studied area. The mutagenicity of the bile was performed using the Salmonella/microsome assay combined with Blue rayon (BR) extraction with TA98, TA100 and YG1041 strains with and without rat liver S9. We observed that the mutagenic responses were higher in fish collected in Piaçaguera. The mutagenicity in YG1041 with S9 in fishes collected in the Piaçaguera channel was higher when compared to the mutagenicity observed in the absence of S9 and also higher than the response with the parental strain TA98. The results suggest that mutagenic polycyclic compounds, probably from the class of the aromatic amines are causing the observed effect. PAH metabolites-equivalent were also determined using HPLC/fluorescence in crude bile, and although the results did not correlate with the mutagenicity, higher levels were observed in fish collected in the Piaçaguera channel when compared to Bertioga. A protocol for amplification of the ras gene for the Mugil curema species was established and gene sequenced. No mutations were observed in the liver of the few fishes analyzed, and more studies are required to verify the utility of this biomarker in this fish. The micronuclei, comet assay and mutagenicity in bile extracted with blue rayon seem to be suitable biological tools to monitor the environmental quality of contaminated estuaries.