Made available in DSpace on 2016-04-15T13:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 franklyn_acosta_ioc_dout_2015.pdf: 13033375 bytes, checksum: 9f1b37e297e771e874ab4f5d3f7aed83 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A transcrição dirigida pela RNA polimerase II nos tripanossomatídeos produz um RNA precursor que abriga dezenas a centenas de genes que são processados para formar unidades monocistrônicas. Os processos de trans-splicing e poliadenilação vinculados ao processamento do RNA precursor são os responsáveis pela formação dos extremos do mRNA e portanto representam pontos importantes de controle pós-transcricional e de geração de diversidade funcional em termos de regiões não traduzidas (UTRs). O genoma de T. cruzi abriga genes tanto multicópia como de poucas cópias, os quais são importantes para a interação com seus hospedeiros e para realizar processos biológicos fundamentais para a sua sobrevivência. Isto levanta questões relevantes em relação à transcrição e processamento de genes duplicados ou multicópia no T. cruzi. Para acrescentar o conhecimento sobre o processamento de genes de poucas cópias nós estudamos este processo em duas cepas de Trypanosoma cruzi: Y e clone CL-Brener Na cepa Y as formas epimastigota, amastigota e tripomastigota sanguínea da cepa Y foram estudadas usando uma abordagem baseada no pirosequencimento e em CL-Brener usamos RT-PCR, RACE, clonagem e sequenciamento pelo método de Sanger das UTRs para as formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. Os resultados indicam que a transcrição e processamento dos transcritos do locus de calmodulina nos estágios estudados de ambas cepas produz formas alternativas predominantes com 5'UTRs longas e 3'UTR curtas. Encontramos também, um marcado desequilíbrio alélico na frequência dos transcritos das cópias de calmodulina nas diferentes formas estudadas de CL-Brener. Finalmente, existe uma aparente frequência assimétrica das isoformas de calmodulina dentro de cada cópia e entre as cópias em todos os estágios de ambas cepas estudadas indicando que possivelmente o controle da abundância dos transcritos exerce um papel importante na regulação da expressão deste gene / The RNA pol II transcription in tripanosomatids produces a RNA precursor harboring ten to hundreds of genes that must be processed to produce monocistronic mRNAs. The trans-splicing and polyadenylation processing of the RNA precursor is responsibles for the mRNA ends formation, important points of post-transcriptional regulation and functional diversity around the UTRs. The T. cruzi genome harbor both multicopy and few copies genes that are important for the interaction with the parasite host and to carry out essential biological process for the T. cruzi survival. This fact rases relevant aspects about the transcription and processing of genes in T. cruzi. To increase the knowledge on the mRNA processing of genes with few copies we studied this process in two strains: Y and CL-Brener clone. We analyzed the final mRNA from the epimastigote, amastigote and blood trypomastigote of Y strain using amplicon pyrosequencing and for the CL-brener epimastigote and metacyclic stage we devised an RT-PCR and RACE to target calmodulin UTRs combined with amplicon cloning and Sanger sequencing. The results point out that the mRNA processing of the transcripts of the calmodulin locus in all T. cruzi stages from studied strains produced mostly calmodulin mRNA bearing long 5'UTR and short 3'UTR. Also, we found a remarkable allelic imbalance in the frequency of the transcripts from calmodulin copies in all stages of CL-Brener. Finally, there was an inter-copy and intra-copy asymmetric frequency of calmodulin mRNA in all stages of the T. cruzi strain studied here indicating that the control of transcript abundance may has an important role in the calmodulin gene expression regulation

Made available in DSpace on 2016-07-13T19:09:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 myllena_melo_ioc_dout_2015.pdf: 11571962 bytes, checksum: c96336caf2f321525cb5b9c9f73f9f0e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Ensaios de PCR para o diagnóstico e monitoramento da carga parasitária em pacientes acometidos pela doença de Chagas são realizados a partir de DNA recuperado de sangue periférico. Uma perspectiva seria a possibilidade do uso de soro para a detecção e quantificação de DNA de T. cruzi, aproveitando amostras coletadas para triagem sorológica em laboratórios de referência e bancos de sangue. Outra limitação é que o diagnóstico molecular com os alvos mais comumente utilizados (kDNA, DNA Satélite) não é capaz de identificar as linhagens do parasito. Tem sido relatada uma baixa sensibilidade para alguns marcadores de genotipagem de T. cruzi quando aplicados diretamente em sangue de pacientes crônicos, uma vez que são cópias únicas ou distribuídos em baixa frequência no genoma do parasito. Estudos baseados em famílias multigênicas, como as proteínas de superfície (trans-sialidases), sugerem que estas sejam capazes de reunir cepas/isolados de T. cruzi em grupos biologicamente distintos, visando sua caracterização. A presença de sítios polimórficos nas regiões não traduzidas (UTRs) dos genes de trans-sialidases (TS), além de representar uma estratégia de sobrevivência do parasito ao estresse ambiental, propicia o uso destas regiões como potenciais marcadores moleculares para tipagem de T. cruzi. Este trabalho avaliou o potencial uso do soro e do segmento 5\2019 UTR de TS de T. cruzi, em ensaios de quantificação de DNA e genotipagem do parasito, respectivamente Neste sentido, empregamos a PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex para a detecção/quantificação de T. cruzi em amostras pareadas de soro e sangue de 40 pacientes com a doença crônica. Para avaliar o uso da 5\2019 UTR de TS como marcador molecular de genotipagem, utilizamos um painel de cepas/clones de T. cruzi, representantes das seis DTUs (Unidades Discretas de Tipagem). Após amplificação do segmento contendo parte da 5\2019 UTR e uma porção da região codificante de TS das diferentes cepas/clones, e posterior sequenciamento por método capilar (SANGER), realizamos a análise composicional das sequências. Em seguida, novos iniciadores foram desenhados para os ensaios de COLD-PCR HRM (High Resolution Melting). Os resultados da qPCR revelaram sensibilidade de detecção de 95% e 97% para soro e sangue, respectivamente, e especificidade de 100% para ambos os tipos de amostras. As medianas de carga parasitária em soro e sangue, também não demonstraram diferenças significativas, sendo de 1,12 e 1,23 equivalentes parasito/mL, respectivamente, o que reproduz a baixa parasitemia observada nos pacientes com doença de Chagas crônica. A partir das análises composicionais das sequências de 5\2019 UTR de TS obtidas pelo método capilar, identificamos blocos conservados e sítios polimórficos entre as linhagens, porém não foi possível gerar assinaturas genômicas associadas à caracterização em DTUs. O sequenciamento New Generation Sequencing do segmento 5\2018 UTR de TS permitiu a caracterização das cepas/clones em seis DTUs, como demonstrado na árvore filogenética construída a partir de 4.568.225 sequências Os ensaios de COLD-PCR HRM, direcionados para diferentes seções do segmento 5\2019 UTR de TS, foram eficientes em agrupar cepas/clones em duas variantes, sugerindo uma associação com os ciclos de transmissão, virulência e evolução populacional destes parasitos. Os resultados gerados no presente estudo sugerem o uso de soro para o diagnóstico molecular da infecção pelo T. cruzi em laboratórios de referência, responsáveis pela manutenção de sorotecas, bem como demonstram o potencial discriminatório do alvo 5\2019 UTR de trans-sialidases para ser explorado em ensaios de genotipagem do parasito diretamente de amostras clínicas e biológicas, acoplado ao sequenciamento High Throughput dos produtos amplificados, como ferramenta complementar à pesquisa diagnóstica da doença de Chagas / Abstract: PCR-based assays for molecular diagnosis and to evaluate Trypanosoma cruzi load in patients with Chagas disease are usually performed with DNA recovered from peripheral blood samples. One promising approach would be the use of patients\2019 serum for the detection and quantification of T. cruzi DNA, as it would make possible to take advantage of the same samples collected for serological screening in blood banks and reference laboratories. Another limitation is that molecular diagnosis with the most common molecular targets (kDNA and Satellite DNA) is not suitable for identifying the infecting parasite strain. A low sensitivity of some T. cruzi genotyping markers has been reported, when those are applied directly to blood of chronic patients, since they are represented as a single copy or present low frequencies in the parasite genome. Studies based on multigene families, such as the surface proteins (trans-sialidase), suggested the ability of those genes to cluster strains/isolates of T. cruzi into biologically distinct groups. The presence of polymorphic sites in the untranslated regions (UTRs) of trans-sialidase genes (TS), as well as represents a parasite\2019s survival strategy to environmental stress, it promotes the use of these regions as potential molecular markers for T. cruzi typing. This study evaluated the potential use of serum and the segment 5' UTR of TS, as new approaches for DNA quantification and T. cruzi genotyping, respectively We used multiplex Real-Time PCR (qPCR) for detecting/quantifying parasites in serum and blood paired samples from 40 chronic Chagas disease patients. In order to investigate the potential use of 5' UTR of TS sequences as molecular markers for genotyping, we used a panel of T. cruzi strains/clones, representative of the six DTUs (Discrete Typing Units). Following amplification of the segment containing part of the 5' UTR and a portion of the TS coding region from different strains/clones and sequencing by capillary method (Sanger), we carried out the compositional analysis of the sequences. New primers were designed for the HRM COLD-PCR tests (High Resolution Melting). The qPCR results showed detection sensitivities of 95% and 97% for serum and blood, respectively, and a specificity of 100% for both sample types. The median of parasite load in blood and serum also showed no significant differences, with 1.12 and 1.23 parasite equivalents/mL respectively, which reproduces the low parasitemia observed in chronic Chagas disease patients. From the compositional analysis of the 5\2019 UTR of TS sequences obtained by capillary method, we identified conserved blocks and polymorphic sites, but no genomic signatures associated to the characterization into distinct DTUs were observed. New Generation Sequencing of the segment 5' UTR of TS allowed the characterization of strains/clones in six DTUs, as shown by the phylogenetic tree generated by the analysis of 4.568.225 sequences HRM COLD-PCR assays targeted to different sections of the segment 5' UTR of TS were effective for clustering the strains/clones in two variants, suggesting an association with the transmission cycles, virulence and evolution of these parasite populations. The set of evidences gathered in this study, reinforces the potential use of serum for molecular diagnosis of T. cruzi infection, in reference laboratories responsible for maintaining serum bank, as well as, indicates a discriminatory potential of 5\2019 UTR of TS, regarding the six DTUs, to be explored in genotyping assays directly from clinical and biological samples, associated to High Throughput sequencing of amplicons, as a complementary tool for diagnostic researches in Chagas disease

Orientador: Sérgio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Urioste_EduardoArcanjo_M.pdf: 1274507 bytes, checksum: 0f7136d4dabaf0e810ad2bdf1b2ee815 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Estima-se que cada indivíduo carregue cerca de 120 a 430 variantes raras em regiões UTRs (Abecasis et al, 2012). Apesar da tolerância a variação na região 5' UTR, a patofisiologia de várias doenças está ligada a mutações na mesma (Cazzola & Skoda, 2000; Reynolds, 2002; Chatterjee & Pal, 2009; Wethmar et al 2010), sendo necessário o entendimento a determinação dos mecanismos regulatórios. O objetivo deste trabalho é descobrir assinaturas genéticas encontradas no contexto genômico de mutações pontuais de região 5' UTR que permitam prever o impacto funcional de outras variações pontuais na mesma região. As mutações, causadora de doença, foram selecionadas do banco de dados do Human Gene Mutation Database (HGMD) (Stenson et al, 2008); e os polimorfismos, de impacto funcional desconhecido, foram obtidos no banco de dados NHLBI Grand Opportunity Exome Sequencing Project (ESP), sendo originados do trabalho de Tenessen et al (2012). No total foram utilizadas 235 mutações e 21.542 polimorfismos. Para as variações foram calculados parâmetros de variação da estabilidade da estrutura secundária do contexto das variações (??Gfolding), presença de sítios de ligação de fatores de transcrição (JASPAR), tipo de variação (transição/transversão, tipoV), distância do início da sequência codificante (DiSC), distância do início de transcrição (DiTr) e conservação filogenética por distância de Levenshtein do contexto (Lev). A estatística foi calculada pelos testes de Wilcoxon e Binomial. A partir destes foram gerados modelos de regressão logísticos analisados através de curva ROC. Os parâmetros ??Gfolding máximo, tipoV, DiSC, e Lev permitiram a distinção significativa (? = 0,05) entres os polimorfismos e as mutações permitindo modelos explicativos, mas incompletos (área da Curva ROC 0, 772). ??Gfolding max. indicou uma relação entre as mutações e entre estruturas secundárias mais estáveis geradas pelas mesmas. Os parâmetros Lev e tipoV sugerem a origem das mutações como resultantes de hotspots. O parâmetro DiSC indicou regiões com provável funcionalidade. Apesar de não ter sido possível estabelecer relação causal entre os parâmetros e o impacto funcional das variações, encontrou-se correlações importantes / Abstract: It is estimated that each individual carries about 120 to 430 rare variante in the UTR regions (Abecasis et al, 2012). Despite the increased tolerance towards variations in 5' UTR region, the patho-phisiology of several diseases is linked to its mutations (Cazzola & Skoda, 2000; Reynolds, 2002; Chatterjee & Pal, 2009; Wethmar et al 2010). Therefore it is necessary the understanding and the determination of the regulatory elements. The objective of this study is the discovery of genetic signatures found in the genomic context of disease causing point mutations in 5' UTR, thus allowing the prediction of the functional impact of other point variations in the same region. The disease causing mutations were selected from Human Gene Mutation Database (HGMD) (Stenson et al, 2008). The polymorphisms of unknown functional impact were obtained from the NHLBI Grand Opportunity Exome Sequencing Project (ESP), originated from the work of Tenessen et al (2012). A total of 235 mutations and 21,542 polymorphisms were used. For each variation, parameters related with the differences of the variation's context folding stability (??Gfolding), presence of transcription factor binding sites (JASPAR), type of variation (transition/transversion, tipoV), distance from coding sequence start (DiSC), distance from transcription start site (DiTr) and phylogenetic conservations by distance of Levenshtein from wild type to variant context (Lev). The statistical test was done by Wilcoxon and Binomial. Logistical regressions models were generated from the parameters and its performance was evaluated by a ROC curve. The parameters maximal ??Gfolding, tipoV, logarithm of DiSC and Lev allowed a significant distinction (? = 0,05) between the groups, generating models of reasonable explanation but incomplete (area under the ROC curve 0,772). Maximal ??Gfolding showed a relationship between mutations and stable secondary structures generated by them. Lev and tipoV suggested the origin of the mutation from hotspots. The DiSC parameter identified regions with possible functionality. While it was not possible to establish any clear causal relationship between the parameters and the functional impact of the variations, important correlations were found / Mestrado / Histologia e Embriologia / Mestre em Biologia Buco-Dental