Orientador: Lucia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:44:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grade_CarlaVermeulenCarvalho_M.pdf: 54304678 bytes, checksum: 869f67d6a836e256bbd7ee9e15980659 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteina Miostatina (tambem conhecida como GDF8) e um membro da superfamilia de crescimento e diferenciacao ß (TGF- ß) e e expressa quase que exclusivamente em musculatura esqueletica, tanto no embriao em desenvolvimento quanto no individuo adulto, onde circula livre pela corrente sanguinea. A Miostatina foi inicialmente identificada em 1997 por MCPHERRON et al. e, desde entao, muitos estudos tem demonstrado seu papel essencial na regulacao do desenvolvimento de musculatura esqueletica de aves e mamiferos. O nocaute genico da Miostatina causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, resultando em musculos individuais ate duas vezes maiores do que em animais selvagens. Isso demonstra que a Miostatina e um regulador negativo da deposicao de musculatura esqueletica. A estrutura e a funcao desta proteina sao conservadas em diversas especies, incluindo humanos, onde os niveis de Miostatina circulante no sangue se encontram aumentados durante condicoes de distrofia e na caquexia que acompanha alguns tipos de cancer e a AIDS. Um melhor entendimento dos mecanismos que regem a expressao da Miostatina e essencial para o desenvolvimento de estrategias que possam regular sua atividade durante tais condicoes. No presente trabalho, nos identificamos, com o uso de ferramentas de Bioinformatica, elementos cisregulatorios putativos (promotor e enhancers) que possivelmente regulam a transcricao do gene da Miostatina. Inicialmente foi realizada uma comparacao dos loci do GDF8, incluindo as regioes intergenicas adjacentes, provenientes dos genomas de Humano, Camundongo e Galinha. Essa analise revelou a presenca de diferentes regioes evolutivamente conservadas (RECs) adjacentes a sequencia codificadora desta proteina, sete downstream e uma upstream ao gene. Por terem sido mantidas relativamente conservadas ao longo da evolucao, essas regioes supostamente possuem um papel funcional, possivelmente como elementos cis-regulatorios do gene da Miostatina. Em seguida, com o intuito de entender as funcoes que cada uma dessas regioes possa estar exercendo sobre a regulacao da atividade transcricional do gene da Miostatina, foi realizada uma busca por sitios de ligacao para fatores transcricionais que tenham sido conservados evolutivamente nessas RECs. Muitos sitios conservados foram observados nas sete RECs downstream ao gene da Miostatina, entre eles estao sitios para fatores relacionados ao desenvolvimento de musculatura esqueletica (MyoD, Myogenin, E47, EN1), membros (Pax3, Tbx5) e coracao (Nkx2.5, Pitx2). Juntos, esses dados sugerem uma regulacao modular do gene da Miostatina durante a embriogenese dos vertebrados. A unica REC localizada upstream ao GDF8 representa o promotor minimo putativo deste gene. Essa hipotese e reforcada pela presenca de um sitio de ligacao conservado para a Proteina de Ligacao ao sitio TATA. Com o intuito de validar as hipoteses formuladas com base nas analises de Bioinformatica, no presente trabalho buscamos caracterizar funcionalmente o promotor minimo do gene da Miostatina. Para tanto, a regiao do promotor minimo foi inicialmente clonada em um vetor que nao contem promotor e possui como gene reporter o GFP. Essa construcao de expressao foi entao testada atraves de experimentos de eletroporacao em embrioes de galinha in ovo. A analise dos embrioes eletroporados revelou que a regiao de DNA elegida para as analises funcionais e capaz de dirigir a transcricao do gene reporter, indicando que ela corresponde ao promotor minimo do gene da Miostatina. Alem do sitio TATA, ha, na regiao do promotor, diversos sitios conservados para a ligacao de proteinas envolvidas na via de sinalizacao mediada por cAMP (CREB, ATF, NFY). Esse achado esta de acordo com estudos recentes que demonstram o envolvimento do cAMP na regulacao dos fatores miogenicos Myf5 e MyoD, bem como de Pax3, sugerindo que a atividade do gene da Miostatina tambem possa estar sendo regulada por essa via de sinalizacao. Outras regioes do genoma humano que possuem arquitetura semelhante a observada no promotor da Miostatina foram identificadas, demonstrando que outros genes podem estar sob influencia da mesma via de sinalizacao que regula a atividade do promotor da Miostatina, dentre eles genes envolvidos na miogenese e neurogenese. / Abstract: The Myostatin protein (also known as GDF8) is a member of the transforming growth factor-ß (TGF-ß) superfamily and is expressed almost exclusively in skeletal muscle, both in the embryo and in the adult, where the protein circulates in the blood flow. It was initially identified in 1997 by MCPHERRON et al., and since then many studies have been demonstrating its essential role in the regulation of the development of skeletal muscle from birds and mammals. The knockout of the Myostatin gene causes both hyperplasia and hypertrophy of the skeletal muscle fibers, resulting in muscles twice as big as the wildtype ones, thus showing that Myostatin is a negative regulator of skeletal muscle deposition. The GDF8 structure and function is conserved in many species, including humans where the Myostatin levels are increased during dystrophy conditions and in the cachexia that accompanies some types of cancer and AIDS. A better understanding of the mechanisms that rule the Myostatin expression is essential for the development of strategies that might regulate its activity during such conditions. In this research, we have identified, with the use of bioinformatic tools, the cis-regulatory elements (promoter and enhancers) that regulate the Myostatin gene transcription. We compared the GDF8 loci from human, chicken and mouse and found different evolutionary conserved regions (ECRs), adjacent to the GDF8 coding sequence. Because these intergenic sequences remained relatively conserved throughout evolution, they supposedly have a functional role, possibly as cis-regulatory elements for the Myostatin gene. Our analyses revealed the presence of seven possible enhancers downstream of the GDF8 gene and one conserved region upstream of it. In order to understand the role these regions might have in the regulation of Myostatin's transcription activity, we searched for binding sites that were also evolutionary conserved. Many conserved binding sites were observed in the RECs downstream to the Myostatin gene, and among them are sites for factors related to the development of the skeletal muscle (MyoD, Myogenin, E47, EN1), limbs (Pax3, Tbx5) and heart (Nkx2.5, AREB6, Pitx2). Together, these data suggest a modular regulation of the Myostatin gene during vertebrates' embryogenesis. The only REC observed upstream of the Myostatin locus represents the putative basal gene promoter. This hypothesis is strengthened by the presence of a binding site for the Tata Binding Protein conserved for the studied species. In this research, we aimed at functionally characterizing the Myostatin gene basal promoter. For that purpose, we cloned the studied region in a promoterless vector, which contains GFP as a reporter gene. This expression construct was then tested through in ovo electroporation assays. The analysis of the electroporated embryos revealed that the cloned DNA region is capable of driving the transcription of the reporter gene, which indicates that it truly corresponds to the basal promoter of the Myostatin gene. Moreover, there are conserved binding sites for the CREB and ATF1 transcription factors in the basal promoter, which are activated by the cAMP signaling path. This finding is in agreement with recent studies that demonstrate the involvement of cAMP in the regulation of the myogenic factors Myf5 and MyoD, as well as Pax3, thus suggesting that the activity of the Myostatin gene might be under the influence of this signaling path. Other regions of the human genome that have a similar architecture to the one observed in the Myostatin promoter were identified. This demonstrates that other genes are possibly under the influence of the same signaling path regulating the activity of the Myostatin promoter, among them genes involved in myogenesis and neurogenesis. / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

O atual momento da globalizacao pode ser caracterizado pela integracao de mercados e economias, cujas operacoes complexas e o grande volume de informacoes demandam regras e procedimentos proprios e especializados. Com fraudes bilionarias e crises que se espalham sem reconhecer fronteiras, o direito penal expande-se e passa a ser considerado como uma forma de evitar a repeticao destes erros. Cresce, assim, a demanda por uma flexibilizacao dos ordenamentos nacionais e um agir conjunto de Estados e empresas. O alinhamento destas condutas resulta em medidas preventivas estabelecidas por diferentes marcos regulatorios, que estabelecem a importancia de avaliacoes de riscos, medidas de governanca corporativa e programas de compliance na implementacao de uma nova cultura de etica e transparencia nos negocios. / The present time of globalization can be described by a market and economic integration, which is made up by complex operations and a large amount of information that demand specific and specialized rules and procedures. Considering billionaire frauds and crisis spread worldwide, the criminal law expands and is regarded as the way to avoid repetition of this kind of error. As a result, grows the demand for a flexibilization of national legal orders and for a joint action between States and companies. The alignment of conducts results in preventive measures provided by different regulatory landmarks that determine the importance of risk management, corporate governance and compliance in the implementation of a new culture of ethics and transparency in business.

O atual momento da globalizacao pode ser caracterizado pela integracao de mercados e economias, cujas operacoes complexas e o grande volume de informacoes demandam regras e procedimentos proprios e especializados. Com fraudes bilionarias e crises que se espalham sem reconhecer fronteiras, o direito penal expande-se e passa a ser considerado como uma forma de evitar a repeticao destes erros. Cresce, assim, a demanda por uma flexibilizacao dos ordenamentos nacionais e um agir conjunto de Estados e empresas. O alinhamento destas condutas resulta em medidas preventivas estabelecidas por diferentes marcos regulatorios, que estabelecem a importancia de avaliacoes de riscos, medidas de governanca corporativa e programas de compliance na implementacao de uma nova cultura de etica e transparencia nos negocios. / The present time of globalization can be described by a market and economic integration, which is made up by complex operations and a large amount of information that demand specific and specialized rules and procedures. Considering billionaire frauds and crisis spread worldwide, the criminal law expands and is regarded as the way to avoid repetition of this kind of error. As a result, grows the demand for a flexibilization of national legal orders and for a joint action between States and companies. The alignment of conducts results in preventive measures provided by different regulatory landmarks that determine the importance of risk management, corporate governance and compliance in the implementation of a new culture of ethics and transparency in business.

In November 2014 the Fourth Court for Administrative Matters ruled that OSINERGMIN give effect to Resolution of Disputes Transitional Administrative Chamber of the Superior Court of Lima, which established the dealership ENERSUR Electricity generation has no responsibility for payment the use of a secondary power transmission system Chilca - Independencia, contrary to Law 28832 which ensures the efficient development of electricity generation.The Judiciary based its decision on an incorrect interpretation of the concession contract Electricity Transmission Red de Energía del Peru (REP) with the State to apply to ENERSUR. The decision of the judiciary is illegal, creates anti-technical precedent, violating the regulatory principles of independence, neutrality, competition, non-discrimination and harms millions of users to increase electricity tariffs for compliance. / En noviembre del 2014, el Cuarto Juzgado Especializado en lo Contencioso Administrativo dispuso que OSINERGMIN dé cumplimiento a la Resolución de la Sala Contencioso Administrativa Transitoria de la Corte Superior de Justicia de Lima, que estableció que el concesionario de Generación eléctrica ENERSUR S.A. no tiene responsabilidad de pago por el uso de un sistema secundario de transmisión1 eléctrica Chilca - Independencia, contraviniendo la Ley 28832 que asegura el desarrollo eficiente de la generación eléctrica. El Poder Judicial sustentó su decisión en una errada interpretación del contrato de la concesionaria de Transmisión Eléctrica Red de Energía del Perú (REP) con el Estado para aplicarla a ENERSUR S.A.Dicha decisión del poder judicial es ilegal, crea precedentes antitécnicos, viola los principios regulatorios de autonomía, neutralidad, libre competencia, no discriminación y perjudica a millones de usuarios al incrementar tarifas eléctricas para su cumplimiento.