Submitted by Luiza Maria Pereira de Oliveira (luiza.oliveira@ufpe.br) on 2015-05-19T15:06:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Aline Isabel da Silva.pdf: 2135927 bytes, checksum: 5cbdcafcdb05d7a7c3cecd90489e9ad6 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T15:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Aline Isabel da Silva.pdf: 2135927 bytes, checksum: 5cbdcafcdb05d7a7c3cecd90489e9ad6 (MD5) Previous issue date: 2014-12-12 / Os neurônios serotoninérgicos, presentes no cérebro desde o início do desenvolvimento, estabelece diversos e complexos fenótipos celulares e interações neurais dentro da arquitetura dinâmica do cérebro. É evidente que o sistema serotoninérgico e suas propriedades plásticas sejam cruciais para a capacidade do cérebro de se integrar adequadamente com os órgãos periféricos do corpo bem como, com o ambiente externo. Neste sentido, estudos experimentais mostram que a super estimulação ou depressão dos sistemas de neurotransmissores, durante períodos críticos do desenvolvimento, resulta em alterações de componentes cerebrais e que o desenvolvimento do sistema serotoninérgico poderá ter prejuízos permanentes. No entanto, ainda são escassos os estudos que associem essas alterações do sistema serotoninergico com o desequilíbrio energético e o controle de peso corporal. Neste trabalho avaliamos os efeitos crônicos da utilização de inibidor seletivo de recaptação da serotonina sobre o controle do balanço energético e da bioenergética mitocondrial em tecidos central e periféricos de ratos. Em nosso estudo observamos que o tratamento com fluoxetina (grupo Fx) promoveu uma redução no ganho de peso, associado a um menor percentual (25%) de massa gorda, mas nenhuma diferença na ingestão de alimentos na lactação e pós desmame. Não observamos diferenças entre os grupos nas avaliações de medidas basais da atividade locomotora livre e temperatura corporal. Porém, após estímulo térmico (-15ºC) observamos que o grupo fluoxetina perdeu 30% menos calor quando comparado ao grupo controle. Avaliando a bioenergética mitocondrial no hipotálamo, músculo extensor longo dos dedos e tecido adiposo marrom observamos um aumento do consumo de oxigênio, redução da produção das espécies reativas de oxigênio e nenhuma indução de estresse oxidativo em todos os tecidos estudados. Adicionado à esses resultados, no tecido adiposo marrom do grupo fluoxetina observamos um retorno da respiração mitocondrial aos níveis similares ao grupo controle após adição de GDP (inibidor de proteínas desacopladoras-UCP), como também um aumento de 23% na expressão da proteina UCP-1. De forma geral, nossos resultados sugerem que a exposição precoce à fluoxetina reduz o ganho de peso associado a uma modulação positiva da função mitocondrial, o que possivelmente reduziria o risco para o aparecimento e desenvolvimento de doenças na vida adulta.

O Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América Latina. Este fungo é termodimórfico vivendo na forma de micélio em temperatura ambiente (25ºC) e sob a forma de levedura entre 35 e 37ºC. Neste trabalho identificamos e estudamos 15 novos genes de P. brasiliensis envolvidos na expressão do complexo da citocromo c oxidase mitocondrial (COX). Os genes PbCOX6, PbCOX17, PbCOX19 e PbOXA1 são capazes de substituir a função de seus homólogos nos respectivos mutantes de S. cerevisiae. Os genes analisados são modulados durante o processo de transição morfológica tanto de micélio para levedura quanto de levedura para micélio, evidenciando a importância dos genes relacionados á respiração celular para o estabelecimento da patogenicidade do fungo. Análise da estrutura genômica destes genes indica a presença de introns e evidências de processamento alternativo dos genes. Demonstou-se a produção de compostos bioativos sideróferos em P. brasiliensis sendo detectada sua secreção em meios sólidos e líquidos. / Paracoccidioides brasiliensis is the ethologic agent of the paracoccioidomycose, a systemic mycosis prevalent in Latin American. This is a thermo dimorphic fungus living in the mycelium form at room temperature (25ºC) and in the yeast form between 35 ºC e 37 ºC. In this work we identified and study fifteen (15) new P. brasiliensis genes involved in the mitochondrial cytochrome c oxidase expression (COX). The genes PbCOX6, PbCOX17, PbCOX19 e PbOXA1 were able to functionally replace its homologues in the respective S. cerevisiae null mutant. All P. brasiliensis genes analyzed have their expression modulated during the morphologic transition from mycelium to yeast as well as from yeast to mycelium. This observation highlighted the importance of the respiration related genes in the fungus pathogenicity establishment. Genomic structure analyzes of these genes confirmed introns presence as well as evidenced the alternative splicing occurrence. It was demonstrated bioactive compounds siderofore production in P. brasiliensis been detected siderofore secretion in the solids and liquid medium.

A mitocôndria é um componente essencial para a célula eucariótica, sendo que mutações que comprometam seu funcionamento podem causar as doenças mitocondriais. Estudos a respeito da biogênese mitocondrial para compreender seu funcionamento são importantes para que seja possível elaborar novas formas de tratamento. Saccharomyces cerevisiae é considerada o melhor modelo de estudo de biogênese mitocondrial. Neste trabalho, estudamos o gene nuclear MSC6, de S. cerevisiae, que foi capaz de suprimir a mutação dominante produzida no gene HER2/QRS1, um gene essencial no processo de tradução mitocondrial. A proteína codificada por MSC6 não tinha função conhecida. Verificamos sua presença na matriz mitocondrial, e que a sua ausência prejudica o processo respiratório. Também verificamos uma possível interação de Msc6p com Fmt1p, uma enzima envolvida no início do processo de tradução mitocondrial. Ficou clara a participação de Msc6p no processo traducional mitocondrial, mas novos estudos serão necessários para determinar sua função específica. / Mitochondria is necessary in many cellular processes, therefore, compromised mutations of its operation can cause severe damage to the cell, known as mitochondrial disorders. Thus is necessary the realization of mitochondrial biogenesis studies in order to fully understand its functioning in health and disease. Mitochondria biogenesis studies are favored in Saccharomyces cerevisiae. In this work, we have studied the MSC6 nuclear gene of S. cerevisiae that was able to suppress the HER2/QRS1 dominant mutant, another essential gene for the mitochondrial translation process. Msc6p has a PPR protein motif likely associated to RNA binding but with unknown function. We discovered that Msc6p is localized in the mitochondrial matrix, also that disruption of MSC6 implies in respiratory. We also find a possible interaction between Msc6p and Fmt1p, an enzyme required for mitochondrial translation initiation. In conclusion, is clear the role of MSC6 in the mitochondrial translational process, but further studies are required to indicate the specific function of Msc6p.

O Paracoccidioides brasiliensis é agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica prevalente na América Latina. Este fungo é termodimórfico vivendo na forma de micélio em temperatura ambiente (25ºC) e sob a forma de levedura entre 35 e 37ºC. Neste trabalho identificamos e estudamos 15 novos genes de P. brasiliensis envolvidos na expressão do complexo da citocromo c oxidase mitocondrial (COX). Os genes PbCOX6, PbCOX17, PbCOX19 e PbOXA1 são capazes de substituir a função de seus homólogos nos respectivos mutantes de S. cerevisiae. Os genes analisados são modulados durante o processo de transição morfológica tanto de micélio para levedura quanto de levedura para micélio, evidenciando a importância dos genes relacionados á respiração celular para o estabelecimento da patogenicidade do fungo. Análise da estrutura genômica destes genes indica a presença de introns e evidências de processamento alternativo dos genes. Demonstou-se a produção de compostos bioativos sideróferos em P. brasiliensis sendo detectada sua secreção em meios sólidos e líquidos. / Paracoccidioides brasiliensis is the ethologic agent of the paracoccioidomycose, a systemic mycosis prevalent in Latin American. This is a thermo dimorphic fungus living in the mycelium form at room temperature (25ºC) and in the yeast form between 35 ºC e 37 ºC. In this work we identified and study fifteen (15) new P. brasiliensis genes involved in the mitochondrial cytochrome c oxidase expression (COX). The genes PbCOX6, PbCOX17, PbCOX19 e PbOXA1 were able to functionally replace its homologues in the respective S. cerevisiae null mutant. All P. brasiliensis genes analyzed have their expression modulated during the morphologic transition from mycelium to yeast as well as from yeast to mycelium. This observation highlighted the importance of the respiration related genes in the fungus pathogenicity establishment. Genomic structure analyzes of these genes confirmed introns presence as well as evidenced the alternative splicing occurrence. It was demonstrated bioactive compounds siderofore production in P. brasiliensis been detected siderofore secretion in the solids and liquid medium.

A mitocôndria é um componente essencial para a célula eucariótica, sendo que mutações que comprometam seu funcionamento podem causar as doenças mitocondriais. Estudos a respeito da biogênese mitocondrial para compreender seu funcionamento são importantes para que seja possível elaborar novas formas de tratamento. Saccharomyces cerevisiae é considerada o melhor modelo de estudo de biogênese mitocondrial. Neste trabalho, estudamos o gene nuclear MSC6, de S. cerevisiae, que foi capaz de suprimir a mutação dominante produzida no gene HER2/QRS1, um gene essencial no processo de tradução mitocondrial. A proteína codificada por MSC6 não tinha função conhecida. Verificamos sua presença na matriz mitocondrial, e que a sua ausência prejudica o processo respiratório. Também verificamos uma possível interação de Msc6p com Fmt1p, uma enzima envolvida no início do processo de tradução mitocondrial. Ficou clara a participação de Msc6p no processo traducional mitocondrial, mas novos estudos serão necessários para determinar sua função específica. / Mitochondria is necessary in many cellular processes, therefore, compromised mutations of its operation can cause severe damage to the cell, known as mitochondrial disorders. Thus is necessary the realization of mitochondrial biogenesis studies in order to fully understand its functioning in health and disease. Mitochondria biogenesis studies are favored in Saccharomyces cerevisiae. In this work, we have studied the MSC6 nuclear gene of S. cerevisiae that was able to suppress the HER2/QRS1 dominant mutant, another essential gene for the mitochondrial translation process. Msc6p has a PPR protein motif likely associated to RNA binding but with unknown function. We discovered that Msc6p is localized in the mitochondrial matrix, also that disruption of MSC6 implies in respiratory. We also find a possible interaction between Msc6p and Fmt1p, an enzyme required for mitochondrial translation initiation. In conclusion, is clear the role of MSC6 in the mitochondrial translational process, but further studies are required to indicate the specific function of Msc6p.

Mutantes respiratórios de Saccharomyces cerevisiae podem apresentar uma ampla variedade de instabilidade do mtDNA. Nós analisamos diferentes classes de mutantes e observamos uma elevada instabilidade nos mutantes que não possuem a coenzima Q (CoQ) funcional. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos das alterações no estado redox da coenzima Q sobre a estabilidade do mtDNA de diferentes linhagens de S. cerevisiae. No mutante <font face=\"Symbol\">Dcoq10, que sintetiza CoQ não funcional, a inativação das NADH desidrogenases individuais Ndi1p e Nde1p, resultou numa menor instabilidade do mtDNA, acompanhada por uma diminuição na taxa de liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Por outro lado, a super-expressão de Nde1p aumentou a instabilidade do mutante <font face=\"Symbol\">Dcoq10. A inativação das NADH desidrogenases na linhagem <font face=\"Symbol\">Dcoq4, deficiente na síntese da CoQ, não reduziu a instabilidade do mtDNA. Juntos, os resultados indicam que alterações no estado de oxido-redução da coenzima Q influenciam a estabilidade do mtDNA, provavelmente através da produção de espécies reativas de oxigênio. / Saccharomyces cerevisiae respiratory mutants can show a wide range of mtDNA instability. We analyze different classes of mutants and observed a higher instability among mutants lacking a functional coenzyme Q (CoQ). The aim of this study was to evaluate the effects of alterations in the redox state of coenzyme Q on the stability of mtDNA mitochondrial in different strains of Saccharomyces cerevisiae. In <font face=\"Symbol\">Dcoq10 mutant, which synthesizes CoQ nonfunctional, inactivation of individual NADH dehydrogenases Ndi1p Nde1p has shown a decreased mtDNA instability, which was accompanied by a decrement in the rate of hydrogen peroxide (H2O2) release. Moreover, overexpression of Nde1p increased instability <font face=\"Symbol\">Dcoq10 mutant. The inactivation of individual NADH dehydrogenases in <font face=\"Symbol\">Dcoq4 strain which is deficient in the synthesis of CoQ, did not reduce the instability of the mtDNA. All the results indicate that changes in the redox state of coenzyme Q influence the stability of mtDNA, probably by the production of reactive oxygen species.

A velocidade específica de respiração (QO2) é um parâmetro fundamental para entender-se o metabolismo e o estado fisiológico celular, fornecendo informações úteis para o processo e controle em biorreatores. Neste trabalho, cultivou-se diferentes células de insetos em ambiente controlado medindo-se o QO2 e concentração crítica de oxigênio (Ccrít). Foram utilizadas nos ensaios células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) não infectadas e células de Drosophila melanogaster (S2) selvagem e recombinantes, utilizadas na expressão de diferentes proteínas. Todas as experiências foram realizadas em biorreator Inceltech com volume de trabalho de 1L, mantido a temperatura de 28ºC, agitação de 100 rpm e oxigênio dissolvido (OD) a 40% da saturação de ar, com difusão por membrana de silicone com mistura gasosa (O2 e N2) e vazão gasosa constante. Foi utilizado meio de cultura Sf900II sem soro fetal bovino. O QO2 foi medido pelo método dinâmico e pelo balanço de oxigênio na fase líquida. Neste trabalho foi implementado um novo processo durante o método dinâmico para interromper completamente a transferência gasosa durante a execução deste método. Implementou-se também uma metodologia para medição de Ccrít. Chegou-se a concentrações máximas celulares (Xm), velocidades máximas específicas de respiração (QO2) na fase exponencial e Ccrít, conforme segue: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfectadas para expressão de GPV): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfectadas para expressão de EGFP): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfectadas para expressão de HBsAg): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. Conclui-se que as linhagens selvagens e transfectadas de S2 possuem entre si uma atividade respiratória diferente e também que as novas metodologias implantadas verificaram-se satisfatoriamente. / Specific respiration rate (QO2) is a key parameter to understand cell metabolism and physiological state, providing useful information for process supervision and control. In this work, we cultivated different insect cells in a very controlled environment, being able to measure QO2 and critical oxygen concentration (Ccrit). Wild Spodoptera frugiperda (Sf9) and wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells (able to produce different proteins) were used. All experiments were performed in 1-liter working volume Inceltech bioreactor, maintaining temperature controlled at 28ºC, agitation rate at 100 rpm, and dissolved oxygen (DO) at 40% of air saturation, through membrane diffusion of mixed gases (O2 and N2) at constant total flow rate. SF900II serum free medium was used. QO2 was measured through dynamic method and oxygen mass balance in the liquid phase. In this work a new process was implemented during the dynamic method to interrupt completely the oxygen transfer during the execution of this method. It was also implemented a methodology for measurement of Ccrít (determined when DO reduces its decay rate, without oxygen transfer). Maximum cell concentration (Xm), maximum specific respiration rate (QO2) in the exponential phase and Ccrít were reached, as follows: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfected for GPV expression): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfected for EGFP expression): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfected for HbsAg expression): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. From these results, it can be concluded that the studied cell lines have different respiration activity and the new developed methodologies behave satisfactorily.

A velocidade específica de respiração (QO2) é um parâmetro fundamental para entender-se o metabolismo e o estado fisiológico celular, fornecendo informações úteis para o processo e controle em biorreatores. Neste trabalho, cultivou-se diferentes células de insetos em ambiente controlado medindo-se o QO2 e concentração crítica de oxigênio (Ccrít). Foram utilizadas nos ensaios células de insetos Spodoptera frugiperda (Sf9) não infectadas e células de Drosophila melanogaster (S2) selvagem e recombinantes, utilizadas na expressão de diferentes proteínas. Todas as experiências foram realizadas em biorreator Inceltech com volume de trabalho de 1L, mantido a temperatura de 28ºC, agitação de 100 rpm e oxigênio dissolvido (OD) a 40% da saturação de ar, com difusão por membrana de silicone com mistura gasosa (O2 e N2) e vazão gasosa constante. Foi utilizado meio de cultura Sf900II sem soro fetal bovino. O QO2 foi medido pelo método dinâmico e pelo balanço de oxigênio na fase líquida. Neste trabalho foi implementado um novo processo durante o método dinâmico para interromper completamente a transferência gasosa durante a execução deste método. Implementou-se também uma metodologia para medição de Ccrít. Chegou-se a concentrações máximas celulares (Xm), velocidades máximas específicas de respiração (QO2) na fase exponencial e Ccrít, conforme segue: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfectadas para expressão de GPV): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfectadas para expressão de EGFP): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfectadas para expressão de HBsAg): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. Conclui-se que as linhagens selvagens e transfectadas de S2 possuem entre si uma atividade respiratória diferente e também que as novas metodologias implantadas verificaram-se satisfatoriamente. / Specific respiration rate (QO2) is a key parameter to understand cell metabolism and physiological state, providing useful information for process supervision and control. In this work, we cultivated different insect cells in a very controlled environment, being able to measure QO2 and critical oxygen concentration (Ccrit). Wild Spodoptera frugiperda (Sf9) and wild and transfected Drosophila melanogaster S2 cells (able to produce different proteins) were used. All experiments were performed in 1-liter working volume Inceltech bioreactor, maintaining temperature controlled at 28ºC, agitation rate at 100 rpm, and dissolved oxygen (DO) at 40% of air saturation, through membrane diffusion of mixed gases (O2 and N2) at constant total flow rate. SF900II serum free medium was used. QO2 was measured through dynamic method and oxygen mass balance in the liquid phase. In this work a new process was implemented during the dynamic method to interrupt completely the oxygen transfer during the execution of this method. It was also implemented a methodology for measurement of Ccrít (determined when DO reduces its decay rate, without oxygen transfer). Maximum cell concentration (Xm), maximum specific respiration rate (QO2) in the exponential phase and Ccrít were reached, as follows: 1) Sf9 (ATCC 1711): Xm - 10,7.106 cel/mL; QO2 - 74,7.10-18 molO2/(cel.s); 2) S2 (Invitrogen): Xm - 51,2.106 cel/mL; QO2 - 3,4.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 3) S2AcGPV2 (transfected for GPV expression): Xm - 26,6.106 cel/mL; QO2 -16,0.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 10%; 4) S2MtEGFP (transfected for EGFP expression): Xm - 17,8.106 cel/mL; QO2 - 25,8.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 5%; 5) S2AcHBsAgHy (transfected for HbsAg expression): Xm - 16,6.106 cel/mL; QO2 -33,6.10-18 molO2/(cel.s); Ccrít - 12%. From these results, it can be concluded that the studied cell lines have different respiration activity and the new developed methodologies behave satisfactorily.

Mutantes respiratórios de Saccharomyces cerevisiae podem apresentar uma ampla variedade de instabilidade do mtDNA. Nós analisamos diferentes classes de mutantes e observamos uma elevada instabilidade nos mutantes que não possuem a coenzima Q (CoQ) funcional. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos das alterações no estado redox da coenzima Q sobre a estabilidade do mtDNA de diferentes linhagens de S. cerevisiae. No mutante <font face=\"Symbol\">Dcoq10, que sintetiza CoQ não funcional, a inativação das NADH desidrogenases individuais Ndi1p e Nde1p, resultou numa menor instabilidade do mtDNA, acompanhada por uma diminuição na taxa de liberação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Por outro lado, a super-expressão de Nde1p aumentou a instabilidade do mutante <font face=\"Symbol\">Dcoq10. A inativação das NADH desidrogenases na linhagem <font face=\"Symbol\">Dcoq4, deficiente na síntese da CoQ, não reduziu a instabilidade do mtDNA. Juntos, os resultados indicam que alterações no estado de oxido-redução da coenzima Q influenciam a estabilidade do mtDNA, provavelmente através da produção de espécies reativas de oxigênio. / Saccharomyces cerevisiae respiratory mutants can show a wide range of mtDNA instability. We analyze different classes of mutants and observed a higher instability among mutants lacking a functional coenzyme Q (CoQ). The aim of this study was to evaluate the effects of alterations in the redox state of coenzyme Q on the stability of mtDNA mitochondrial in different strains of Saccharomyces cerevisiae. In <font face=\"Symbol\">Dcoq10 mutant, which synthesizes CoQ nonfunctional, inactivation of individual NADH dehydrogenases Ndi1p Nde1p has shown a decreased mtDNA instability, which was accompanied by a decrement in the rate of hydrogen peroxide (H2O2) release. Moreover, overexpression of Nde1p increased instability <font face=\"Symbol\">Dcoq10 mutant. The inactivation of individual NADH dehydrogenases in <font face=\"Symbol\">Dcoq4 strain which is deficient in the synthesis of CoQ, did not reduce the instability of the mtDNA. All the results indicate that changes in the redox state of coenzyme Q influence the stability of mtDNA, probably by the production of reactive oxygen species.