Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / N6-Metiladenosina (m6A) es la modificación química más abundante encontrada en los ARN mensajeros (ARNm) de células eucariontes. Esta modificación regula el metabolismo de los ARNm a diferentes niveles incluidos el corte y empalme de exones, traducción, estabilidad y degradación. Existen tres grupos de proteínas que regulan estos procesos: aquellas que catalizan la adición de la modificación, las proteínas metiltransferasas METTL3 y METTL14, las que remueven la metilación, las desmetilasas FTO y ALKBH5, y finalmente, las que reconocen m6A y actúan como efectoras de esta modificación, las proteínas lectoras YTHDF1,2 y 3. Recientemente se ha descrito la presencia de m6A en el ARN de diferentes virus que replican en el citoplasma, como los virus de la hepatitis C, virus Zika e influenza A, donde la modificación m6A regula la expresión de proteínas virales, estabilidad de los ARN virales (genómicos y mensajeros) y por ende la replicación viral. Sin embargo, se desconoce su rol en la replicación de otros virus de importancia clínica, como el virus respiratorio sincicial humano (VRSh). VRSh es uno de los principales causantes de enfermedades respiratorias en menores de 3 años, adultos mayores e inmunodeprimidos. Es un virus que infecta células del tracto respiratorio replicando en el citoplasma de estas. Posee un ARN genómico de simple hebra de polaridad negativa y actualmente no existen vacunas licenciadas ni tratamientos antivirales para combatir su infección. El objetivo de este trabajo fue determinar si las proteínas que participan en la adición, remoción y reconocimiento de m6A, tienen un impacto en la replicación del VRSh. Para esto, se sobreexpresaron las proteínas metiltransferasas, desmetilasas y lectoras en células HEK293T infectadas con VRSh y se estudió la expresión de la proteína viral de fusión (F) por Western Blot (WB). Además, se cuantificó los niveles del ARNm de F y el ARN genómico intra y extracelular mediante RT-qPCR bajo las mismas condiciones. Los resultados obtenidos muestran que la sobreexpresión de las metiltransferasas disminuyó la expresión de la proteína F y los niveles del ARNg viral, mientras que la sobreexpresión de las desmetilasas tuvo el efecto contrario, sugiriendo que m6A afecta de forma negativa la expresión de proteínas virales y la replicación del genoma de VRSh. Por otra parte, la sobrexpresión de las proteínas YTHDF1, 2 y 3 aumentó los niveles del ARNm de la proteína F, aunque disminuyó los niveles del ARNg del virus. Además, mediante ensayos de inmunoprecipitación de estas proteínas se observó que tanto YTHDF1, 2 y 3 se unen al ARNg de VRSh, sugiriendo que la modificación m6A se encuentra en el ARNg de VRSh. En conjunto, estos resultados sugieren la presencia de m6A en el ARN de VRSh, posiblemente regulando la síntesis de ARN mensajeros y ARN genómico, al igual que la expresión de proteínas virales, mediado por la actividad de las proteínas YTHDF1, 2 y 3. / Octubre 2019

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Con el fin de obtener mayor cantidad de oxígeno para satisfacer requerimientos metabólicos, un ser vivo puede recurrir a la optimización de ciertos parámetros estructurales pulmonares. En esta memoria se estudió la densidad de superficie alveolar, el grosor de la barrera alvéolo-capilar y el área alveolar total en aves y mamíferos voladores y no voladores como factores estructurales que se optimizan para obtener una mayor capacidad de difusión de oxígeno. Los pulmones de cuatro especies, dos voladoras (ave y mamífero), fueron analizados y comparados con dos no voladoras (ave y mamífero), mediante técnicas morfométricas; tórtola, Zenaida auriculata (ave voladora) y murciélago oreja de ratón, Myotis chiloensis (mamífero volador) v/s perdiz, Nothoprocta perdicaria (ave no voladora) y lauchón orejudo de Darwin, Phyllotis darwini (mamífero no volador). El peso corporal promedio fluctuó entre 6 + - 0.01 g en M. chiloensis y 398 + - 11.7 g en N. perdicaria. Mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) se logró observar y describir tres componentes de la barrera aire-sangre: endotelio, membrana basal y epitelio, obteniéndose también la media armónica del grosor de la barrera aire-sangre. La más gruesa fue la de N. perdicaria, 0.469 + - 0.02 micro m y la única distinta del resto, siendo la más delgada la de Z auriculata con 0.171 + - 0.02 micro m. Las dos especies voladoras tuvieron una densidad de superficie alveolar alta (310.29 + - 17.5 mm elevado a -1 en Z auriculata y 202.03 + - 7.1 mm elevado a -1 en M. chiloensis), determinando así un gran factor de difusión anatómica (ADF). El volumen pulmonar y el área alveolar por gramo de peso corporal fueron notablemente superiores en el pulmón quiropteriano, comparado con las aves y el mamífero no volador. Estas adaptaciones estructurales culminaron en una capacidad de difusión pulmonar morfométrica de la barrera aire-sangre por gramo de peso corporal (Dt Oxígeno/W) muy alta en el mamífero volador (0.00204 ml oxígeno/seg mbar gr) y en segundo lugar quedó la otra especie voladora (0.000928 ml oxígeno/seg mbar gr), confirmándose la hipótesis propuesta: las aves y los mamíferos voladores tienen mejor optimizados sus componentes estructurales pulmonares comparados con sus pares no voladores

Introducción: Las infecciones respiratorias agudas (IRA) constituyen un complejo grupo de enfermedades provocadas por diversos agentes causales que afectan cualquier parte de las vías respiratorias, esta tiene una evolución menor a 15 días. Los factores predisponentes más importantes tienen relación con la exposición ambiental (cambios bruscos a temperatura), factores personales (edad, bajo peso al nacer) y los factores sociales (hacinamiento).Por ello es necesario saber cuánto conocen las madres y si aplican las medidas preventivas de las (IRA) en niños menores de cinco años; para actuar de manera oportuna y eficaz. Objetivo: determinar la relación entre el conocimiento y la aplicación con las medidas preventivas en infecciones respiratorias agudas de las madres con niños menores de cinco años. Metodología: El estudio fue de tipo cuantitativo, diseño descriptivo correlacional, aplicó el muestreo probabilístico quedando conformada la muestra por 220 madres con niños menores de cinco años. Se utilizó un cuestionario estructurado el cual fue sometido a prueba de validez y confiabilidad. A partir de los resultados se elaboraron escalas de valoración para la medición de las variables aplicando la escala de estaninos para identificar niveles de conocimiento y el promedio para la aplicación de medidas preventivas. Para la comprobación de hipótesis se aplico la prueba estadística del Chi – cuadrado. Resultados: El nivel de conocimiento de las madres de niños menores de cinco años acerca de las Infecciones Respiratorias Agudas es bajo 54.5%, medio 23.6% y alto 21.9%. Las madres aplican medidas preventivas en Infecciones Respiratorias Agudas inadecuadas 72.2% y adecuadas 27.8%. Valor de chi2 es 147.8 y este es mayor que el valor critico para una p= 0.05. Conclusión: El conocimiento de las madres con niños menores de cinco años tiene relación significativa con la aplicación con las medidas preventivas en infecciones respiratorias agudas.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / RESÚMEN Introducción. El virus respiratorio sincicial (VRS) es el principal agente de infección respiratoria aguda infantil a nivel mundial y nacional. Diversos estudios han asociado patologías previas como factores asociados a la gravedad del cuadro; sin embargo, algunos niños sanos también se enferman gravemente mientras que otros cursan con una enfermedad leve. Ciertos genotipos de VRS han sido asociados con cuadros más graves mientras que otros estudios no encuentran ninguna asociación en particular. Por otro lado la respuesta inmune del hospedero parece ser el factor más relevante en la evolución clínica de los lactantes, según estudios en modelos animales y otros estudios in vitro; pero existen muy poco estudios in vivo en los pacientes afectados. Este trabajo plantea como hipótesis que la gravedad de la primoinfección por VRS en lactantes menores de 1 año se asocia a un perfil de respuesta inmune celular Th1 disminuida y no al genotipo viral. Objetivos. Caracterizar el perfil de la respuesta inmune celular en lactantes hospitalizados por primoinfección respiratoria aguda baja por VRS adquirida en la comunidad en relación a la gravedad de la enfermedad y detectar genotipos virales involucrados. Material y métodos. Se estudiaron 83 lactantes sanos con primoinfección por VRS durante los brotes de invierno de los años 2005 y 2006, los cuales fueron clasificados según su evolución en pacientes graves o leves. Se efectuaron técnicas de inmunotipificación a través de citometría de flujo para cuantificar las subpoblaciones linfocitarias y se midieron algunos marcadores de activación de linfocitos T (LT) y natural killer. También se cuantificaron los niveles de citoquinas de la respuesta de tipo Th1 y Th2 a través de la técnica de ELISA. Las cepas de VRS fueron genotipificadas mediante PCR y análisis filogenéticos del gen G. Resultados. La inmunotipificación demostró una disminución de la población de LT en el grupo de pacientes graves con respecto a lactantes leves y controles sanos. Esta disminución fue manifiesta especialmente en la subpoblación de linfocitos T citotóxicos/supresores (LTc/s). TambienTambién estuvieron disminuidos en el grupo grave los marcadores de linfocitos de memoria CD45RO, el marcador de activación de LT CD25 y el antígeno CD94 en la población natural killer que se asocia al sistema MHC clase I. Los niveles de citoquinas fueron en general bajos, excepto los niveles de IL-6 que fueron mayores en lactantes graves y los niveles de IL-8 mayores en pacientes con VRS con respecto a los controles sanos. Los genotipos del grupo B fueron más prevalentes en el 2005, especialmente del genotipo BA 4 (76,6%) y del grupo A durante el 2006, especialmente el GA2 (77,2%). Sin embargo, no hubo asociación de algún genotipo viral con cuadros clínicos de mayor gravedad. Conclusión: La gravedad del cuadro clínico en la infección por VRS se asocia a una respuesta inmune celular deficiente con un perfil de citoquinas Th1 disminuido y no al genotipo viral. / ABSTRACT Introduction. The respiratory sincicial virus (RSV) is the principal agent of acute infantile respiratory infection on a global and national scale. Several studies have associated previous pathologies as factors associated with the gravity of the clinical disease; nevertheless, some healthy children also fall seriously ill whereas others have a slight illness. Certain genotypes of RSV have been associated with more serious clinical disease whereas other studies do not find any connection in particular. On the other hand the immune response of the host seems to be the most important factor in the clinical evolution of the infants, according to studies in animal models and other studies in vitro; but there are very few studies in vivo in the affected patients. This work raises as hypothesis that the gravity of the primoinfection for RSV in infants younger than 1-yearold is related to a profile of diminished Th1 cellular immune response and not to the viral genotype. Objectives. To characterize the profile of the cellular immune response in infants hospitalized for low acute respiratory primoinfection by RSV acquired in the community in relation to the gravity of the illness and to detect viral genotypes involved. Material and methods. 83 healthy infants with primoinfection by RSV were studied during the winter sprouts of the years 2005 and 2006, which were classified according to their evolution under severe or mild patients. Techniques of immune typification were carried out through flow cytometry to quantify the subpopulations of lymphocytes and some markers of activation of lymphocytes T (LT) and natural killers were measured. Also the levels of cytokines of the response of type Th1 and Th2 were quantified through the ELISA technique. The straines of RSV were genotyped by means of PCR and phylogenetics analysis of the gene G. Results. The immune typification demonstrated a decrease of the LT population in the group of severe patients in comparisson to mild infants and healthy control. This decrease was clear especially in the subpopulation of lymphocytes T cytotoxics/supresors (LTc/s). The markers of lymphocytes of memory CD45RO, the activation marker of LT CD25 and the antigen CD94 in the population of natural killer that is associated to the system MHC class I were also diminished in the severe group. The levels of cytokines were generally low, except the levels of IL-6 that were higher in severe infants and the levels of IL-8 higher in patients with RSV with regard to the healthy control. The genotypes of the group 6 B were more prevalents in 2005, especially of the genotype BA (76,6 %) and of the group A during the year 2006, especially the GA2 (77,2 %). Nevertheless, there was no association of any viral genotype with clinical disease of major gravity. Conclusion: The gravity of the clinical disease in the infection by RSV is associated to an deficient cellular immune response with a diminished profile of cytokines Th1 and not to the viral genotype.

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Lung ultrasound use is increasing in respiratory medicine thanks to its development in the latest years. Actually it allows to study diseases of the chest wall (traumas, infections, neoplasms), diaphragm (paralysis, ipokinesis), pleura (effusions, pneumothorax, thickenings, neoplasms) and lung parenchyma (consolidations, interstitial syndromes, peripheral lesions). One of the most useful application of chest ultrasound is the evaluation of effusions. However, no standardized approach for ultrasound-guided thoracenthesis is available. Our study showed that our usual ultrasonographic landmark (“V-point”) could be a standard site to perform thoracenthesis: in 45 thoracenthesis no pneumothorax occurred, drainage was always successful at first attempt. Values of maximum thickness at V-point and drained fluid volume showed a significative correlation. Proteins concentration of ultrasound patterns of effusions (anechoic, ipoechoic, moving echoic spots, dense moving spots, hyperechoic) were compared to those of the macroscopic features of fluids showing connection between light-yellow fluid and echoic moving spots pattern and between ipoechoic/dense moving spots and cloudy-yellow/serum-haematic fluids. These observations suggest that ultrasound could predict chemical-physical features of effusions. Lung ultrasound provides useful information about many disease of the lung, but actually there is not useful in obstructive bronchial diseases. Analysing diaphragmatic kinetics using M-mode through transhepatic scan we described a similarity between diaphragm excursion during an expiratory forced maneuver and the volume/time curve of spirometry. This allowed us to identify the M-mode Index of Obstruction (MIO), an ultrasound-analogue of FEV1/VC. We observed MIO values of normal subjects (9) and obstructed patients (9) comparing the two groups. FEV1/VC and MIO showed a significant correlation suggesting that MIO may be affected by airways obstruction; MIO values were significatively different between normal and obstructed so that it could identify an obstructive syndrome. The data show that it is possible to suspect the presence of obstructive syndrome of the airways using ultrasonography of the diaphragm.