Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d'action afin d'obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L'utilisation combinée de trois protéases nous a permis d'obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d'intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d'une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L'interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.