Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d'action afin d'obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L'utilisation combinée de trois protéases nous a permis d'obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d'intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d'une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L'interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG.

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Pseudomonas aeruginosa et Yersinia pestis sont responsables d'infections graves chez les individus immunodéprimés et de la peste, respectivement. Leur pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3) qui a une action prépondérante lors d'infections aiguës. Le SST3 est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne, d'une aiguille creuse érigée à la surface et d'un pore de translocation inséré dans la membrane de la cellule hôte permettant à la bactérie d'y injecter des toxines. L'objet de cette thèse est l'étude de l'interactome de l'antigène protecteur V, PcrV chez P. aeruginosa et LcrV chez Y. pestis. Celui-ci est situé au sommet de l'aiguille et est nécessaire au processus de translocation des toxines. L'étude des propriétés biochimiques de la protéine in vitro nous a permis de mettre en évidence sa capacité à former des oligomères présentant une structure en forme d'anneaux. Les multimères ont été observés par chromatographie d'exclusion de taille, gel natif, spectrométrie de masse native et MET. Leur formation est dépendante de la présence de l'hélice α12 C terminale de PcrV et de l'intégrité de ses résidus hydrophobes. Le processus d'assemblage de la protéine est nécessaire à sa fonction in vivo : des mutants qui sont incapables d'oligomériser perdent leur cytotoxicité envers les cellules eucaryotes. <br />Puis, l'interaction directe entre PcrV et la sous unité formant l'aiguille, PscF, a été mise en évidence in vitro par co-purification. De plus, deux mutants ponctuels de PscF dont le phénotype présente un défaut de translocation se sont montrés défectueux pour la liaison avec PcrV. Enfin, l'hélice C terminale de PscF est échangeable avec l'hélice α12 C terminale de PcrV comme l'atteste la capacité de polymérisation d'un hybride créé entre ces deux protéines, suggérant un rôle de celle-ci dans la formation du complexe F-V. L'ensemble de ces études montre que l'assemblage multimérique des antigènes V ainsi que leur position au sommet de l'aiguille sont des éléments essentiels à leur fonction, avec un rôle prépondérant de l'hélice α12 C terminale de PcrV. Ces conclusions pourraient permettre de mieux cibler les développements futurs de nouveaux vaccins ou agents antimicrobiens.

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