CONTEXTE: Au cours de l'infarctus du myocarde, l'homéostasie du calcium entre leréticulum sarcoplasmique (SR), les mitochondries et le cytosol est altérée chez lescardiomyocytes (CM) et conduit à la mort cellulaire. Les canaux de fuite de calcium sontconsidérés comme des régulateurs clés de l'homéostasie calcique réticulaire. Le translocon(TLC), un composant majeur de la machine de la traduction protéique, est un important canalde fuite calcique réticulaire.METHODES: Par des moyens optiques, nous avons d'abord évalué l'organisation spatiale etla fonction du TLC dans le SR de souris adultes CM. Dans un second temps, nous avonsinterrogé si et comment la modulation pharmacologique TLC pourrait réduire les lésionsd'ischémie/reperfusion (I/R) cardiaque dans un modèle d'infarctus du myocarde de souris.RÉSULTATS: Nos données montrent que le TLC est spécifiquement localisée dans le SRlongitudinale des CM chez la souris adulte. Nous démontrons que la puromycine (activateurpharmacologique du TLC) induit une réduction partielle des réserves de calcium dans le SRlongitudinale, alors que nous n'observons aucune altération des réserves de calcium dépendantdu récepteur ryanodine dans le SR jonctionnelle. Le préconditionnement de la souris par lapuromycine, soumis à un infarctus du myocarde, diminue significativement la zone d'infarctusde près de 30,9±6,3%. Ceci est corrélé à une diminution de l'activation des protéines proapoptotiquesmitochondriales et à une augmentation d'un mécanisme de pro-survie:l'autophagie. Nous avons également démontré que le préconditionnement de la puromycinediminue la vitesse d'augmentation du calcium dans le cytosol du CM adulte pendant la duréede l'ischémie en corrélation avec la diminution de l'activation des calpains calciques.CONCLUSIONS: Dans cette étude, nous avons caractérisé le TLC comme un canal de fuitespécifiquement situé dans le compartiment longitudinale du SR dans les CM de souris adultes.Nous avons constaté que l'activation pharmacologique de la TLC avant l'infarctus dumyocarde exerce un effet de préconditionnement sur le myocarde sans altérer les réserves de calcium dépendant de la ryanodine. Dans l'ensemble, ces résultats mettent l'accent sur les connaissances actuelles sur la dualité entre le SR jonctionnelle et le SR longitudinale et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques / BACKGROUND: During myocardial infarction, alteration of calcium homeostasis between sarcoplasmic reticulum (SR), mitochondria and cytosol occurs in cardiomyocytes (CM) and leads to cell death. Calcium leak channels are thought to be key regulators of the reticular calcium homeostasis. Translocon (TLC), a major component of the translation machinery, is a major reticular calcium leak channel.METHODS: By the mean of photonics, we first assessed the spatial organization and the function of TLC in the SR of adult mouse CM. In a second time, we questioned if and how the pharmacological TLC modulation could reduce ischemia/reperfusion (I/R)-mediated heart injury in a model of mouse myocardial infarction.RESULTS: Our data show that TLC is specifically located in the longitudinal SR in adult mouse CM. We demonstrate that puromycin induces a partial reduction of calcium stores in the longitudinal SR, while we observe no alteration in the ryanodine receptor-dependent calcium stores in the junctional SR. Puromycin preconditioning of mouse subjected to myocardial infarction significantly decreases the infarct area by near 30.9±6.3%. This is correlated with a decrease in the activation of mitochondrial pro-apoptotic proteins and an increase of a pro-survival mechanism: autophagy. We further demonstrated that puromycin preconditioning decreases the rate of calcium increase in the cytosol of adult CM during the ischemia duration in correlation with the decreased activation of calcium-dependent calpains.CONCLUSIONS: In this study, we characterized TLC as a leak channel specifically located in the longitudinal SR compartment of adult mouse CM. We found that the pharmacological activation of TLC before myocardial infarction exerts a preconditioning effect on myocardium without altering the ryanodine-dependent calcium stores. Altogether, these findings emphasize the present knowledge on the duality between junctional and longitudinal SR in CM and open up new therapeutic perspectives

Habilitation à diriger des recherches : Sciences naturelles : Lille 1 : 2003. / Synthèse de travaux en français et articles publiés en anglais reproduits dans le texte. N° d'ordre (Lille 1) : 396. Résumé. Curriculum vitae. Pagination multiple pour les articles reproduits. Bibliogr. p. 150-188 et à la suite des articles. Liste des publications.

La triadine est une famille de protéines du muscle squelettique. Quatre isoformes de la triadine ont été clonées: Trisk 95, Trisk 51, Trisk 49 et Trisk 32. Ce sont des protéines transmembranaires du reticulum sarcoplasmique (RS). Trisk 95 et Trisk 51 sont localisées dans la triade où elles sont associées au récepteur de la ryanodine (RyR), un canal calcique. Trisk 49 et Trisk 32 sont localisées dans le RS longitudinal. Il a été montré que Trisk 95 régule les relâchements de Ca2+ du RyR. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier les fonctions des triadines dans le muscle squelettique grâce à différentes approches et techniques complémentaires. Dans un premier temps, Trisk 95 et de Trisk 51 ont été étudiées par surexpression in vivo dans les muscles de souris. La caractérisation de ces muscles a permis de mettre en évidence l'association du RyR avec la cavéoline, une protéine de la membrane plasmique. Dans un second temps, la fonction de Trisk 32 a été étudiée dans le muscle squelettique. L'étude précise de sa localisation a permis de montrer qu'elle est localisée dans la triade, dans le RS longitudinal, et à proximité des mitochondries. Des expériences de co-immunoprécipitation ont révélé qu'elle est associée avec le RyR et avec le récepteur de l'IP3. De par ses partenaires, Trisk 32 semble jouer un rôle dans la régulation de nombreux mécanismes impliquant le Ca2+. Enfin, le gène de la triadine a été invalidé chez la souris. Cette souris KO triadine présente une faiblesse musculaire et des défauts dans l'ultrastructure de la triade. Ces résultats indiquent qu'en plus de sa fonction de régulation des relâchements de Ca2+ la triadine pourrait avoir un rôle structural.

La Myotubularine (MTM1) est une 3-phosphatase à phosphoinositides (PI) mutée dans la myopathie centronucléaire liée au chromosome X (XLCNM), caractérisée par une faiblesse musculaire et un positionnement anormal des noyaux dans les fibres musculaires. MTM1 définit une grande famille de phosphatases, exprimées dans tous les tissus, et qui englobent des phosphatases catalytiquement actives et inactives. Les myotubularines actives dephosphorylent le phosphatidylinositol 3 monophosphate [PtdIns3P] et le 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2] en PtdIns et PtdIns5P, respectivement. Le rôle de MTM1 et son activité phosphatase à lipide dans le muscle restaient peu connus. L’étude approfondie de la protéine a révélé une association de MTM1 au réticulum sarcoplasmique des triades, un sous-compartiment impliqué dans la régulation calcique. La caractérisation de la souris Mtm1 KO, qui reproduit la XLCNM, a témoigné d’une anomalie de l’organisation et de la forme du réticulum sarcoplasmique. Afin d’explorer l’implicationde l’activité phosphatase de MTM1 dans l’organisation de réticulum sarcoplasmique, j’ai utilisé une approche in vivo avec des virus adéno-associé (AAV) pour moduler l’activité phosphatase en sur-exprimant MTM1 et sa forme phosphatase-inactive (MTM1-C375S) dans un muscle sauvage. L’observation des muscles transduits a dévoilé une implication de MTM1 dans le remodelage du réticulum sarcoplasmique et un rôle potentiel de PtdIns3P avec MTM1 dans la courbure des membranes du réticulum sarcoplasmique. Afin de comprendre l’importance de l’activité phosphatase dans le maintien du phénotype XLCNM, les muscles de souris Mtm1 KO ont été injectés avec ces AAVs contenant la forme active et inactive de MTM1 au moment de l’apparition des premiers signes de XLCNM. Étonnamment, la forme phosphatase-inactive(MTM1-C375S) a sauvé le phénotype de la souris Mtm1 KO de la même façon que la forme active, suggérant que l'activité de phosphatase de MTM1 n’est pas nécessaire pour le maintien de la structure intracellulaire des fibres du muscle adulte. Ces données suggèrent que MTM1 exerce une fonction phosphatase-indépendante dans le maintien de la structure musculaire, certainement via des interactions protéine-protéine, et une fonction phosphatase-dépendente dans le remodelage de la forme du réticulum sarcoplasmique dans le muscle squelettique. / Myotubularin (MTM1) is a phosphoinositide (PI) 3-phosphatase mutated in X-linked centronuclear myopathy (XLCNM), a rare congenital myopathy characterized by muscle weakness and abnormal positioning of nuclei in muscle fibers. MTM1 defines a large family of ubiquitously expressed catalytically active and inactive phosphatases. Active myotubularins dephosphorylate both phosphatidylinositol 3-phosphate [PtdIns3P] and 3,5-bisphosphate [PtdIns(3,5)P2] to PtdIns andPtdIns5P, respectively. The specific role of MTM1 and its PI phosphatase activity in muscle remains unknown. Comprehensive analysis of the protein unveiled the association of MTM1 with the sarcoplasmic reticulum (SR) at the triads. Characterization of Mtm1-KO mouse, which reproduce the XLCNM phenotype, revealed a defect of SR organization and shape. In order to gain insight into the involvement of MTM1 phosphatase activity on SR shape and organization, we employed an in vivo approach using Adeno-Associated Virus (AAV) to modulate the phosphatase activity by overexpressingMTM1 and its phosphatase inactive mutant in wild type muscle. The analysis of transduced muscle revealed the involvement of MTM1 in the SR remodeling and its potential role together with PtdIns3P in modulating membrane curvature. In order to understand the importance of the phosphatase activity in the generation of the XLCNM phenotype, Mtm1 KO mice were injected with AAV expressing the active form and the phosphatase inactive form. Surprisingly, both, the phosphatase active and the phosphatase inactive mutant corrected the Mtm1-KO mouse phenotype to a similar extent, thus suggesting that the PI-phosphatase activity of MTM1 is not essential for adult skeletal muscle maintenance. Our data indicates that MTM1 has a phosphatase-independent function in adult muscle structure maintenance and a phosphatase-dependent function in sarcoplasmic reticulum remodeling and shape in skeletal muscle.