La découverte d'un contexte génétique chez les streptocoques – codant un petit peptide hydrophobe (SHP) et un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille Rgg –, suivi de l'étude d'un de ces loci chez S. thermophilus LMD-9, a conduit à l'hypothèse que les protéines régulatrices Rgg en association avec une phéromone putative SHP pourraient intervenir dans un mécanisme de type quorum-sensing (QS) chez les bactéries à Gram positif. La première partie de ma thèse a consisté à confirmer cette hypothèse sur le locus shp/rgg1358 de S. thermophilus LMD-9, espèce contenant le plus grand nombre de systèmes SHP/Rgg dans son génome. Pour ceci, les étapes impliquées dans un mécanisme de QS ont été étudiées : la sécrétion, la maturation et la détection à une concentration seuil de la phéromone, sa réimportation à l'intérieur de la cellule, son interaction avec un régulateur transcriptionnel et enfin l'interaction de la protéine régulatrice à l'ADN. Par l'utilisation d'approches génétiques et biochimiques, nous avons démontré l'existence d'un nouveau mécanisme de QS impliquant pour la première fois un régulateur transcriptionnel Rgg et une phéromone SHP, importée à l'intérieur de la cellule par le transporteur d'oligopeptides AmiCDEF. Le rôle de la protéase membranaire, Eep, a également été démontré dans la maturation de la phéromone, dont la forme mature a été déterminée par spectrométrie de masse et validée in vivo. Dans un second temps, nous avons exploré la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme sur d'autres loci shp/rgg, dans le but d’étudier l'existence d’éventuels phénomènes de cross-talk entre les bactéries. L'étude de nouveaux loci, en système hétérologue chez S. thermophilus LMD-9, a permis d'étendre la fonctionnalité du mécanisme à deux systèmes SHP/Rgg de streptocoques pathogènes, à savoir S. agalactiae et S. mutans. En parallèle à ce travail de caractérisation, l'identification des régulons des systèmes SHP/Rgg a été entreprise. La construction d'un arbre phylogénétique des protéines Rgg-like a permis d'identifier 68 systèmes SHP/Rgg, que nous avons classés en trois groupes. L'analyse des régions promotrices des gènes shp a conduit à l'identification d'un site putatif de liaison des protéines Rgg à l'ADN spécifiques de chaque groupe SHP/Rgg. Une approche in silico a ensuite été menée afin de rechercher, dans les génomes séquencés de streptocoques, les gènes cibles putatifs. Alors que des cibles proximales ont été détectées pour les groupes II et III, des cibles distales ont été identifiées dans les groupes I et II. Actuellement, la validation de certaines cibles est en cours au laboratoire. A l'avenir, ce travail pourrait permettre le développement de petits peptides permettant d'optimiser l'utilisation de S. thermophilus en industries laitières et de réduire la virulence des streptocoques pathogènes. / The discovery of a genetic context – encoding a small hydrophobic peptide (SHP) and a transcriptional regulator belonging to the Rgg family (in nearly all streptococcal genomes) –, following by the study of one of this loci in S. thermophilus LMD-9, led to the hypothesis that the regulatory proteins Rgg in association with a putative pheromone SHP could define a novel quorum-sensing (QS) regulatory mechanism in Gram-positive bacteria. The first part of my PhD consisted to validate this hypothesis. For this purpose, we analyzed the SHP/Rgg system in all the steps that are commonly involved in QS mechanisms: (i) secretion of the putative pheromone, (ii) maturation of the pheromone, (iii) capture of the pheromone from the external environment at a threshold concentration, (iv) importation of the pheromone inside the cell and (v) interaction of the transcriptional regulator to the promoter regions of targeted genes. Experimentally, we focused on the so-called shp/rgg1358 locus of S. thermophilus LMD-9, which is the streptococcal species containing the largest number of shp/rgg pairs in its genome. By using genetic and biochemistry approaches, we uncovered a new QS mechanism that involves the pheromone SHP, the oligopeptide transporter AmiCDEF for the uptake of the pheromone and the transcriptional regulator Rgg for the control of target gene expression. Furthermore, we showed that the membrane protease Eep participates in the production of the mature pheromone, which has been identified by mass spectrometry. Once characterized, the second part of my PhD was to explore the functionality of this new QS system in other streptococcal strain or species, in order to determine if cross-reactivity phenomenon between streptococci can occur. By using heterologous expression in S. thermophilus LMD-9, we extended the functionality of the SHP/Rgg system to two pathogenic streptococcal species, i.e. S. agalactiae and S. mutans. The last part of my PhD consisted in identifying the regulon of all SHP/Rgg systems. Following the construction of a phylogenetic tree of the Rgg-like proteins in low GC Gram-positive bacteria, we identified 68 SHP/Rgg systems that we classified in three groups. Analyzing the promoter regions of all shp genes led to the identification of a putative Rgg DNA binding site specific to each SHP/Rgg group. An in silico approach was used to scan all sequenced streptococcal genomes for the three identified patterns. Whereas proximal target genes were detected for groups II and III, distal target genes were found in groups I and II. In addition, we uncovered that putative Rgg DNA binding sites can be localized in coding or non-coding region. Currently, validations are in progress. To sum-up, my PhD studies provided evidences that the Rgg proteins in association with small peptide pheromones define a new QS mechanism that seems to regulate the expression of distal and proximal genes in a species-dependent manner. Important insights should be obtained concerning a putative crosstalk among streptococci that involves the SHP/Rgg QS system. My studies may constitute a basis for the development of small peptides to optimize the use of S. thermophilus in dairy factories and reduce the virulence of pathogenic streptococci.

Streptococcus thermophilus, bactérie utilisée en industrie agro-alimentaire, est soumise à de nombreuses modifications environnementales (modification de la concentration en oxygène, de la température, du pH, ...) lors de la fabrication de produits fermentés. Pour s'adapter à ces modifications, la bactérie dispose de systèmes de défense qui sont contrôlés par des réseaux de régulation impliquant notamment des régulateurs transcriptionnels. Parmi eux, se trouvent les régulateurs de la famille Rgg. Les gènes Rgg codent des régulateurs transcriptionnels très polymorphes. Plusieurs études ont montré leur implication dans la réponse aux stress. L'originalité de S. thermophilus est que de nombreuses copies Rgg différentes sont présentes sur les génomes de cette espèce bactérienne (entre 5 et 7 copie selon les souches). Cette étude a pour objectif la caractérisation de la famille Rgg et l'étude du rôle des gènes Rgg de S. thermophilus, et, notamment, l'implication de ces gènes dans l'adaptation de S. thermophilus à son environnement. Les analyses réalisées in silico ont permis de montrer que les gènes Rgg sont spécifiques de la famille des Streptocococcaceae et des genres Lactobacillus et Listeria. Les protéines appartenant à cette famille sont polymorphes et ne forment pas un groupe monophylétique. Les analyses ont néanmoins montré que ces protéines se caractérisaient par deux domaines : un « domaine HTH » en position N-terminale, très probablement impliqué dans la liaison à l'ADN et un « domaine médian » en position centrale, dont le rôle reste à déterminer. Les analyses réalisées au cours de ce travail montrent que le gène rgg0182 de S. thermophilus LMG18311 code un régulateur transcriptionnel qui participe, notamment, à la réponse adaptative de S. thermophilus exposée à une augmentation de sa température de croissance. De plus, la délétion du gène Rgg0182 confère aux cellules une capacité d'adhésion à une surface hydrophobe et induit une réduction de la taille des chaînes. L'ensemble de ces phénotypes suggère que la protéine Rgg0182 est un régulateur global de l'expression génique de S. thermophilus LMG18311. Des gènes cibles de ce régulateur ont été recherchés parmi les gènes de réponses au choc thermique et indique que la protéine Rgg0182 est impliquée dans l'homéostasie des chaperons et des protéases. / Streptococcus thermophilus, bacterium used in dairy industry, is subjected to many environmental changes (oxygen concentration modification, temperature shift, pH variation...) during manufacturing of fermented products. To adapt itself to these modifications, bacterium has defense systems which are controlled by regulation networks involving, in particular, transcriptional regulators. Among them, they are transcriptional regulators of the Rgg family. rgg genes code transcriptional regulators which are very polymorph. Several studies showed their involvement in stress response. The originality of S. thermophilus is the presence of many different rgg copies on genomes of this bacterial species (between 5 and 7 copy according to strain). Objective of this study is the characterization of the Rgg family and study of the S. thermophilus rgg gene function, and, in particular, involvement of these genes in S. thermophilus adaptation to environmental changes. In silico analyses has allowed to show that rgg genes are specific to the Streptocococcaceae family of and the Lactobacillus and the Listeria genus. Proteins belonging to this family are polymorphic and don?t form a monophyletic group. Analyses nevertheless showed that these proteins were characterized by two domains: a "HTH domain" in N-terminal position, very probably involved in the DNA interaction, and a "median domain" in central position which the role remains to determine. Analyses realized during this work show that S. thermophilus LMG18311 rgg0182 gene codes a transcriptional regulator which participates, in particular, in the adaptive response of S. thermophilus exposed to an increase of its growth temperature. Furthermore, the deletion of the rgg0182 gene confers on cells the capacity of a hydrophobic surface adhesion and leads to a reduction of cells chains size. All these phenotypes suggest that Rgg0182 protein is a global regulator of S. thermophilus LMG18311 genic expression. Target genes of this regulator were looked for among genes of thermal stress response and indicate that Rgg0182 protein is involved in the chaperons and proteases homeostasis.

Cette thèse a pour objectif la caractérisation des gènes rgg de S. thermophilus LMG18311 codant des régulateurs transcriptionnels et l'étude de leur implication dans l'adaptation à l'environnement. Ce travail montre que le gène rgg0182 code un régulateur transcriptionnel activant la transcription de ses gènes adjacents. Par ailleurs, le couple Rgg0182/Shp0182 participerait à un mécanisme de quorum sensing. De plus, la protéine Rgg0182 participe à la tolérance au stress chaud. En outre, les cellules du mutant [delta]rgg0182 présentent un phénotype d'adhésion thermo-induite via des interactions de types hydrophobes. L'analyse par microscopie à force atomique des cellules de la souche LMG18311 et du mutant [delta]rgg0182 révèle la présence de polymères de surface uniquement chez la souche sauvage, suggérant que la protéine Rgg0182 régulerait l'expression de protéines de surface et de la division cellulaire. Une étude protéomique couplée à une analyse transcriptomique ont permis d'identifier plusieurs cibles de Rgg0182 qui participeraient à diverses fonctions biologiques. L'ensemble des données obtenues démontre que la protéine Rgg0182 de S. thermophilus LMG18311 est un régulateur global de l'expression génique. Par ailleurs, la transcription des 7 gènes rgg présents au sein du génome de S. thermophilus LMG18311 est modulée par les conditions environnementales. Les profils de transcription des 7 gènes rgg diffèrent les uns par rapport aux autres, suggérant que chacun d'eux seraient requis dans des conditions de croissances différentes. Ces données posent l'hypothèse que les protéines Rgg participeraient à la régulation fine et complexe de l'expression génique de S. thermophilus / This thesis aims to characterize the rgg genes of S. thermophilus LMG18311 coding transcriptional regulator and their involvement in environmental adaptation. This work shows that rgg0182 gene encodes a transcriptional regulator controlling the transcription of its flanking genes. The Rgg0182/Shp0182 pair could be involved in a quorum sensing mechanism. This work also demonstrates that the Rgg0182 protein is involved in S. thermophilus tolerance to heat stresses. In addition, the mutant delta rgg0182 cells exhibit a thermo-induced adhesion phenotype via hydrophobic interactions. Analyses by atomic force microscopy of LMG18311 cells of the wildtype and its derivative rgg0182 mutant reveal the presence of polymers only on the surface of the wild-type strain, suggesting that the protein Rgg0182 would regulate the expression of surface proteins and proteins of cell division. A proteomic study coupled with transcriptomic analysis led to the identification of several targets of Rgg0182 involving in various biological functions. The data obtained in this work have shown that the S. thermophilus LMG18311 rgg0182 genes encodes a global regulator of gene expression. Furthermore, transcriptional analyses, in different growth conditions, of the 7 rgg genes present in the genome of S. thermophilus LMG18311 showed that they display different expression profiles that are modulated by environmental conditions. This suggests that these genes would be required in distinct growth conditions. These data raise the hypothesis that Rgg proteins participate in the fine and complex regulation of S. thermophilus gene expression

La découverte d'un contexte génétique chez les streptocoques - codant un petit peptide hydrophobe (SHP) et un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille Rgg -, suivi de l'étude d'un de ces loci chez S. thermophilus LMD-9, a conduit à l'hypothèse que les protéines régulatrices Rgg en association avec une phéromone putative SHP pourraient intervenir dans un mécanisme de type quorum-sensing (QS) chez les bactéries à Gram positif. La première partie de ma thèse a consisté à confirmer cette hypothèse sur le locus shp/rgg1358 de S. thermophilus LMD-9, espèce contenant le plus grand nombre de systèmes SHP/Rgg dans son génome. Pour ceci, les étapes impliquées dans un mécanisme de QS ont été étudiées : la sécrétion, la maturation et la détection à une concentration seuil de la phéromone, sa réimportation à l'intérieur de la cellule, son interaction avec un régulateur transcriptionnel et enfin l'interaction de la protéine régulatrice à l'ADN. Par l'utilisation d'approches génétiques et biochimiques, nous avons démontré l'existence d'un nouveau mécanisme de QS impliquant pour la première fois un régulateur transcriptionnel Rgg et une phéromone SHP, importée à l'intérieur de la cellule par le transporteur d'oligopeptides AmiCDEF. Le rôle de la protéase membranaire, Eep, a également été démontré dans la maturation de la phéromone, dont la forme mature a été déterminée par spectrométrie de masse et validée in vivo. Dans un second temps, nous avons exploré la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme sur d'autres loci shp/rgg, dans le but d'étudier l'existence d'éventuels phénomènes de cross-talk entre les bactéries. L'étude de nouveaux loci, en système hétérologue chez S. thermophilus LMD-9, a permis d'étendre la fonctionnalité du mécanisme à deux systèmes SHP/Rgg de streptocoques pathogènes, à savoir S. agalactiae et S. mutans. En parallèle à ce travail de caractérisation, l'identification des régulons des systèmes SHP/Rgg a été entreprise. La construction d'un arbre phylogénétique des protéines Rgg-like a permis d'identifier 68 systèmes SHP/Rgg, que nous avons classés en trois groupes. L'analyse des régions promotrices des gènes shp a conduit à l'identification d'un site putatif de liaison des protéines Rgg à l'ADN spécifiques de chaque groupe SHP/Rgg. Une approche in silico a ensuite été menée afin de rechercher, dans les génomes séquencés de streptocoques, les gènes cibles putatifs. Alors que des cibles proximales ont été détectées pour les groupes II et III, des cibles distales ont été identifiées dans les groupes I et II. Actuellement, la validation de certaines cibles est en cours au laboratoire. A l'avenir, ce travail pourrait permettre le développement de petits peptides permettant d'optimiser l'utilisation de S. thermophilus en industries laitières et de réduire la virulence des streptocoques pathogènes.