Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:37:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Morello_LuisGustavo_D.pdf: 80024877 bytes, checksum: 1848ac9901b4322b786b1dcd7a521a69 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Estudos prévios realizados em nosso laboratório demonstraram a interação entre as proteínas humanas SBDS e NIP7. SBDS participa da biogênese de ribossomos e sua deficiência está associada à síndrome de Shwachman- Bodian-Diamond. NIP7 é uma proteína conservada e já foi caracterizada em levedura, onde participa da formação da subunidade ribossomal 60S. Neste trabalho, nós investigamos o papel de NIP7 na síntese de ribossomos em células humanas. A depleção de NIP7 revelou defeitos no processamento do pré-rRNA associado à produção do rRNA 18S, causando déficit na formação da subunidade ribossomal 40S. Essa divergência de resultados entre a função de NIP7 em levedura e células humanas é consistente com o fato de que NIP7 humana não complementa levedura deficiente em Nip7p. Ainda, um rastreamento em sistema de duplo-híbrido tendo NIP7 humana como isca revelou parceiros de interação diferentes daqueles reportados para Nip7p em levedura. FTSJ3 foi a parceira isolada com maior frequência. FTSJ3 é a provável ortóloga de Spb1p em levedura, a qual está envolvida na formação da subunidade ribossomal 60S. A associação entre FTSJ3 e NIP7 foi demonstrada por ensaios de pull-down e imunoprecipitação, como sendo dependente de RNA. A co-localização nucleolar e co-sedimentação dessas proteínas em fracionamento em gradiente de sacarose corroboram a associação. Além disso, células humanas deficientes em FTSJ3 revelaram defeitos na via de maturação do rRNA 18S, mesma via afetada pela depleção de NIP7. Em adição, a caracterização proteômica de complexos contendo FTSJ3 e NIP7 revelaram que essas proteínas co-purificam complexos pré-ribossomais. Uma comparação entre o conjunto de proteínas que interagem com Spb1p e as proteínas identificadas nos ensaios de pull-down com FLAG-FTSJ3 revelou que elas apresentam apenas um ortólogo em comum, o qual, incrivelmente, é Nip7/NIP7. Essas observações revelaram diferenças significativas na função desses fatores durante a síntese de ribossomos em levedura e células humanas, adicionando NIP7 e FTSJ3 na lista crescente de fatores com funções divergentes nas vias de processamento do rRNA em levedura e humanos / Abstract: Previous studies from our laboratory have demonstrated the interaction between the SBDS and NIP7 human proteins. SBDS play a role in ribosome biogenesis and its deficiency is associated to the Shwachman-Bodian-Diamond syndrome. NIP7 is a conserved protein and has already been characterized in yeast, where it participates in the 60S ribosomal subunit formation. In this work, we investigated the role of NIP7 in ribosome biogenesis in human cells. NIP7 knockdown caused pre-rRNA processing defects associated to the 18S rRNA maturation, leading to deficiency in 40S ribosomal subunit synthesis. The divergence between NIP7 function in yeast and human cells is further supported by the fact that human NIP7 does not complement yeast deficient in Nip7p. In addition, a two-hybrid screen using human NIP7 as bait revealed interaction partners different from those reported for yeast Nip7p. FTSJ3 was isolated as one of the most frequent human NIP7-interacting candidates. FTSJ3 is a putative ortholog of yeast Spb1p, which has been implicated in 60S ribosomal subunit synthesis. The association between FTSJ3 and NIP7 was showed by pull-down and immunoprecipitation assays as an RNA-dependent interaction. Nucleolar colocalization and co-sedimentation on a sucrose gradiente fractionation corroborate this association. Furthermore, RNAi-mediated knockdown revealed that depletion of FTSJ3 causes pre-rRNA processing defects in the pathway leading to 18S rRNA maturation, the same pathway affected by NIP7 downregulation. In additon, proteomic characterization of FTSJ3- and NIP7- containing complexes showed that these proteins copurify pre-ribosomal complexes. A comparison of the set of Spb1p-interacting proteins with the proteins identified in the pulldown with FLAG-FTSJ3 showed that they share only one ortholog which, incredibly, is Nip7/NIP7. These observations revealed significant differences in the function of these factors during the synthesis of ribosomes in yeast and human cells, adding NIP7 and FTSJ3 to the growing list of factors with different functions in yeast and human rRNA processing pathways / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Ana Carolina de Mattos Zeri, Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T05:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_JulianaFerreirade_D.pdf: 4266971 bytes, checksum: b6c93b83027283390194f44df501c5b2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Proteínas da família SBOS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) ocorrem largamente na natureza e s.ão bastante conservadas, apresentando ortólogas em Archaea e eucariotos. Estudos de análises genômica e biofísica tem relacionado a SBOS com o metabolismo de RNA e biosíntese de ribossomos. O gene ortólogo da SBOS de Archaea está localizado em um operon conservado que contém genes do processamento de RNA; estudos de perfil de expressão gênica tem agrupado o gene da proteína SBOS de Saccharomyces cerevisiae, Sdo1p, com fatores do processamento de rRNA e estudos de análise proteômica identificaram a interação da proteína Sdo1p com fatores da biossíntese de ribossomos; ortólogas de planta contém um C-terminal estendido apresentando motivo de ligação a RNA. Mutações identificadas no gene SBDS tem sido relacionadas com a síndrome Shwachman-Oiamond (80S), uma doença caracterizada por insuficiência exócrina pancreática e disfunção na medula óssea, cujos pacientes apresentam grandes chances de desenvolver leucemia. SOS representa, portanto, um importante modelo para entender os processos envolvidos no desenvolvimento da leucemia. O objetivo principal desse trabalho consistiu na caracterização estrutural e funcional de proteínas da família SBOS. Foram realizados ensaios de cristalização com ortólogas ; da SBOS de Archaea, levedura, tripanossoma e humana. A SBOS de Pyrococcus abyssi foi cristalizada, porém os cristais difrataram a baixa resolução (3,50 A). A ' caracterização da SBOS ortóloga de Trypanosoma cruzi (TcSBOS) mostrou que esta, proteína contém uma região C-terminal estendida. Ensaios de proteólise limitada,' dicroismo circular e espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) indicaram que a região adicional da TcSBOS se comporta como um fragmento de proteína intrinsicamente desenovelado, responsável pela interação da TcSBOS com RNA, verificada por ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Também foi realizada a determinação da estrutura da ortóloga humana (HsSBOS) em solução por espectroscopia de RMN. A proteína HsSBOS é composta de três domínios bem estruturados, apresentando mobilidade conformacional entre os domínios N-terminal e central. Experimentos de titulação de RNA, novamente utilizando-se RMN, possibilitaram a confirmação da interação direta da SBOS humana com RNA. A região de ligação ao RNA foi identificada no N-terminal da proteína, região bastante conservada na família e considerada o principal alvo das mutações relacionadas à doença SDS / Abstract: The Shwachman-Bodian-Oiamond syndrome (SBOS) protein family occurs widely in nature and is highly conserved, with orthologues in Archaea and eukaryotes. Genomic and biophysical studies have suggested involvement of this protein in RNA metabolism and in ribosome biogenesis. Archaeal SBOS orthologue genes are located within highly conserved operons that include RNA-processing genes; transcriptional profiling analysis has clustered the yeast ortholog protein Sdo 1 p with rRNA processing factors and proteomic analysis have identified potential interactions between Sd01 p and ribosome biogenesis factors; several plant SBOS orthologues contain extended C-terminal region with putative RNA binding motif. Mutations in the SBDS gene are associated to the Shwachman-Oiamond syndrome (SOS), arare multisystem disorder characterized by exocrine pancreatic insufficiency, bone marrow dysfunction, and an increased risk of acute myeloid leukemia. SOS therefore represents an extremely useful model for understanding leukaemogenesis. The objective of the present work was the structural and functional characterization of the SBOS protein family. SBOS orthologues from Archaea, yeast, trypanosomatid and human were assayed for crystallization. The Archaeal SBOS orthologue, PaUPF0023 in Pyrococcus abyssi, was crystallized, but the crystals 'diffracted to a relatively low resolution (3.50 A). Characterization of the Trypanosoma cruzi SBOS ortholog (TcSBOS) by using limited proteolysis, circular dichroism and NMR analyses indicated that the C-terminal additional region of TcSBOS behaves as a natively unfolded protein segment, responsible for TcSBOS-RNA interaction activity in electrophoretic mobility shift assays. We have also determined the solution structure and backbone dynamics of the human SBOS protein using NMR spectroscopy. The overall structure of human SBOS comprises three well-folded domains with conformational exchange in the linker between the N-terminal and the central domains. RNA titration experiments using NMR spectroscopy provide evidence that human SBOS interacts with RNA via the N-terminal domain, a conserved region in the SBOS family and the most frequent target for SOSassociated mutations / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular