A Mata Atlântica brasileira, atualmente, está reduzida a pequenos fragmentos florestais protegidos em unidades de conservação, que representam apenas 7,6% de sua área original. O Parque Estadual da Serra do Mar (PESM), localizado no estado de São Paulo é a maior área de proteção integral deste bioma do litoral brasileiro. A superfície da folha de árvore (filosfera) oferece uma grande área de habitat para os micro-organismos, mas constitui um ambiente extremo. O desenvolvimento de comunidades microbianas é dependente de fonte de carbono e de nutrientes essenciais inorgânicos comumente liberados pela planta para a sua superfície. No entanto, um grupo especial de bactérias, Cyanobacteria, é menos dependente da planta para sua nutrição, pois estes organismos são autotróficos para carbono e nitrogênio. Portanto, Cyanobacteria é particularmente interessante para se avaliar neste ambiente. Neste estudo, a comunidade de cianobactérias colonizadoras das filosferas de uma área de conservação (PESM) da floresta ombrófila densa foi avaliada usando abordagens moleculares independente de cultivo. O DNA genômico de cianobactérias foi extraído da superfície de folhas das árvores Euterpe edulis e Guapira opposita de dois locais dentro do Parque, ou seja, núcleo de Picinguaba próximo ao nível do mar e núcleo Santa Virgínia a 800 metros de altitude. Além disso, as superfícies de folhas de Garcinia gardneriana encontrada apenas no núcleo de Picinguaba e de Merostachys neesii encontrada somente no núcleo de Santa Virgínia foram avaliadas. As análises da estrutura da comunidade de cianobactérias por PCR-DGGE mostraram que a colonização é dependente das espécies de plantas e independente das localizações das plantas. A análise da composição da comunidade de cianobactérias na superfície das folhas baseada nas bibliotecas de clones de RNAr 16S revelou que dentre um total de 980 clones obtidos, 22% deles pertenciam a 10 gêneros conhecidos. Cerca de 78% dos clones restantes foram filotipos de cianobactérias não cultivadas. As coberturas das bibliotecas de clones de RNAr 16S variaram de 70 a 85%, e as curvas de rarefação (a 5% distância evolutiva) indicaram um bom suporte para esses dados. Após o alinhamento das seqüências, 384 UTOs foram geradas, sendo 257 UTOs de sequências únicas, sugerindo que as filosferas avaliadas têm alta riqueza e diversidade. A comparação da comunidade de cianobactérias entre as filosferas (b-diversidade), utilizando a ferramenta estatística -libshuff, mostrou que estes ambientes abrigam táxons distintos em seu filoplano, em concordância com os dados de PCR-DGGE. A predominância de sequências de RNAr 16S das ordens Nostocales e Synechococcales foi observada dentre as cianobactérias descritas. Entre essas, um número elevado de sequências relacionadas com gêneros capazes de fixar N2 foram encontradas. As espécies G. opposita e E. edulis em Santa Virgínia e E. edulis em Picinguaba apresentaram níveis elevados de índice de diversidade de Simpson (0,01), enquanto M. neesii teve o maior índice de riqueza ACE (405,1 ± 139,24). A quantificação de cianobactérias utilizando PCR em tempo real também mostrou que M. neesii é a espécie de planta com maior número de cópias de RNAr 16S por cm2 de folha. Os resultados deste estudo mostraram que as cianobactérias da filosfera desse ecossistema de floresta tropical são influenciadas pelas espécies de plantas e um número elevado de táxons permanecem por ser descritos. / The Brazilian Atlantic rainforest currently is reduced to small forest fragments protected in conservation units, representing only 7.6% of its original area. The Serra do Mar State Park (SMSP) located in São Paulo state is the largest fully protected area of this biome in the Brazilian coast. The plant leaf surface (phyllosphere) offer a large habitat area for microorganisms but constitute rather an extreme environment. The development of microbial communities is dependent of carbon source and certain essential inorganic nutrients commonly released from the plant to its surface. However, a special group of bacteria, Cyanobacteria, is less dependent of the plant for their nutrition since these organisms are autotrophic for carbon and nitrogen. Therefore, cyanobacteria are particularly interesting to be evaluated in this environment. In this study, the cyanobacteria community colonizing phyllospheres in a protected conservation area of the ombrophilous dense rainforest of SMSP was assessed using cultivation-independent molecular approaches. Cyanobacteria genomic DNA were extracted from surface leaves of the Euterpe edulis and Guapira opposita trees of two locations inside of the Park, i.e., Picinguaba nucleus close to the sea level and Santa Virginia nucleus at 800 meters of altitude. Also, surface leaves of Garcinia gardneriana found only in the Picinguaba nucleus and Merostachys neesii found only in Santa Virginia nucleus were evaluated. The analyses of cyanobacterial community structure by PCR-DGGE showed that colonization is dependent of the plant species and independent of plants locations. The analysis of composition of cyanobacterial community in the surface leaves based on16S rRNA clones libraries revealed that among a total of 980 clones obtained, 22% of them belonged to 10 known genera. About 78% of the remaining clones were uncultured cyanobacteria phylotypes. The 16S rRNA clone libraries coverage ranged from 70 to 85%, and the rarefaction curves (at 5% evolutionary distance) indicated a good support for these data. After sequences alignment, 384 OTUs were generated, with 257 OTUs of them being unique sequences, suggesting that the phyllospheres evaluated have high richness and diversity. Comparison of cyanobacterial community among the phyllospheres (b-diversity) using statistical -libshuff tool, showed that these environments harbor distinct taxa in their phylloplane, in agreement to PCRDGGE data. A predominance of 16S rRNA sequences of the orders Nostocales and Synechococcales was observed within the known cyanobacteria. Among those, a high number of sequences related with genera capable to fix N2 were found. The species G. opposita and E. edulis located in Santa Virginia and E. edulis in Picinguaba showed high levels of Simpson diversity index (0.01), while M. neesii had the highest ACE richness index (405.1 ± 139.24). The cyanobacterial quantification using real time PCR also showed that M. neesii is the plant species with the highest number of copies of 16S rRNA per cm2 of leaf. The results of this study showed that phyllosphere cyanobacteria in this rainforest ecosystem are influenced by plant species and a high number of taxa remaining to be described.

A Mata Atlântica brasileira, atualmente, está reduzida a pequenos fragmentos florestais protegidos em unidades de conservação, que representam apenas 7,6% de sua área original. O Parque Estadual da Serra do Mar (PESM), localizado no estado de São Paulo é a maior área de proteção integral deste bioma do litoral brasileiro. A superfície da folha de árvore (filosfera) oferece uma grande área de habitat para os micro-organismos, mas constitui um ambiente extremo. O desenvolvimento de comunidades microbianas é dependente de fonte de carbono e de nutrientes essenciais inorgânicos comumente liberados pela planta para a sua superfície. No entanto, um grupo especial de bactérias, Cyanobacteria, é menos dependente da planta para sua nutrição, pois estes organismos são autotróficos para carbono e nitrogênio. Portanto, Cyanobacteria é particularmente interessante para se avaliar neste ambiente. Neste estudo, a comunidade de cianobactérias colonizadoras das filosferas de uma área de conservação (PESM) da floresta ombrófila densa foi avaliada usando abordagens moleculares independente de cultivo. O DNA genômico de cianobactérias foi extraído da superfície de folhas das árvores Euterpe edulis e Guapira opposita de dois locais dentro do Parque, ou seja, núcleo de Picinguaba próximo ao nível do mar e núcleo Santa Virgínia a 800 metros de altitude. Além disso, as superfícies de folhas de Garcinia gardneriana encontrada apenas no núcleo de Picinguaba e de Merostachys neesii encontrada somente no núcleo de Santa Virgínia foram avaliadas. As análises da estrutura da comunidade de cianobactérias por PCR-DGGE mostraram que a colonização é dependente das espécies de plantas e independente das localizações das plantas. A análise da composição da comunidade de cianobactérias na superfície das folhas baseada nas bibliotecas de clones de RNAr 16S revelou que dentre um total de 980 clones obtidos, 22% deles pertenciam a 10 gêneros conhecidos. Cerca de 78% dos clones restantes foram filotipos de cianobactérias não cultivadas. As coberturas das bibliotecas de clones de RNAr 16S variaram de 70 a 85%, e as curvas de rarefação (a 5% distância evolutiva) indicaram um bom suporte para esses dados. Após o alinhamento das seqüências, 384 UTOs foram geradas, sendo 257 UTOs de sequências únicas, sugerindo que as filosferas avaliadas têm alta riqueza e diversidade. A comparação da comunidade de cianobactérias entre as filosferas (b-diversidade), utilizando a ferramenta estatística -libshuff, mostrou que estes ambientes abrigam táxons distintos em seu filoplano, em concordância com os dados de PCR-DGGE. A predominância de sequências de RNAr 16S das ordens Nostocales e Synechococcales foi observada dentre as cianobactérias descritas. Entre essas, um número elevado de sequências relacionadas com gêneros capazes de fixar N2 foram encontradas. As espécies G. opposita e E. edulis em Santa Virgínia e E. edulis em Picinguaba apresentaram níveis elevados de índice de diversidade de Simpson (0,01), enquanto M. neesii teve o maior índice de riqueza ACE (405,1 ± 139,24). A quantificação de cianobactérias utilizando PCR em tempo real também mostrou que M. neesii é a espécie de planta com maior número de cópias de RNAr 16S por cm2 de folha. Os resultados deste estudo mostraram que as cianobactérias da filosfera desse ecossistema de floresta tropical são influenciadas pelas espécies de plantas e um número elevado de táxons permanecem por ser descritos. / The Brazilian Atlantic rainforest currently is reduced to small forest fragments protected in conservation units, representing only 7.6% of its original area. The Serra do Mar State Park (SMSP) located in São Paulo state is the largest fully protected area of this biome in the Brazilian coast. The plant leaf surface (phyllosphere) offer a large habitat area for microorganisms but constitute rather an extreme environment. The development of microbial communities is dependent of carbon source and certain essential inorganic nutrients commonly released from the plant to its surface. However, a special group of bacteria, Cyanobacteria, is less dependent of the plant for their nutrition since these organisms are autotrophic for carbon and nitrogen. Therefore, cyanobacteria are particularly interesting to be evaluated in this environment. In this study, the cyanobacteria community colonizing phyllospheres in a protected conservation area of the ombrophilous dense rainforest of SMSP was assessed using cultivation-independent molecular approaches. Cyanobacteria genomic DNA were extracted from surface leaves of the Euterpe edulis and Guapira opposita trees of two locations inside of the Park, i.e., Picinguaba nucleus close to the sea level and Santa Virginia nucleus at 800 meters of altitude. Also, surface leaves of Garcinia gardneriana found only in the Picinguaba nucleus and Merostachys neesii found only in Santa Virginia nucleus were evaluated. The analyses of cyanobacterial community structure by PCR-DGGE showed that colonization is dependent of the plant species and independent of plants locations. The analysis of composition of cyanobacterial community in the surface leaves based on16S rRNA clones libraries revealed that among a total of 980 clones obtained, 22% of them belonged to 10 known genera. About 78% of the remaining clones were uncultured cyanobacteria phylotypes. The 16S rRNA clone libraries coverage ranged from 70 to 85%, and the rarefaction curves (at 5% evolutionary distance) indicated a good support for these data. After sequences alignment, 384 OTUs were generated, with 257 OTUs of them being unique sequences, suggesting that the phyllospheres evaluated have high richness and diversity. Comparison of cyanobacterial community among the phyllospheres (b-diversity) using statistical -libshuff tool, showed that these environments harbor distinct taxa in their phylloplane, in agreement to PCRDGGE data. A predominance of 16S rRNA sequences of the orders Nostocales and Synechococcales was observed within the known cyanobacteria. Among those, a high number of sequences related with genera capable to fix N2 were found. The species G. opposita and E. edulis located in Santa Virginia and E. edulis in Picinguaba showed high levels of Simpson diversity index (0.01), while M. neesii had the highest ACE richness index (405.1 ± 139.24). The cyanobacterial quantification using real time PCR also showed that M. neesii is the plant species with the highest number of copies of 16S rRNA per cm2 of leaf. The results of this study showed that phyllosphere cyanobacteria in this rainforest ecosystem are influenced by plant species and a high number of taxa remaining to be described.

Orientador: Valéria Maia Merzel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_TiagoRodriguese_M.pdf: 5632148 bytes, checksum: 82526f541aaf1c9b32cf5fbca6bc03aa (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos realizados em reservatórios de petróleo têm evidenciado que parte da microbiota associada a este tipo de ambiente é representada por bactérias e arqueias de distribuição geográfica bastante ampla e que diversos destes organismos têm potencial para transformar compostos orgânicos e inorgânicos, atuando na interface óleo-água dos reservatórios. A investigação de micro-organismos com potencial para biodeterioração, biodegradação e biocorrosão encontrados em depósitos petrolíferos é de grande importância, uma vez que estes organismos podem estar relacionados com a perda da qualidade do petróleo nos reservatórios e etapas subseqüentes de exploração. Este estudo teve como finalidade comparar a microbiota presente em amostras de óleo de dois poços de petróleo terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado). As comunidades microbianas foram estudadas usando técnicas de cultivo (enriquecimentos microbianos e isolamento) e independentes de cultivo (construção de bibliotecas de genes RNAr 16S). Os micro-organismos cultivados de ambos os poços mostraram-se afiliados aos filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria. As bibliotecas de gene RNAr 16S foram construídas a partir de DNA total extraído do petróleo bruto. Ambas as bibliotecas de bactérias revelaram uma grande diversidade, com 8 filos diferentes para o poço GMR75, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Spirochaetes, Firmicutes, Proteobacteria, Thermotoga e Synergistetes, e 5 filos para o poço PTS1, Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria e Thermotogae. A biblioteca de genes RNAr 16S de arqueias só foi obtida para o poço GMR75 e todos os clones encontrados mostraram-se relacionados a membros da ordem Methanobacteriales. Os resultados de diversidade sugerem que a metanogênese é o processo terminal dominante no poço, o que indica uma biodegradação anaeróbia. A comparação dos estudos dependente e independente de cultivo mostrou que alguns gêneros, como Janibacter, Georgenia, Saccharopolyspora, Tessaracoccus, Brevundimonas e Brachymonas não foram encontradas na abordagem independente de cultivo, sugerindo que mais clones devam ser seqüenciados para cobrir toda a diversidade presente na amostra. Nossa hipótese de que poderia haver algum agente antimicrobiano inibindo o crescimento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos no poço não-biodegradado não foi confirmada. No entanto, durante os testes realizados, uma bactéria, Bacillus pumilus, isolada em estudos anteriores de reservatórios da Bacia de Campos, apresentou resultados positivos de inibição para todas as linhagens testadas como indicadoras, e os testes de caracterização do composto revelaram ser este um diterpeno da classe das Ciatinas. / Abstract: Recent studies from oil fields have shown that microbial diversity is represented by bacteria and archaea of wide distribution, and that many of these organisms have potential to metabolize organic and inorganic compounds. The potential of biodeterioration, biodegradation and biocorrosion by microorganisms in oil industry is of great relevance, since these organisms may be related with the loss of petroleum quality and further exploration steps. The aim of the present study was to compare the microbial communities present in two samples from terrestrial oil fields from Potiguar basin (RN - Brazil), identified as GMR75 (biodegraded oil) and PTS1 (non-biodegraded oil). Microbial communities were investigated using cultivation (microbial enrichments and isolation) and molecular approaches (16S rRNA gene clone libraries). The cultivated microorganisms recovered from both oil-fields were affiliated with the phyla Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria. The 16S rRNA gene clone libraries were constructed from metagenomic DNA obtained from crudeoil. Both bacterial libraries revealed a great diversity, encompassing representatives of 8 different phyla for GMR75, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Spirochaetes, Firmicutes, Proteobacteria, Thermotogae and Synergistetes, and of 5 different phyla, Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria and Thermotoga, for PTS1. The archaeal 16S rRNA clone library was obtained only for GMR75 oil and all phylotypes were affiliated with order Methanobacteriales. Diversity resuts suggest that methanogenesis is the dominant terminal process in GMR75 reservoir, driven by anaerobic biodegradation. The cross-evaluation of culture-dependent and independent techniques indicates that some bacterial genera, such as Janibacter, Georgenia, Saccharopolyspora, Tessaracoccus, Brevundimonas and Brachymonas, were not found using the the 16S rRNA clone library approach, suggesting that additional clones should be sequenced in order to cover diversity present in the sample. Our hypothesis that biodegrading bacterial populations could be inhibited by antimicrobialproducing microorganisms in the non biodegraded oil field (PTS1) was not confirmed. However, one Bacillus pumilus strain, previously isolated from Campos Basin reservoirs, showed positive results in inhibitory tests for all indicator strains. Chemical analyses allowed us to identify the compound as a diterpen from the Cyathin class. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular