Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Valéria Maia Merzel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:58:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_TiagoRodriguese_M.pdf: 5632148 bytes, checksum: 82526f541aaf1c9b32cf5fbca6bc03aa (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Estudos realizados em reservatórios de petróleo têm evidenciado que parte da microbiota associada a este tipo de ambiente é representada por bactérias e arqueias de distribuição geográfica bastante ampla e que diversos destes organismos têm potencial para transformar compostos orgânicos e inorgânicos, atuando na interface óleo-água dos reservatórios. A investigação de micro-organismos com potencial para biodeterioração, biodegradação e biocorrosão encontrados em depósitos petrolíferos é de grande importância, uma vez que estes organismos podem estar relacionados com a perda da qualidade do petróleo nos reservatórios e etapas subseqüentes de exploração. Este estudo teve como finalidade comparar a microbiota presente em amostras de óleo de dois poços de petróleo terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado). As comunidades microbianas foram estudadas usando técnicas de cultivo (enriquecimentos microbianos e isolamento) e independentes de cultivo (construção de bibliotecas de genes RNAr 16S). Os micro-organismos cultivados de ambos os poços mostraram-se afiliados aos filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria. As bibliotecas de gene RNAr 16S foram construídas a partir de DNA total extraído do petróleo bruto. Ambas as bibliotecas de bactérias revelaram uma grande diversidade, com 8 filos diferentes para o poço GMR75, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Spirochaetes, Firmicutes, Proteobacteria, Thermotoga e Synergistetes, e 5 filos para o poço PTS1, Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria e Thermotogae. A biblioteca de genes RNAr 16S de arqueias só foi obtida para o poço GMR75 e todos os clones encontrados mostraram-se relacionados a membros da ordem Methanobacteriales. Os resultados de diversidade sugerem que a metanogênese é o processo terminal dominante no poço, o que indica uma biodegradação anaeróbia. A comparação dos estudos dependente e independente de cultivo mostrou que alguns gêneros, como Janibacter, Georgenia, Saccharopolyspora, Tessaracoccus, Brevundimonas e Brachymonas não foram encontradas na abordagem independente de cultivo, sugerindo que mais clones devam ser seqüenciados para cobrir toda a diversidade presente na amostra. Nossa hipótese de que poderia haver algum agente antimicrobiano inibindo o crescimento de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos no poço não-biodegradado não foi confirmada. No entanto, durante os testes realizados, uma bactéria, Bacillus pumilus, isolada em estudos anteriores de reservatórios da Bacia de Campos, apresentou resultados positivos de inibição para todas as linhagens testadas como indicadoras, e os testes de caracterização do composto revelaram ser este um diterpeno da classe das Ciatinas. / Abstract: Recent studies from oil fields have shown that microbial diversity is represented by bacteria and archaea of wide distribution, and that many of these organisms have potential to metabolize organic and inorganic compounds. The potential of biodeterioration, biodegradation and biocorrosion by microorganisms in oil industry is of great relevance, since these organisms may be related with the loss of petroleum quality and further exploration steps. The aim of the present study was to compare the microbial communities present in two samples from terrestrial oil fields from Potiguar basin (RN - Brazil), identified as GMR75 (biodegraded oil) and PTS1 (non-biodegraded oil). Microbial communities were investigated using cultivation (microbial enrichments and isolation) and molecular approaches (16S rRNA gene clone libraries). The cultivated microorganisms recovered from both oil-fields were affiliated with the phyla Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria. The 16S rRNA gene clone libraries were constructed from metagenomic DNA obtained from crudeoil. Both bacterial libraries revealed a great diversity, encompassing representatives of 8 different phyla for GMR75, Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Spirochaetes, Firmicutes, Proteobacteria, Thermotogae and Synergistetes, and of 5 different phyla, Actinobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Proteobacteria and Thermotoga, for PTS1. The archaeal 16S rRNA clone library was obtained only for GMR75 oil and all phylotypes were affiliated with order Methanobacteriales. Diversity resuts suggest that methanogenesis is the dominant terminal process in GMR75 reservoir, driven by anaerobic biodegradation. The cross-evaluation of culture-dependent and independent techniques indicates that some bacterial genera, such as Janibacter, Georgenia, Saccharopolyspora, Tessaracoccus, Brevundimonas and Brachymonas, were not found using the the 16S rRNA clone library approach, suggesting that additional clones should be sequenced in order to cover diversity present in the sample. Our hypothesis that biodegrading bacterial populations could be inhibited by antimicrobialproducing microorganisms in the non biodegraded oil field (PTS1) was not confirmed. However, one Bacillus pumilus strain, previously isolated from Campos Basin reservoirs, showed positive results in inhibitory tests for all indicator strains. Chemical analyses allowed us to identify the compound as a diterpen from the Cyathin class. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular