Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 163-178).

Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

Orientador: Valéria Maia Merzel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-28T00:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Belgini_DaianeRodriguesBarbosa_M.pdf: 4350336 bytes, checksum: 998807ac1631e5c151a33202b7d5f9a0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Com o intuito de otimizar o consumo de água do meio ambiente, o reuso de efluentes têm sido cada vez mais empregado. Dentre as diferentes tecnologias utilizadas no tratamento de efluentes para reuso, os sistemas de osmose inversa se destacam por oferecer vantagens como: economia, alta produtividade e alta eficiência na remoção de sais. Entretanto, estes sistemas estão constantemente sujeitos à contaminação por micro-organismos, o que leva à perda da eficiência e aumento nos custos operacionais e de manutenção. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo a caracterização da diversidade bacteriana de um sistema de membranas de osmose inversa que trata efluente de uma refinaria de petróleo, a fim de determinar quais são os micro-organismos relacionados com a formação de biofilme. A diversidade planctônica do sistema, i.e., água de alimentação, foi analisada através de plaqueamento e cultivo e de bibliotecas de genes RNA ribossomal 16S. A diversidade bacteriana associada às membranas foi analisada através de fingerprinting genético (DGGE ¿ Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e construção de bibliotecas de genes ribossomais 16S. A partir das amostras de água de alimentação, foram obtidos 37 isolados bacterianos e 211 clones. A análise das membranas foi realizada através do sequenciamento e identificação de 13 bandas excisadas a partir do fingerprinting genético, assim como pela construção de duas bibliotecas gênicas, com 73 e 57 clones cada uma. Dentre os gêneros encontrados nas diferentes amostras, os mais representativos e com potencial para formação inicial de biofilmes foram: Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium e Sphingopyxis. De acordo com a literatura, alguns destes gêneros são constantemente encontrados em sistemas aquáticos e são importantes na formação inicial de biofilmes em sistemas de osmose inversa. O conhecimento da diversidade de micro-organismos presentes nestes sistemas fornece subsídios para entender a dinâmica e os mecanismos de formação de biofilmes na superfície de membranas, permitindo o o desenvolvimento de estratégias de controle e remoção mais específicas / Abstract: In order to reduce the environmental water consumption, reuse of wastewater has been increasingly employed. Among the different technologies used in the treatment of wastewater for reuse, reverse osmosis system stands out because of its advantages such as economy, high productivity and high efficiency in the removal of salts. However, these systems are constantly subjected to contamination by microorganisms, which causes loss of efficiency and increase in operating and maintenance costs. In this context, this study aims to characterize the bacterial diversity of a reverse osmosis membrane system treating effluent of an oil refinery in order to determine which are the microorganisms related to biofilm formation. The planktonic diversity of the system, i.e. feed water, was analyzed by cultivation techniques and 16S ribosomal gene clone libraries. Bacterial diversity associated with membranes was analyzed through genetic fingerprinting (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) and the construction of 16S ribosomal gene libraries. Approximately 37 isolates and 211 clones were obtained from the feed water samples. Analysis of the membranes was performed by sequencing and identification of 13 excised bands from DGGE gel, as well as the construction of two 16S rRNA gene libraries. Among the genera found in the samples, the most representative and with potential to initial biofilm formation were Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium and Sphingopyxis. According to the literature, some of these genera are constantly found in aquatic systems and are important in the initial formation of biofilms in reverse osmosis systems. Knowledge of the diversity of microorganisms in these systems provides subsidies to understand the dynamics and mechanisms of biofilm formation on the surface of membranes, allowing further development of control and more specific removal strategies / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

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Deep sequencing of strand-specific cDNA libraries is now a ubiquitous tool for identifying and quantifying RNAs in diverse sample types. The accuracy of conclusions drawn from these analyses depends on precise and quantitative conversion of the RNA sample into a DNA library suitable for sequencing. Here, we describe an optimized method of preparing strand-specific RNA deep sequencing libraries from small RNAs and variably sized RNA fragments obtained from ribonucleoprotein particle footprinting experiments or fragmentation of long RNAs. Because all enzymatic reactions were optimized and driven to apparent completion, sequence diversity and species abundance in the input sample are well preserved. This optimized method was used in an adapted ribosome-profiling approach to sequence mRNA footprints protected either by 80S monosomes or polysomes in S. cerevisiae. Contrary to popular belief, we show that 80S monosomes are translationally active as demonstrated by strong three-nucleotide phasing of monosome footprints across open reading frames. Most mRNAs exhibit some degree of monosome occupancy, with monosomes predominating on upstream ORFs, canonical ORFs shorter than ~590 nucleotides and any ORF for which the total time required to complete elongation is substantially shorter than the time required for initiation. Additionally, endogenous NMD targets tend to be monosome-enriched. Thus, rather than being inactive, 80S monosomes are significant contributors to overall cellular translation.

The three dimensional structure of the human genome is known to play a critical role in gene function and expression. I used chromosome conformation capture (3C) and 3C-carbon copy (5C) techniques to investigate the three-dimensional structure of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) locus. This is an important disease gene that, when mutated, causes cystic fibrosis. 3C experiments identified four distinct looping elements that contact the CFTR gene promoter only in CFTR-expressing cells. Using 5C, I expanded the region of study to a 2.8 Mb region surrounding the CFTR gene. The 5C study shows 7 clear topologically associating domains (TADs) present at the locus, identical in all five cell lines tested, regardless of gene expression status. CFTR and all its known regulatory elements are contained within one TAD, suggesting TADs play a role in constraining promoters to a local search space. The four looping elements identified in the 3C experiment and confirmed in the 5C experiment were then tested for enhancer activity using a luciferase assay, which showed that elements III and IV could act as enhancers. These elements were tested against a library of human transcription factors in a yeast one-hybrid assay to identify potential binding proteins. Element III gave two strong candidates, TCF4 and LEF1. A literature search supported these transcription factors as playing a role in CFTR gene expression. Overall, this work represents a model locus that can be used to test important questions regarding the role of three dimensional looping on gene expression.