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INHIBITING HEPATITIS B VIRUS GENE EXPRESSION WITH HAMMERHEAD RIBOZYMES THAT TARGET THE HBx OPEN READING FRAMEWeinberg, Marc Saul 28 October 2002 (has links)
A thesis submitted to the Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of the requirements for the
degree of
Doctor of Philosophy
Johannesburg, 2002 / Hepatitis B virus (HBV) infection is endemic to several populous regions and is often complicated by cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Present treatment of chronic HBV infection is usually ineffective and novel therapeutic approaches are an important medical objective. The X open reading frame (ORF) of HBV, HBx, is a conserved sequence that overlaps with the polymerase ORF and viral c/'s-elements, and is present within all viral transcripts. In addition, the HBx ORF encodes a 17 kDa transactivator protein, HBx, which is required for the establishment of viral infection and has been implicated in HBV-associated hepatocarcinogenesis. The HBx sequence thus represents a compelling target for applying nucleic acid hybridisation-based therapeutic agents for the inhibition of HBV gene expression and replication. / IT2018
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Model systems for gene inhibition by the hammerhead ribozyme in yeast and bacteriaChen, Hui 02 1900 (has links)
Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le ribozyme "hammerhead" ou "en tête de marteau" appartient à une classe d'ARN catalytiques qui fut découverte pour la première fois chez certains viroïdes de plantes. Le ribozyme hammerhead peut spécifiquement reconnaître et cliver des ARN cibles par simple appariement des paires de bases entre le substrat et le ribozyme. Cela le rend un candidat attirant pour inactiver l'expression de gènes spécifiques in vivo. Cependant, dans le but d'utiliser ce ribozyme comme un agent antiviral et anticancer, il est important d'augmenter l'efficacité et la reproductibilité de son activité in vivo.
Dans ce projet, nous utilisons Escherichia coli comme système modèle pour étudier l'effet de facteurs cellulaires sur l'activité du ribozyme in vivo. Il a été proposé que le couplage des processus de transcription et de traduction chez les bactéries pouvait limiter l'accès du ribozyme à sa séquence cible. Nous avons évalué l'inhibition du gène de la chloramphénicol acétyle transférase (CAT), codé sur un plasmide, par le ribozyme hammerhead chez E. coli dans des conditions où la transcription et la traduction ont été découplées soit par une augmentation de la vitesse de transcription, soit par une réduction de la vitesse de traduction. Dans une souche mutante de E. coli où la vitesse de traduction est réduite à 5.6 a.a./sec (la vitesse normale est de 15 a.a./sec), nous avons trouvé que l'activité de la CAT et le niveau d'ARNm de la CAT étaient réduits de près de 60%, alors que la présence d'un ribozyme n'avait aucun effet sur l'activité de la CAT dans une souche sauvage de E. coli. L'addition de streptomycine dans le milieu de culture, qui augmente la vitesse de traduction dans la souche mutante, rétablit la pleine activité de la CAT.
Pour pousser plus loin l'idée que la souche à ribosomes lents facilite l'activité du ribozyme, nous avons incorporé le gène de la CAT dans le génome des souches sauvage et mutante. Dans ce cas, l'activité du ribozyme était détectable dans la souche sauvage et elle était grandement augmentée dans la souche à ribosomes lents. D'autre part, l'expression du gène de la CAT avec un promoteur de l'ARN polymérase T7, ce qui augmente la vitesse de transcription de ce gène, n'est pas affectée par le ribozyme hammerhead. Puisque la rapidité de l'ARN polymérase T7 devrait dissocier la transcription de la traduction, la dissociation de ces processus n'est donc pas une condition suffisante pour augmenter l'activité du ribozyme in vivo.
Pour tester l'hypothèse que la vitesse de traduction pourrait affecter l'activité du ribozyme, nous avons testé trois ribozymes dirigés contre différentes régions de l'ARNm de la CAT. Nous avons trouvé que les trois possèdent des activités similaires. Il semble donc que l'accessibilité des régions 5' et 3' de l'ARNm de la CAT soit équivalente pour les ribozymes. Nous avons aussi utilisé d'autres stratégies pour ralentir la vitesse de traduction, soit l'insertion de codons à faible usage dans le gène de la CAT et la mutation de la séquence Shine-Dalgarno du gène de la CAT. Cependant, aucune de ces stratégies n'augmente l'activité du ribozyme. Ainsi, une vitesse inférieure de traduction ne peut expliquer l'amélioration de l'activité du ribozyme dans la souche à ribosomes lents.
Nos résultats suggèrent qu'un facteur cellulaire inconnu affecte l'activité du ribozyme in vivo. À savoir si l'allèle mutant dans la souche à ribosomes lents, le gène S12, et son activité de chaperonne pourrait être impliqué est maintenant sujet de plus amples travaux. Ce système bactérien offre une fenêtre unique pour l'étude des facteurs cellulaires pouvant affecter l'activité des ribozymes in vivo.
Nous avons aussi été impliqués dans l'étude d'ARN catalytiques dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) dans l'espoir de comprendre comment l'environnement cellulaire de la levure affecte la fonction d'un ARN catalytique. Il a été démontré au Chapitre IV que l'activité de clivage d'un ribozyme peut être détectée par une nouvelle technique, le PCR dépendant de la ligation d'un ARN, quand le gène cible ADE1 est exprimé en cis du ribozyme, mais aucune activité en trans n'a pu être détectée dans ce même système. Ceci peut suggérer que l'association du ribozyme avec sa cible ainsi que l'activité catalytique du ribozyme sont plus lentes que le métabolisme des ARN dans la levure. Au Chapitre V, ceci a été démontré par l'arrêt du cycle cellulaire de la levure par trois différents traitements permettant une pause des cellules en phase G1, ce qui ralentit le métabolisme des ARNm. Dans ce cas, l'activité du ribozyme hammerhead dans la levure est détectée par l'évaluation directe de la concentration de l'ARNm de ADE1. Ces résultats indiquent que l'activité du ribozyme est influencée par l'environnement cellulaire.
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Adaptations de la méthode de purification d’ARN par affinité avec l’étiquette ARiBoSalvail-Lacoste, Alix 08 1900 (has links)
Dans les dernières années, une explosion de la recherche sur les ARN a eu lieue à cause de nombreuses découvertes démontrant l’importance de l’ARN dans plusieurs processus biologiques. Ainsi, de grandes quantités d’ARN sont devenues indispensables au bon déroulement de plusieurs études, notamment pour la biologie structurale et la caractérisation fonctionnelle. Cependant, il existe encore peu de méthodes de purification simples, efficaces, fiables et produisant un ARN sous forme native. Dans les dernières années, le laboratoire Legault a mis au point une méthode de purification par affinité utilisant une étiquette ARiBo pour la purification d’ARN transcrits in vitro par la polymérase à ARN du phage T7. Cette méthode de purification d’ARN a été spécifiquement développée pour maximiser la pureté et le rendement. De plus, elle est très rapide et fonctionne avec plusieurs types d’ARN. Cependant, comme plusieurs autres méthodes de purification, cette méthode produit des ARN avec des extrémités 5′ hétérogènes. Dans ce mémoire, des solutions sont proposées pour remédier au problème d’hétérogénéité en 5ʹ′ des ARN transcrits avec la polymérase à ARN du phage T7 et purifiés par la méthode ARiBo. La première solution consiste à choisir la séquence en 5′ parmi celles des 32 séquences testées qui ne présentent pas d’hétérogénéité en 5ʹ′. La seconde solution est d’utiliser une étiquette clivable en 5ʹ′ de l’ARN d’intérêt, tel que le ribozyme hammerhead, déjà utilisée pour ce genre d’application, ou le système CRISPR/Cse3 que nous proposons dans l’article présenté dans ce mémoire. De plus, nous avons adapté la méthode ARiBo pour rendre possible la purification d’un long ARN de 614 nt, le polycistron miR-106b-25. Nous avons également démontré la possibilité d’utiliser la méthode ARiBo pour l’isolation de protéines qui se lient à un ARN donné, le précurseur de miRNA pre-miR-153-2. En conclusion, ce mémoire démontre la possibilité d’adapter la méthode ARiBo à plusieurs applications. / In recent years, the field of RNA research has exploded due to several discoveries demonstrating the importance of RNA in many biological processes. Along with the increased interest in this field, large amounts of RNA have become essential to the success of several studies, in particular for structural biology and functional characterization. However, there are still very few native purification methods that are simple, efficient and reliable. In the past few years, the Legault laboratory has established an affinity purification method using an ARiBo tag to purify RNAs produced by in vitro transcription with the T7 RNA polymerase. This RNA purification method was specifically developed to maximise purity and yield. In addition, this method is fast and works with several types of RNAs. However, like several other purification methods, this method produces RNAs with 5' heterogeneity. This Master’s thesis propose solutions to overcome the problem of 5' heterogeneity for RNAs transcribed with the T7 RNA polymerase and purified with the ARiBo method. The first solution proposed is to choose a 5' sequence among those of the 32 sequences tested that do not present 5'- heterogeneity. The other possibility is the use of a cleavable tag at the 5'-end of the RNA of interest, such as the hammerhead ribozyme, already used for this purpose or the CRISPR/Cse3 system, which is presented here. Furthermore, we have adapted the ARiBo method to purify an RNA of 614 nt, the miRNAs cluster miR- 106b-25. We also demonstrate the possibility to use the ARiBo method to isolate proteins that bind a given RNA, the miRNA precursor pre-miR-153-2. In conclusion, this Master’s thesis demonstrates the possibility of adapting the ARiBo method for several applications.
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