Lipids carry out important structural as well as signaling functions in the cell. In recent years, enzymes that metabolize lipids have been emerging as key regulators of basic cellular functions and developmental processes. In order to study metabolism of lipids, we have focused our research on a class of proteins: the cytochrome P450s (CYPs), which are involved in lipid production in many organisms. We have used C. elegans, a classical genetic model system, to investigate lipid metabolism because this nematode offers several technical advantages that render it suitable for our investigations. The aim of our project was to identify and characterize essential lipids for the development of worms. We have performed RNAi (RNA interference) against C. elegans CYP31A, and found that silencing of this enzyme leads to the arrest of embryonic development. Further characterization of this embryonic lethal phenotype revealed that it is caused by problems in establishment of polarity and failure in the extrusion of a polar body. Moreover, we found that embryos depleted of CYP31A are osmotic sensitive and their eggs are permeable to dyes (hoechst, FM 4-64 etc.). The defects described above are common to a class of mutants that received the denomination of POD (for Polarity and Osmotic Defects). Analysis by electron microscopy demonstrated that cyp31A(RNAi) embryos exhibit an improperly constructed eggshell. Further functional studies have demonstrated that the defects observed in cyp31A(RNAi) embryos can be ascribed to the malfunctioning of one of the three layers of the eggshell: the lipid-rich layer, but additional problems in the assembling of the other two layers are also present. In order to identify the product of CYP31A, we set up a bioassay in which we tested the capability of lipidic extract from wild type embryos to rescue the embryonic lethality. The bioassay provided a method to track the activity and allowed us to enrich the metabolic product of CYP31A by the fractionation of the total lipid extract. Another POD gene, emb-8, codes for an NADPH CYP reductase. This 4 protein supplies electrons to the CYPs for their metabolic reactions. A mutant of emb-8 (emb-8(hc69)), gives a similar phenotype as the knockdown CYP31A. With the aim to test if EMB-8 and CYP31A act in the same pathway we extracted lipids from emb-8TS mutants. We tested in the bioassay if extracts from emb-8(hc69) mutants, containing the metabolic product of CYP31A, can rescue cyp31A(RNAi) phenotype. The results obtained suggest that EMB-8 and CYP31A work in the same metabolic pathway. Conclusively, CYP31A and EMB-8 cooperate to produce a class of lipids that are required for the construction of a functional eggshell. A defective eggshell causes failure in polarity establishment, extrusion of the polar bodies, osmotic sensitivity and permeability and eventually it leads to the arrest of the development of C. elegans embryos.

Bei der adjuvanten Immuntherapie soll das Immunsystem von Tumorpatienten gezielt gegen Mikrometastasen aktiviert werden, die nach der operativen Entfernung des Primärtumors im Körper verbleiben. Tumor-assoziierte Antigene (TAA) spielen dabei die zentrale Rolle. Um der Heterogenität eines Tumors in der Expression einzelner TAAs Rechnung zu tragen, werden in modernen Vakzinierungsstrategien Pools von verschiedenen TAAs eingesetzt. Für das Mammakarzinom sind aber bislang nur wenige TAAs bekannt. Auf der Suche nach unbekannten Genen mit Mamma- bzw. Mammakarzinom-restringierter Expression in der Transkriptomdatenbank GeneExpress® wurde ein EST gefunden, das nur in 2 % der getesteten weibl. Normalgewebe ohne Mamma mit einer marginalen mittleren Expression von 16 FE (Fluoreszenzeinheit) detektiert wurde, aber in 63 % der Mammanormalgewebe (159 FE) und in 61 % der Mammakarzinome (339 FE) exprimiert wurde. Das korrespondierende UniGene-Cluster gab erste Hinweise auf die Zugehörigkeit dieses neuen Gens zu der Cytochrom P450 (CYP) Familie. Durch computergestützte Homologievergleiche mit verwandten Mitgliedern dieser Familie in Kombination mit RT-PCR konnte die cDNA-Sequenz dieses neuen CYP ermittelt werden: Durch Amplifikation der Gesamtlängen-cDNA wurden drei Transkripte in der Mammakarzinomzelllinie SK-BR-3 gefunden, die von zwei neuen CYP Genen stammen, CYP4Z1 und dem Pseudogen CYP4Z2P. Die cDNA von CYP4Z1 kodiert für ein 505 As großes Protein, das aufgrund von Homologien einer neuen Subfamilie innerhalb der CYP4 Familie zugeordnet werden kann. Sowohl die Sequenz als auch die vorhergesagte Sekundärstruktur zeigen alle charakteristischen Merkmale eines funktionellen Mitglieds dieser Familie. Aufgrund einer Nonsensemutation in Exon 8 kodiert die cDNA von CYP4Z2P (1436 bp) für ein verkürztes, nichtfunktionelles P450 von 340 As, das zu 96% identisch mit P450 4Z1 ist. Außerdem wurde in SK-BR-3 eine Spleißvariante von CYP4Z1 identifiziert. CYP4Z1 (50,8 kb) und CYP4Z2P (57,3 kb) liegen auf Chromosom 1p33-p34.1 und bestehen aus 12 Exons mit konservierten Exon-Intron-Grenzen. CYP4Z2P ist aus einer inversen Duplikation von CYP4Z1 hervorgegangen. Mittels Realtime RT-PCR mit cDNA von 17 Normalgeweben von gepoolten Spendern und von Mammakarzinomen konnte die auf Brustdrüsengewebe restringierte Expression beider Gene demonstriert werden: Die Expression von CYP4Z1 war in Mammakarzinomgewebe 3,6-mal höher als in Mammanormalgewebe, 60-mal höher als in Lunge und 84-mal höher als in Leber. Alle anderen getesteten weibl. Normalgewebe zeigten eine noch geringere Expression. Ein ähnlich stringentes Expressionsprofil ergab die Analyse von CYP4Z2P, allerdings mit einer deutlich niedrigeren Expressionsstärke. Das Mamma-restringierte Expressionsverhalten von CYP4Z1 wurde durch einen ?Cancer-Profiling-Array? (241 Tumor-/Normalgewebepaare von 13 Gewebetypen) bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass CYP4Z1 bei 52 % der getesteten 50 Brustkrebspatientinnen im Tumor versus peritumoralem Normalgewebe überexprimiert war. Mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum konnte die Expression von P450 4Z1 Protein sowohl in CYP4Z1-transduzierten Zelllinien als auch in Mammagewebeproben mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Konfokale Laser-Scanning Mikroskopie von MCF-7 Zellen, die das Fusionsprotein CYP4Z1-EGFP exprimierten, und die subzelluläre Fraktionierung der CYP4Z1-Transduktanten zeigten P450 4Z1 als integrales Membranprotein des endoplasmatischen Retikulums (ER). Für die Lokalisation und die Zurückhaltung im ER ohne Recycling aus dem Prä-Golgiapparat sind die ersten 32 As erforderlich, was Studien mit unterschiedlichen Deletionsmutanten aus der N-terminalen Sequenz von 4Z1 zeigten. Die Entdeckung eines neuen Mamma-spezifisch exprimierten P450 Enzyms eröffnet neue Möglichkeiten sowohl in Hinsicht auf eine Immuntherapie von Brustkrebs als auch für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika, die spezifisch durch P450 4Z1 am Tumorort umgesetzt werden können.