OLIVEIRA, Ulisses Marcondes Freire de. Desenvolvimento de biocatalisadores utilizando lipases de Rhizomucor mihei (RML) imobilizada em suporte de quitosana e sua aplicação na síntese de ésteres butirato de metila e butirato de etila. 2012. 272 f. : Tese (doutorado) - Univerisdade Federal do Ceará, Doutorado em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-30T14:39:42Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_ umfoliveira.pdf: 5868740 bytes, checksum: fb87a06503cdae0af0e790f65341b983 (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-30T14:43:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_ umfoliveira.pdf: 5868740 bytes, checksum: fb87a06503cdae0af0e790f65341b983 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-30T14:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_ umfoliveira.pdf: 5868740 bytes, checksum: fb87a06503cdae0af0e790f65341b983 (MD5) Previous issue date: 2012 / Lipases (glycerol ester hydrolases, EC3.1.1.3) are versatile catalysts with broad and diverse possibilities of industrial applications. Its main application is essentially catalyze the hydrolysis of triglycerides. However, in micro-aqueous environments these enzymes have the ability to catalyze the reverse reaction of esterification. These enzymes do not require cofactors, have relatively low cost, are regioespecific, enantioselectives and may act on a broad range of temperature and pH. This work aimed to develop alternative technologies using enzymatic routes mediated by lipase from Rhizomucor miehei (RmL) immobilized on chitosan support in the presence of some classes of surfactants for the production of methyl butyrate and ethyl butyrate, two esters widely used in cosmetic and food industries. In this study two immobilization strategies were evaluated. In the first, the enzymes were immobilized in the presence of selected surfactants on chitosan supports previously activated with glutaraldehyde. In the second immobilization strategy, chitosan was crosslinked with glutaraldehyde after prior adsorption of the enzymes in the presence of surfactants. Among the immobilization procedures studied, the best results were achived when the enzyme was immobilized onto chitosan support in the presence of the surfactant sodium dodecyl sulphate SDS (0.23% m v-1) for 1 h at 4 ° C and 220 rpm, followed by crosslinking with 0.6% glutaraldehyde (v v-1) for 1 h at 25 ° C. In esterification experiments conducted with the best derivative, a detailed study of the parameters that affect the reaction rates were performed. The best yields were obtained when the reactions were conducted at 25 ° C, 6h and 150 rpm using n-heptane as a solvent. For methyl butyrate maximum esterification yield was 89% and for ethyl butyrate the maximum conversion observed was 92%. The results were comparable to yields observed when the esterification reactions were carried out with the commercial enzyme Lipozyme® and the soluble enzyme under the same reaction conditions. / Lipases (glicerol éster hidrolases, E.C.3.1.1.3) são catalisadores versáteis com amplas e diversificadas possibilidades de aplicação industrial. Sua principal aplicação é essencialmente catalisar a hidrólise de triglicerídeos. Entretanto, em ambientes micro-aquosos estas enzimas possuem a habilidade de catalisar a reação reversa de esterificação. Estas enzimas não requerem cofatores, possuem custo relativamente baixo, são regioespecíficas, enantiosseletivas, além de atuarem em uma larga faixa de temperatura e pH. Neste contexto, este trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologias alternativas utilizando rotas enzimáticas mediadas por lipase de Rhizomucor miehei (RmL) imobilizada em suporte quitosana na presença de algumas classes de surfactantes para a produção de butirato de metila e butirato de etila, dois ésteres amplamente utilizados na indústria de cosméticos e de alimentos. Neste estudo, duas estratégias de imobilização foram avaliadas. Na primeira, a enzima foi imobilizada na presença dos surfactantes selecionados em suporte quitosana previamente reticulado com glutaraldeído. Na segunda estratégia de imobilização, o suporte utilizado foi reticulado com glutaraldeído após prévia adsorção da enzima na presença dos surfactantes. Dentre os procedimentos de imobilização estudados, os melhores resultados foram obtidos quando a enzima foi previamente adsorvida no suporte quitosana na presença do surfactante dodecil sulfato de sódio (0,23% m.v-1) por 1h a 4°C e 220 rpm, seguido de reticulação com glutaraldeído 0,6% (v.v-1) por 1h a 25°C. Nos ensaios de esterificação utilizando o melhor derivado obtido, foi efetuado um estudo detalhado dos parâmetros que afetam as taxas de conversão. Os melhores rendimentos foram obtidos quando as reações foram conduzidas a 25°C, 6h e 150 rpm utilizando n-heptano como solvente. Para o butirato de metila, o rendimento máximo de esterificação foi de 89% e para o butirato de etila a maior conversão observada foi de 92%. Os resultados obtidos foram comparáveis aos rendimentos de esterificação observados quando foi utilizada a enzima comercial Lipozyme® nas mesmas condições reacionais.

Com o objetivo de se estabelecer uma metodologia eficiente para obtenção de ésteres etílicos por transesterificação enzimática de óleos de soja e de mamona, utilizando um catalisador mais barato do que o anteriormente estudado em nosso grupo de pesquisa, Cândida Antarctica A (Novozym 435), é que a lipase 1,3- específica de Thermomices lanuginosus (Lipozyme TL IM) foi escolhida. Foram realizadas várias reações para estudo das melhores condições reacionais tanto para o óleo de soja, quanto para o óleo de mamona. Nestes estudos foi observada a influencia dos efeitos do teor de etanol no meio reacional, da trituração da enzima imobilizada, da pré-incubação da enzima imobilizada, da concentração da enzima no meio reacional e da temperatura do meio reacional na alcóolise enzimática utilizando a lípase Lipozyme TL IM como catalisador. A conversão dos materiais de partida a ésteres etílicos foi acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) aliada a quantificação através dos padrões de ricinoleato de etila e linoleato de etila através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Tendo sido estabelecidas as melhores condições para a conversão dos óleos de soja e mamona utilizando o catalisador enzimático em questão, foram realizadas novas reações de modo a otimizar as condições das reações através da utilização dos parâmetros estabelecidos, porém de forma conjunta. A observação destes últimos resultados apontou a presença de intermediários residuais não convertidos e, portanto para a necessidade de uma segunda etapa de reação posterior à reação com a Lipozyme TL IM. Nesta segunda etapa, optou-se por utilizar a lípase do tipo inespecífica, a Novozym 435, sendo que a mesma apresentou bons resultados na conversão em último estágio reacional dos monoglicerídeos e diglicerídeos presentes no meio de forma residual. Posteriormente, foram realizadas etapas de purificação dos produtos obtidos, bem como estudos de características físico-químicas tais como, viscosidade, densidade, índice de iodo e ponto de fulgor para os ésteres obtidos a partir dos óleos de soja e mamona em sua forma pura e em mistura entre os mesmos, para que fosse possível verificar sua adequação quanto às normas internacionais de qualidade para biocombustíveis, EN 14214 e ASTM D 6571. / The main objective of this work was to establish an efficient methodology for the production of ethyl esters by the enzymatic transesterification of soybean and castorbean oils, using a cheaper catalyst than those used previously in our research group, Candida Antartica A. In this research we used a 1,3-non specific lipase, isolated from Thermomices lanuginous commercially named Lipozyme TL IM. Several reactions were performed to determine the best reaction conditions for both, the castorbean and the soy-beans. In this study we analyzed the influence of different parameters for the transesterification to occur in an efficient way, like the ethanol ratio in the reaction media, the granulometry of the enzyme support, the temperature of the reaction medium, , the concentration of catalyst used (enzyme), specifically Lipozyme TL IM. The starting material transformation to ethyl esters was qualitatively monitored using TLC (Thin Layer Chromatography), while the quantitative analysis was done using ethyl ricinoleate and ethyl linoleate as standard in High Performance Liquid Chromatography (HPLC). After the best reaction conditions were determined for both castor and soybean oil, using the enzymatic catalyst, it were performed new experiments in order to optimize the reaction conditions using the established individual parameters, however combining all it. Even working with the combination of the best parameters, it was still observed the presence of residual intermediates such as mono and di-glicerides, that are not converted in just one step. Consequently, we decided to perform a second reaction step after the transformation with Lipozyme TL IM. In this second reaction, a non-specific enzyme, the Novozymes 435, was used showing good results in the further transformation of mono- and di-glicerides that were present in residual amounts after the first reaction step. Furtherly, the obtained products from castor and soybean were purified and their physico-chemical quality parameters like viscosity, density, iodine number and flash point were determined for their pure form and for the blend of both products (castor and soy biodiesel), in order to correct some of these quality parameters that are out of the international quality standard, EN 14214 and ASTM D 6751.

Com o objetivo de se estabelecer uma metodologia eficiente para obtenção de ésteres etílicos por transesterificação enzimática de óleos de soja e de mamona, utilizando um catalisador mais barato do que o anteriormente estudado em nosso grupo de pesquisa, Cândida Antarctica A (Novozym 435), é que a lipase 1,3- específica de Thermomices lanuginosus (Lipozyme TL IM) foi escolhida. Foram realizadas várias reações para estudo das melhores condições reacionais tanto para o óleo de soja, quanto para o óleo de mamona. Nestes estudos foi observada a influencia dos efeitos do teor de etanol no meio reacional, da trituração da enzima imobilizada, da pré-incubação da enzima imobilizada, da concentração da enzima no meio reacional e da temperatura do meio reacional na alcóolise enzimática utilizando a lípase Lipozyme TL IM como catalisador. A conversão dos materiais de partida a ésteres etílicos foi acompanhada por cromatografia em camada delgada (CCD) aliada a quantificação através dos padrões de ricinoleato de etila e linoleato de etila através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Tendo sido estabelecidas as melhores condições para a conversão dos óleos de soja e mamona utilizando o catalisador enzimático em questão, foram realizadas novas reações de modo a otimizar as condições das reações através da utilização dos parâmetros estabelecidos, porém de forma conjunta. A observação destes últimos resultados apontou a presença de intermediários residuais não convertidos e, portanto para a necessidade de uma segunda etapa de reação posterior à reação com a Lipozyme TL IM. Nesta segunda etapa, optou-se por utilizar a lípase do tipo inespecífica, a Novozym 435, sendo que a mesma apresentou bons resultados na conversão em último estágio reacional dos monoglicerídeos e diglicerídeos presentes no meio de forma residual. Posteriormente, foram realizadas etapas de purificação dos produtos obtidos, bem como estudos de características físico-químicas tais como, viscosidade, densidade, índice de iodo e ponto de fulgor para os ésteres obtidos a partir dos óleos de soja e mamona em sua forma pura e em mistura entre os mesmos, para que fosse possível verificar sua adequação quanto às normas internacionais de qualidade para biocombustíveis, EN 14214 e ASTM D 6571. / The main objective of this work was to establish an efficient methodology for the production of ethyl esters by the enzymatic transesterification of soybean and castorbean oils, using a cheaper catalyst than those used previously in our research group, Candida Antartica A. In this research we used a 1,3-non specific lipase, isolated from Thermomices lanuginous commercially named Lipozyme TL IM. Several reactions were performed to determine the best reaction conditions for both, the castorbean and the soy-beans. In this study we analyzed the influence of different parameters for the transesterification to occur in an efficient way, like the ethanol ratio in the reaction media, the granulometry of the enzyme support, the temperature of the reaction medium, , the concentration of catalyst used (enzyme), specifically Lipozyme TL IM. The starting material transformation to ethyl esters was qualitatively monitored using TLC (Thin Layer Chromatography), while the quantitative analysis was done using ethyl ricinoleate and ethyl linoleate as standard in High Performance Liquid Chromatography (HPLC). After the best reaction conditions were determined for both castor and soybean oil, using the enzymatic catalyst, it were performed new experiments in order to optimize the reaction conditions using the established individual parameters, however combining all it. Even working with the combination of the best parameters, it was still observed the presence of residual intermediates such as mono and di-glicerides, that are not converted in just one step. Consequently, we decided to perform a second reaction step after the transformation with Lipozyme TL IM. In this second reaction, a non-specific enzyme, the Novozymes 435, was used showing good results in the further transformation of mono- and di-glicerides that were present in residual amounts after the first reaction step. Furtherly, the obtained products from castor and soybean were purified and their physico-chemical quality parameters like viscosity, density, iodine number and flash point were determined for their pure form and for the blend of both products (castor and soy biodiesel), in order to correct some of these quality parameters that are out of the international quality standard, EN 14214 and ASTM D 6751.