Sucrose synthase (Susy) is a key enzyme of sucrose metabolism, catalysing the reversible conversion of sucrose and UDP to UDP-glucose and fructose. Therefore, its activity, localization and function have been studied in various plant species. It has been shown that Susy can play a role in supplying energy in companion cells for phloem loading (Fu and Park, 1995), provides substrates for starch synthesis (Zrenner et al., 1995), and supplies UDP-glucose for cell wall synthesis (Haigler et al., 2001). Analysis of the Arabidopsis genome identifies six Susy isoforms. The expression of these isoforms was investigated using promoter-reporter gene constructs (GUS) and real time RT-PCR. Although these isoforms are closely related at the protein level they have radically different spatial and temporal patterns of expression in the plant with no two isoforms showing the same distribution. More than one isoform is expressed in all organs examined. Some of them have high but specific expression in particular organs or developmental stages whilst others are constantly expressed throughout the whole plant and across various stages of development. The in planta function of the six Susy isoforms were explored through analysis of T-DNA insertion mutants and RNAi lines. Plants without the expression of individual isoforms show no differences in growth and development, and are not significantly different from wild type plants in soluble sugars, starch and cellulose contents under all growth conditions investigated. Analysis of T-DNA insertion mutant lacking Sus3 isoform that was exclusively expressed in stomata cells only had a minor influence on guard cell osmoregulation and/or bioenergetics. Although none of the sucrose synthases appear to be essential for normal growth under our standard growth conditions, they may be necessary for growth under stress conditions. Different isoforms of sucrose synthase respond differently to various abiotic stresses. It has been shown that oxygen deprivation up regulates Sus1 and Sus4 and increases total Susy activity. However, the analysis of the plants with reduced expression of both Sus1 and Sus4 revealed no obvious effects on plant performance under oxygen deprivation. Low temperature up regulates Sus1 expression but the loss of this isoform has no effect on the freezing tolerance of non acclimated and cold acclimated plants. These data provide a comprehensive overview of the expression of this gene family which supports some of the previously reported roles for Susy and indicates the involvement of specific isoforms in metabolism and/or signalling. / Saccharose spielt eine zentrale Rolle in höheren Pflanzen. Es zählt zu den wichtigsten Kohlenhydraten und wird als Nährstoff, Speicherstoff (z.B. in Zuckerrüben, Zuckerrohr, Mohrrüben) oder auch als potentielles Signalmolekül verwendet. Saccharose ist eines der primären Endprodukte der Photosynthese in den grünen Blättern der Pflanzen, kann aber auch in nicht-photosynthetisch aktiven Geweben (z.B. in keimenden Samen) synthetisiert und verstoffwechselt werden. Die Saccharosesynthase (Susy) stellt ein Schlüsselenzym im Saccharosestoffwechsel dar. Es katalysiert die reversible Umwandlung von Saccharose zu UDP-Glukose und Fruktose. Die Aktivität, die Lokalisierung und die Funktionen der Susy wurden bereits in verschiedenen Pflanzenarten untersucht. Dabei hatte sich herausgestellt, daß die Susy eine wichtige Rolle in der Bereitstellung von Energie für Transportprozesse spielt. Außerdem stellt Susy die Substrate für die Stärkesynthese in Speichergeweben, sowie fast alle Substrate für die Zellwandsynthese bereit. Eine Untersuchung des Genoms von Arabidopsis thaliana ergab, daß die Ackerschmalwand sechs Isoformen der Susy besitzt. Die Expression dieser Isoformen wurde mittels Echtzeit RT-PCR analysiert. Obwohl die verschiedenen Isoformen auf Proteinebene in ihrer Sequenz sehr ähnlich sind, zeigen sie Unterschiede in ihrem zeitlichen und räumlichen Auftreten innerhalb der Pflanze. Einige der Isoformen sind hoch exprimiert in speziellen Organen oder Entwicklungsstufen der Pflanze. Andere hingegen sind gleichmäßig in der ganzen Pflanze und über verschiedene Entwicklungsstufen hinaus exprimiert. In allen untersuchten Organen der Pflanze ist mehr als eine Isoform exprimiert. Um die spezifische Funktion der einzelnen Isoformen aufzuklären, wurden für alle sechs Saccharosesynthasen Mutanten-Linien isoliert und analysiert. Alle Pflanzen, bei denen die Expression einer bestimmten Isoform fehlte, zeigten im Vergleich zu Wildtyppflanzen keine signifikanten Unterschiede in Wachstum und Entwicklung. Des Weiteren waren die Gehalte an Stärke, Saccharose und Zellulose in Blättern und Wurzeln im Vergleich zu Wildtyppflanzen unverändert. Mutanten, denen die ausschließlich in Schließzellen lokalisierte Isoform Sus3 fehlte, zeigten nur geringe Veränderungen in der Osmoregulation und/oder der Bioenergetik der Schließzellen. Daraus kann gefolgert werden, dass in dem Ackerunkraut Arabidopsis keine der Saccharosesynthasen essentiell für normales Wachstum unter Standardbedingungen ist. Es ist jedoch möglich, dass Saccharosesynthasen unter Stressbedingungen benötigt werden. Es war bereits bekannt, dass einzelne Isoformen der Susy auf Stress reagieren und in ihrer Expression verändert sind. Es konnte gezeigt werden, daß Sauerstoffmangel zu einer Erhöhung der Expression der Isoformen Sus1 und Sus4 und zu einer Zunahme der Susy Gesamtaktivität führt. Die Analyse von Pflanzen mit reduzierter Expression von Sus1 und Sus4 zeigte jedoch, dass Sauerstoffmangel keinen offensichtlichen Einfluss auf das Wachstum dieser Pflanzen hat. Niedrige Temperaturen führen zu einer Erhöhung der Sus1 Expression, aber auch ein Verlust dieser Isoform hat keinen Einfluss auf die Gefriertoleranz von normalen oder an Kälte akklimatisierten Pflanzen. Diese Ergebnisse bieten einen umfassenden Einblick in die Expression der Genfamilie der Saccharosesynthase; sie untermauern die genannten Funktionen der Saccharosesynthase und weisen auf eine mögliche Beteiligung mehrerer Isoformen am Saccharosestoffwechsel und/oder der Signaltransduktion hin.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten der Assoziation von Saccharose-Synthase (SUS) mit subzellulären Strukturen. Durch cDNA-Durchmusterungen konnten proteinogene Bindepartner von SUS sowie Aktin identifiziert und zum Teil verifiziert werden. Die dritte Isoform SuS3 aus Mais wurde auf molekularer Ebene identifiziert und das rekombinante Protein biochemisch charakterisiert. Trotz signifikanter Sequenzunterschiede zwischen den SUS-Isoformen, wurden ähnliche katalytische Eigenschaften und mögliche posttranslationale Modifikationen der Enzyme nachgewiesen, darunter die Redox-Modifikation der Enzymaktivität und das Potential zur reversiblen Phosphorylierung. Der Einfluss der Phoshorylierung von SUS auf dessen enzymatische und assoziative Aktivität wurde mittels mutagenisiertem Protein untersucht und zeigte kein stark verändertes Verhalten infolge der Mutationen. Eine metabolische Regulation der SUS-Aktin-Wechselwirkung durch Zucker konnte bestätigt und die katalytische Aktivität von SUS in Gegenwart von Aktin gezeigt werden. Assoziationsstudien von Aktin mit synthetischen Peptiden sowie immunologische Untersuchungen lieferten Hinweise für die Aktinbindedomäne in SUS. Co-Pelletierungsexperimente zeigten die Assoziation von SUS mit Mikrotubuli aus Rinderhirn. In vitro konkurriert SUS mit Aldolase um die Bindung an Miktotubuli. Als proteinogene Bindepartner von SUS wurden einige im Kohlenhydratstoffwechsel sowie im 26S-Proteasom-Komplex involvierte Proteine identifiziert. Ebenso wurde eine Glutathion-Peroxidase identifiziert, die ubiquitäre Transkriptakkumulation dokumentiert und die katalytische Aktivität des rekombinanten Proteins gezeigt. Eine weitere cDNA-Durchmusterung führte zur Identifikation verschiedener glykolytischer Enzyme als potentielle Interaktionspartner von Mais-Aktin sowie zu Bindepartnern, die nach Sequenzanalyse Domänen mit Homologien zu bekannten ABPs aus tierischen Organismen zeigten.

La qualité esthétique d'une plante ornementale est conditionnée par de nombreux critères, et notamment la forme globale de la plante. Celle-ci est le résultat du fonctionnement des bourgeons le long des tiges et de la croissance des rameaux produits. Chez un certain nombre de végétaux, les facteurs environnementaux ont un impact fort sur la construction architecturale de la plante, qui génère cette forme. Ainsi, parmi ces facteurs, la lumière tant en quantité que qualité, peut moduler la capacité des bourgeons à débourrer. Au delà de cette constatation rapportée chez plusieurs espèces, très peu de travaux ont cherché à identifier les mécanismes par lesquels la lumière régule le processus de débourrement. Pour aborder cette question, nous avons lancé des recherches chez plusieurs variétés de rosier-buisson (Rosa sp. L.), en couplant des approches morphologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires. Les études ont été menées sur des plantes expérimentales, défeuillées et décapitées au-dessus des trois bourgeons basaux de la tige principale, afin de limiter l'impact des inhibitions corrélatives entre organes, pouvant masquer ou interagir avec les mécanismes du photocontrôle. Nos résultats démontrent un besoin absolu de lumière pour le débourrement chez le rosier. En effet, aucun débourrement n'est observé à l'obscurité chez les six variétés de rosiers étudiées, ce qui n'est pas le cas chez les espèces modèles telles qu'Arabidopsis thaliana, la tomate ou le peuplier. Des expériences de masquage ont permis de montrer que le bourgeon percevait directement le signal lumineux requis pour le débourrement, soulignant ainsi une signalisation courte entre les organes récepteurs (écailles) et les sites de croissance (méristème apical, jeunes feuilles préformées). La lumière, aussi bien en termes d'intensité que de qualité, module le débourrement des bourgeons. Ainsi, de faibles intensités lumineuses (2 +mol.m-2.s-1) sont suffisantes pour permettre la croissance des jeunes feuilles préformées mais pas l'activité organogénique du méristème apical caulinaire. De même, les raies spectrales bleue et rouge clair permettent, contrairement à la lumière rouge sombre, l'induction de ces deux processus. On peut alors s'interroger sur le photocontrôle des processus physiologiques-clés du débourrement. Deux de ces processus ont fait l'objet d'une étude plus approfondie : le métabolisme glucidique et l'expansion cellulaire. Nos travaux montrent que le débourrement obtenu à la lumière est associé à un afflux d'eau et de sucres dans le bourgeon, ainsi qu'à une métabolisation du saccharose en sucres simples : glucose et fructose. La lumière agit en favorisant la transcription de gènes et/ou les activités d'enzymes de dégradation du saccharose que sont l'invertase acide vacuolaire et la saccharose synthase. L'élongation cellulaire est aussi stimulée à la lumière comme le montrent nos mesures en microscopie électronique à balayage. A l'obscurité, ces processus sont réduits ou inhibés n'offrant ainsi pas les conditions de croissance nécessaires au débourrement. L'expression génique d'une expansine, protéine intervenant dans le relâchement de la paroi au cours de l'élongation cellulaire, est ainsi fortement réprimée. En réponse au stress provoqué par l'obscurité permanente, la stimulation de la transcription d'une sorbitol déshydrogénase pourrait prendre le relais du métabolisme glucidique pour contribuer à la survie cellulaire. Nos travaux démontrent ainsi que le photocontrôle du débourrement du bourgeon s'exerce au travers d'au moins deux processus physiologiques: le métabolisme glucidique et l'élongation cellulaire. Au regard de nos résultats et de ceux de la bibliographie, nous proposons un modèle du contrôle par la lumière du débourrement.