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Isolamento e caracterização estrutural e funcional da Ts15, uma nova neurotoxina da peçonha do escorpião Tityus serrulatus / Isolation and structural and functional characterization of Ts15, a new neurotoxin from the venom of the scorpion Tityus serrulatusCologna, Camila Takeno 21 July 2010 (has links)
Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1
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Isolamento e caracterização estrutural e funcional da Ts15, uma nova neurotoxina da peçonha do escorpião Tityus serrulatus / Isolation and structural and functional characterization of Ts15, a new neurotoxin from the venom of the scorpion Tityus serrulatusCamila Takeno Cologna 21 July 2010 (has links)
Os escorpiões são um dos grupos de animais mais antigos da Terra. Eles são artrópodes e pertecem a classe Arachinida e Ordem Scorpionida. A família Buthidae compreende as espécies responsáveis pelos acidentes graves em humanos, incluindo a espécie Tityus serrulatus, o maior responsável por esses acidentes no Brasil. A peçonha do T. serrulatus contém diversas neurotoxinas que agem especificamente em canais para sódio, potássio e cálcio da membrana plasmática de células excitáveis, causando massiva liberação de neurotransmissores.As toxinas escorpiônicas podem ser usadas como ferramentas nos estudos de estrutura e função desses canais iônicos sensíveis a voltagem e também no estudo de liberação e captação de neurotransmissores. As toxinas escôrpionicas específicas para canais para sódio sensíveis a voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos do envenenamento por estes artrópodes e podem ser classificadas em duas classes: toxinas e . As -toxinas retardam a inativação desses canais induzindo assim um prolongamento na fase de repolarização do potencial de ação. As - toxinas alteram a dependência de voltagem de ativação dos canais para sódio para potenciais mais negativos provocando potenciais de ação espontâneos e repetitivos. As toxinas específicas para canais para potássio (KTx) são geralmente peptídeos pequenos e de caráter básico, formados por 23-43 aminoácidos estabilizados por 3-4 pontes dissulfeto. As KTx são classificadas em 4 subfamílias:, , , . Neste trabalho, uma nova neurotoxina do escorpião T. serrulatus foi isolada e caracterizada bioquímica e funcionalmente. A toxina foi testada em ampla variedade de canais incluindo 5 subtipos de canais para sódio (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 e DmNav1) e 12 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1 a Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR e hERG). A peçonha bruta solúvel foi fracionada em cromatografia de troca iônica em coluna CM-Celulose-52 (2,5 cm x 63 cm), previamente equilibrada e eluída com tampão NH4HCO3 (pH 7,8). Essa primeira etapa cromatográfica permitiu a separação de 13 frações nomeadas de I XIII. A fração X foi submetida à cromatografia de fase reversa em sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em que a toxina pura Ts15 pode ser obtida. Seu sequenciamento amino-terminal demonstrou que esse peptídeo possui 36 resíduos de aminoácidos estabilizados por 3 pontes dissulfeto. A massa molecular obtida por espectrometria de massa foi de 3956 e o pI predito pelo programa ProtParam foi de 8,86, no entanto, o pI determinado por focalização isolelétrica foi maior que 9,3. Os experimentos de eletrofisiologia utilizando as técnicas patch clamp e two microelectrode voltage clamp mostraram que a toxina Ts15 bloqueia preferencialmente os subtipos de canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 com IC50 de 196 ± 25 nM e 508± 67 nM respectivamente. Os ensaios de captação de neurotransmissores em sinaptosomas de cérebro de rato foram realizados adicionando 3H-GABA e 3H-Glu na presença e ausência de diferentes concentrações da toxina Ts15. Não foram observados efeitos nos canais para sódio em todas as concentrações testadas assim como na captação do GABA. Porém, foi observado aumento significante na captação do glutamato em todas as concentrações testadas, provavelmente como resultado de efeito secundário da ação da Ts15 em canais para potássio sensível a voltagem. Em conclusão, a Ts15 pode ser considerada um autêntico novo tipo de toxina escorpiônica, com afinidade para canais para potássio Kv1.2 e Kv1.3 e capaz de aumentar a captação de glutamato. Essa toxina é o único membro da nova subfamília -Ktx21 e portanto nomeada -Ktx21.1 / Scorpions are one of the most ancient groups of animals on earth. They are arthropods and belong to the class Arachinida and Order Scorpionida. The Buthidae family comprises the species that are really dangerous for human, including Tityus serrulatus that is responsible for most severe accidents in Brazil. T. serrulatus venom contains several neurotoxins that specifically act on sodium, potassium or calcium channels in excitable membranes, causing a massive release of neurotransmitters and leading to the stimulation of the autonomic nervous system. Since ion channels play important roles in many physiological processes, scorpion toxins have been used as tools for studies of the neurophysiological mechanisms involving voltage-gated ion channels and neurotransmitter release/uptake. Voltage-gated Na+ channel (Nav channel) toxins are mainly responsible of the harmful effects of scorpion venom and can be classified into two classes: and -neurotoxins. The -toxins retard Nav channel inactivation and induce a prolongation of the repolarization phase of the action potential. The -toxins shift the voltage dependence of Nav channel activation to more negative potentials that result in an increased tendency of the cell to fire spontaneously and repetitively. Voltage-gated potassium channel toxins (KTxs) are basic short chain peptides comprising 23-43 amino acid residues that can be cross-linked by 3 or 4 disulfide bridges. KTxs are classified into four large families: , , and . These peptides display varying selectivity and affinity for different Kv channel subtypes. In this work, a novel toxin from the T. serrulatus venom was isolated, biochemistry and pharmacologically characterized using a wide electrophysiological screening on 5 different subtypes of Nav channels (Nav1.4; Nav1.5; Nav1.6; Nav1.8 and DmNav1) and 12 different subtypes of Kv channels (Kv1.1 - Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv4.3; Shaker IR and hERG). The crude soluble T. serrulatus venom was fractionated by ion exchange chromatography on a CM-cellulose-52 column (2.5 cm x 63.0 cm), which was equilibrated and eluted with NH4HCO3 buffer (pH 7.8). This chromatography allowed the separation of 13 fractions which were named I to XIII. Fraction X was submitted to a reverse-phase C18 (0.46 cm x 25 cm) high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and the pure toxin, Ts15, could be obtained. The amino acid sequence of this novel peptide showed that it contains 36 amino acids and is cross-linked by 3 disulfide bridges. The molecular mass of Ts15 (3956) was obtained by electrospray (ESI) triple-quadrupole mass spectrometry and its pI value (8,86) was predicted by ProtParam program. However, the pI determined by isoeletric focusing was greater than 9,3. Electrophysiological experiments using patch clamp and the two electrode voltage clamp technique, showed that Ts15 preferentially blocks Kv1.2 and Kv1.3 channels with IC50 value of 196 ± 25 and 508 ± 67 nM, respectively. Uptake assays were performed by adding 3H-GABA and 3H-Glu, in the absence (controls) or presence of different concentrations of Ts15, on isolated rat brain synaptosomes. No effect on Nav channels was observed, in all tested concentrations, as well as for GABA uptake. However, Ts15 induced a significant increase of the glutamate uptake, probably as a secondary effect of its action on Kv channels. In conclusion, Ts15 can be considered a bonafide novel type of scorpion toxin that presents high affinity by Kv1.2 and Kv1.3 channels and was able to increase the glutamate uptake. It is the unique member of the new -Ktx21 subfamily and therefore was named -Ktx21.1
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Efeitos de a e b-neurotoxinas da peçonha do escorpião Tityus serrulatus sobre a liberação de catecolaminas, pressão arterial, captação de neurotransmissores e concentração de cálcio em células de músculo liso de aorta de ratos / Effects of a- and b-neurotoxins from Tityus serrulatus scorpion venom on catecholamines release, arterial blood pressure, neurotransmitters uptake and calcium concentration in smooth muscle cells from rat aortaVasconcelos, Flavio de 24 February 2006 (has links)
Toxinas que atuam em canais para Na+ operados por voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos tóxicos do envenenamento escorpiônico e podem ser divididas em duas classes: a- e b-neurotoxinas. TsTX-V e TsTX-I da peçonha de Tityus serrulatus (TsV) são, respectivamente, exemplos destas toxinas. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos da TsV e destas toxinas sobre a pressão arterial média (PAM) e liberação de catecolaminas em ratos conscientes e não imobilizados, previamente cateterizados, bem como a captação de GABA, dopamina (DA) e glutamato (Glu) em sinaptosomas isolados de cérebro de ratos e a concentração citoplasmática de Ca+2 ([Ca+2 ]C) em células de músculo liso vascular de aorta de ratos. As toxinas foram isoladas por cromatografia de troca iônica (TsTX-I) seguida por CLAE de fase reversa (TsTX-V). As toxinas (15 e 30 g/kg) e TsV (50 e 100 g/kg) foram injetadas intravenosamente. A PAM foi monitorada continuamente através do cateter femoral. Os níveis plasmáticos de adrenalina (ADR) e noradrenalina (NA) foram determinados por CLAE de fase reversa com detector eletroquímico, em 10 min antes e 2,5, 30 e 90 min após os tratamentos. Efeitos pressores máximos foram observados em 2,5?3,5 min. TsV induziu um intenso aumento de longa duração na PAM, bem como a TsTX-I. A TsTX-V mostrou efeitos pressores menores. TsV mostrou os maiores efeitos sobre a liberação de catecolaminas, seguido pela TsTX-I e TsTX-V com um efeito máximo em 2,5 min, seguido por uma gradual redução, permanecendo, todavia, maior que os controles. Embora ambas as classes de toxinas atuem em canais para Na+, TsTX-I mostrou efeitos mais significantes e intensos sobre a liberação de catecolaminas e pressão arterial que a TsTX-V. Parece que a toxicidade da TsTX-V não está somente relacionada à sua capacidade de liberar catecolaminas, indicando que outros neutrotransmissores podem estar envolvidos em sua toxicidade. Nem a TsV ou suas toxinas foram capazes de afetar a captação de 3H-Glu. TsTXI inibiu somente a captação de 3H-DA (IC50 = 28,41 nM). Por outro lado, TsV (0,43ng/mL) inibiu a captação de 3H-GABA e 3H-DA (~50%). TsTX-V mostrou IC50 = 9,37 nM e 22,2 nM para a captação de 3H-GABA e 3HDA, respectivamente. Esses efeitos foram abolidos pelo pré-tratamento com TTX, indicando o envolvimento de canais para Na+ neste processo. Na ausência de Ca+2 e em baixas concentrações de toxinas, a redução não é tão singnificante como na presença de Ca+2. TsTX-V não reduziu a captação de 3H-GABA em células COS-7 expressando os transportadores de GABA, GAT-1 e GAT-3, sugerindo que esta toxina reduz indiretamente o transporte. A redução da captação de 3H-GABA pelos sinaptosomas pode ser devido a rápida e intensa despolarização celular, como revelado por microscopia confocal em células de glioma C6. Assim, TsTX-V causou redução da captação de 3H-GABA e 3H-DA de uma maneira independente de Ca+2, não afetando diretamente os transportadores de GABA, mas em consequencia da despolarização, envolvendo canais para Na+ operados por voltagem. TsV e suas toxinas foram capazes de aumentar a ([Ca2+ ]C , provavelmente por interargir com canais para Na+. Quando comparado aos efeitos despolarizantes do KCl 60 mM (100 %), TsV (100 e 500 g/mL) exibiu um aumento de 49,60 ± 2,58 % e 103,66 ± 5,17 %, respectivamente, enquanto que a TsTX-I e TsTX-V (50 e 100 g/mL de cada) exibiu 43,92 ± 3,06 % e 121,8 ± 8,9 %; 52,56 ± 8,33 % e 79,5 ± 6,1 % de aumento, respectivamente. TsTX-I (100 g/mL) mostrou-se mais potente nesta preparação, visto que uma dose de 100 g/mL causou efeito muito mais intenso do que a TsTX-V na mesma concentração. É possível que as diferenças observadas sobre os efeitos induzidos pela TsTX-I e TsTX-V sejam conseqüência de alterações estruturais entre canais para Na+ presentes em vários tipos de tecidos e inervações. / Voltage-gated Na+ channel toxins are mainly responsible for the toxic effects of scorpion envenoming and can be classified into two classes: a- and b-neurotoxins. TsTX-V and TsTX-I from Tityus serrulatus venom (TsV) are, respectively, examples of these toxins. In this work, were evaluate the effects of TsV and its toxins on mean arterial pressure (MAP) and catecholamines release in conscious unrestrained rats previously catheterized, as well as GABA, dopamine (DA) and glutamate (Glu) uptake in isolated rat brain synaptosomes and cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+ ]C) in vascular smooth muscle cells from rat aorta. Toxins were isolated by ion exchange chromatography (TsTX-I) followed by RP-HPLC (TsTX-V). The toxins (15 and 30 g/kg) and TsV (50 and 100 g/kg) were injected intravenously. MAP was continuously monitored through femoral catheter. Epinephrine (E) and norepinephrine (NE) plasma levels were determined by RP-HPLC with electrochemical detection, at 10 min before and 2.5, 30 and 90 min after treatments. Maximal pressor effects were observed at 2.5 3.5 min. TsV induced intense long lasting increase in MAP, as did TsTX-I. TsTX-V showed the lowest pressor effects. TsV showed the highest effects on catecholamines release, followed by TsTX-I and TsTX-V with maximal effect at 2.5 min, followed by a gradual reduction, however remaining higher than controls. Although both toxins act on Na+ channels, TsTX-I displayed significant and more intense effects on catecholamines release and blood pressure than TsTX-V. It seems that the toxicity of TsTX-V is not related only with its ability to release catecholamines, indicating that other neurotransmitters, may be involved in its toxicity. Neither the TsV or its toxins was capable to affect the 3H-Glu uptake. TsTX-I inhibited only 3H-DA uptake (IC50 = 28.41 nM). On the other hand, TsV (0.43ng/mL) inhibited both 3H-GABA and 3H-DA uptake (~50%). TsTX-V showed IC50 = 9.37 nM and 22.2 nM for 3H-GABA and 3H-DA uptake, respectively. These effects were abolished by pre-treatment with TTX, indicating the involvement of Na+ channels in this process. In the absence of Ca2+ and at low concentrations of toxin, the reduction is not as significant as in the presence of Ca2+. TsTX-V did not reduce 3H-GABA uptake in COS-7 cells expressing GABA transporters GAT-1 and GAT-3, suggesting that this toxin indirectly reduces the transport. The reduced 3H-GABA uptake by synaptosomes could be due to fast and intense cell depolarization as revealed by confocal microscopy of C6 glioma cells. Thus, TsTX-V causes reduction on 3H-GABA and 3H-DA uptake in a Ca2+-independent manner, not affecting directly GABA transporters, but, in consequence of depolarization, involving voltage-gated Na+ channels. TsV and its toxins were able to increase the ([Ca2+ ]C , probably by interact with Na+ channels. When compared to KCl 60 mM depolarizing effect (100 %), TsV (100 and 500 ?g/mL), showed an increase of 49.60 ± 2.58 % and 103.66 ± 5.17 %, respectively, whereas TsTX-I and TsTX-V (50 and 100?g/mL of each) showed 43.92 ± 3.06 % and 121.8 ± 8.9 %; 52.56 ± 8.33 % and 79.5 ± 6.1 %, respectively. TsTX-I (100 ?g/mL) showed most potent effects in this type of preparation, since induced most intense effect that TsTX-V in the same concentration. Thus, it is possible that the differences observed on the effects induced by both toxins are consequence of structural changes among Na+ channels present in several types of tissues and innervations .
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Efeitos de a e b-neurotoxinas da peçonha do escorpião Tityus serrulatus sobre a liberação de catecolaminas, pressão arterial, captação de neurotransmissores e concentração de cálcio em células de músculo liso de aorta de ratos / Effects of a- and b-neurotoxins from Tityus serrulatus scorpion venom on catecholamines release, arterial blood pressure, neurotransmitters uptake and calcium concentration in smooth muscle cells from rat aortaFlavio de Vasconcelos 24 February 2006 (has links)
Toxinas que atuam em canais para Na+ operados por voltagem são as principais responsáveis pelos efeitos tóxicos do envenenamento escorpiônico e podem ser divididas em duas classes: a- e b-neurotoxinas. TsTX-V e TsTX-I da peçonha de Tityus serrulatus (TsV) são, respectivamente, exemplos destas toxinas. Neste trabalho, foram avaliados os efeitos da TsV e destas toxinas sobre a pressão arterial média (PAM) e liberação de catecolaminas em ratos conscientes e não imobilizados, previamente cateterizados, bem como a captação de GABA, dopamina (DA) e glutamato (Glu) em sinaptosomas isolados de cérebro de ratos e a concentração citoplasmática de Ca+2 ([Ca+2 ]C) em células de músculo liso vascular de aorta de ratos. As toxinas foram isoladas por cromatografia de troca iônica (TsTX-I) seguida por CLAE de fase reversa (TsTX-V). As toxinas (15 e 30 g/kg) e TsV (50 e 100 g/kg) foram injetadas intravenosamente. A PAM foi monitorada continuamente através do cateter femoral. Os níveis plasmáticos de adrenalina (ADR) e noradrenalina (NA) foram determinados por CLAE de fase reversa com detector eletroquímico, em 10 min antes e 2,5, 30 e 90 min após os tratamentos. Efeitos pressores máximos foram observados em 2,5?3,5 min. TsV induziu um intenso aumento de longa duração na PAM, bem como a TsTX-I. A TsTX-V mostrou efeitos pressores menores. TsV mostrou os maiores efeitos sobre a liberação de catecolaminas, seguido pela TsTX-I e TsTX-V com um efeito máximo em 2,5 min, seguido por uma gradual redução, permanecendo, todavia, maior que os controles. Embora ambas as classes de toxinas atuem em canais para Na+, TsTX-I mostrou efeitos mais significantes e intensos sobre a liberação de catecolaminas e pressão arterial que a TsTX-V. Parece que a toxicidade da TsTX-V não está somente relacionada à sua capacidade de liberar catecolaminas, indicando que outros neutrotransmissores podem estar envolvidos em sua toxicidade. Nem a TsV ou suas toxinas foram capazes de afetar a captação de 3H-Glu. TsTXI inibiu somente a captação de 3H-DA (IC50 = 28,41 nM). Por outro lado, TsV (0,43ng/mL) inibiu a captação de 3H-GABA e 3H-DA (~50%). TsTX-V mostrou IC50 = 9,37 nM e 22,2 nM para a captação de 3H-GABA e 3HDA, respectivamente. Esses efeitos foram abolidos pelo pré-tratamento com TTX, indicando o envolvimento de canais para Na+ neste processo. Na ausência de Ca+2 e em baixas concentrações de toxinas, a redução não é tão singnificante como na presença de Ca+2. TsTX-V não reduziu a captação de 3H-GABA em células COS-7 expressando os transportadores de GABA, GAT-1 e GAT-3, sugerindo que esta toxina reduz indiretamente o transporte. A redução da captação de 3H-GABA pelos sinaptosomas pode ser devido a rápida e intensa despolarização celular, como revelado por microscopia confocal em células de glioma C6. Assim, TsTX-V causou redução da captação de 3H-GABA e 3H-DA de uma maneira independente de Ca+2, não afetando diretamente os transportadores de GABA, mas em consequencia da despolarização, envolvendo canais para Na+ operados por voltagem. TsV e suas toxinas foram capazes de aumentar a ([Ca2+ ]C , provavelmente por interargir com canais para Na+. Quando comparado aos efeitos despolarizantes do KCl 60 mM (100 %), TsV (100 e 500 g/mL) exibiu um aumento de 49,60 ± 2,58 % e 103,66 ± 5,17 %, respectivamente, enquanto que a TsTX-I e TsTX-V (50 e 100 g/mL de cada) exibiu 43,92 ± 3,06 % e 121,8 ± 8,9 %; 52,56 ± 8,33 % e 79,5 ± 6,1 % de aumento, respectivamente. TsTX-I (100 g/mL) mostrou-se mais potente nesta preparação, visto que uma dose de 100 g/mL causou efeito muito mais intenso do que a TsTX-V na mesma concentração. É possível que as diferenças observadas sobre os efeitos induzidos pela TsTX-I e TsTX-V sejam conseqüência de alterações estruturais entre canais para Na+ presentes em vários tipos de tecidos e inervações. / Voltage-gated Na+ channel toxins are mainly responsible for the toxic effects of scorpion envenoming and can be classified into two classes: a- and b-neurotoxins. TsTX-V and TsTX-I from Tityus serrulatus venom (TsV) are, respectively, examples of these toxins. In this work, were evaluate the effects of TsV and its toxins on mean arterial pressure (MAP) and catecholamines release in conscious unrestrained rats previously catheterized, as well as GABA, dopamine (DA) and glutamate (Glu) uptake in isolated rat brain synaptosomes and cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+ ]C) in vascular smooth muscle cells from rat aorta. Toxins were isolated by ion exchange chromatography (TsTX-I) followed by RP-HPLC (TsTX-V). The toxins (15 and 30 g/kg) and TsV (50 and 100 g/kg) were injected intravenously. MAP was continuously monitored through femoral catheter. Epinephrine (E) and norepinephrine (NE) plasma levels were determined by RP-HPLC with electrochemical detection, at 10 min before and 2.5, 30 and 90 min after treatments. Maximal pressor effects were observed at 2.5 3.5 min. TsV induced intense long lasting increase in MAP, as did TsTX-I. TsTX-V showed the lowest pressor effects. TsV showed the highest effects on catecholamines release, followed by TsTX-I and TsTX-V with maximal effect at 2.5 min, followed by a gradual reduction, however remaining higher than controls. Although both toxins act on Na+ channels, TsTX-I displayed significant and more intense effects on catecholamines release and blood pressure than TsTX-V. It seems that the toxicity of TsTX-V is not related only with its ability to release catecholamines, indicating that other neurotransmitters, may be involved in its toxicity. Neither the TsV or its toxins was capable to affect the 3H-Glu uptake. TsTX-I inhibited only 3H-DA uptake (IC50 = 28.41 nM). On the other hand, TsV (0.43ng/mL) inhibited both 3H-GABA and 3H-DA uptake (~50%). TsTX-V showed IC50 = 9.37 nM and 22.2 nM for 3H-GABA and 3H-DA uptake, respectively. These effects were abolished by pre-treatment with TTX, indicating the involvement of Na+ channels in this process. In the absence of Ca2+ and at low concentrations of toxin, the reduction is not as significant as in the presence of Ca2+. TsTX-V did not reduce 3H-GABA uptake in COS-7 cells expressing GABA transporters GAT-1 and GAT-3, suggesting that this toxin indirectly reduces the transport. The reduced 3H-GABA uptake by synaptosomes could be due to fast and intense cell depolarization as revealed by confocal microscopy of C6 glioma cells. Thus, TsTX-V causes reduction on 3H-GABA and 3H-DA uptake in a Ca2+-independent manner, not affecting directly GABA transporters, but, in consequence of depolarization, involving voltage-gated Na+ channels. TsV and its toxins were able to increase the ([Ca2+ ]C , probably by interact with Na+ channels. When compared to KCl 60 mM depolarizing effect (100 %), TsV (100 and 500 ?g/mL), showed an increase of 49.60 ± 2.58 % and 103.66 ± 5.17 %, respectively, whereas TsTX-I and TsTX-V (50 and 100?g/mL of each) showed 43.92 ± 3.06 % and 121.8 ± 8.9 %; 52.56 ± 8.33 % and 79.5 ± 6.1 %, respectively. TsTX-I (100 ?g/mL) showed most potent effects in this type of preparation, since induced most intense effect that TsTX-V in the same concentration. Thus, it is possible that the differences observed on the effects induced by both toxins are consequence of structural changes among Na+ channels present in several types of tissues and innervations .
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