Les légumineuses font parties des familles les plus cultivées à la fois pour l'alimentation humaine et pour l'alimentation animale. Une des maladies principales de la luzerne (Medicago sativa), plante fourragère la plus cultivée au monde, est la verticilliose causée par Verticillium alfalfae, un champignon du sol. Sans traitements phytosanitaires efficaces et pratiques pour les maladies causées par des pathogènes du sol, la protection des cultures passe par la sélection de variétés résistantes. Dans cette thèse, la légumineuse modèle Medicago truncatula a été utilisée afin d'identifier des gènes candidats à la résistance quantitative à Verticillium alfalfae V31-2 (Va V31-2). La première étape de ces travaux a révélé des sources de résistance à la souche Va V31-2 au sein de l'espèce M. truncatula. Pour cela, 261 lignées (dont 246 accessions issues du projet MtHapMap) ont été inoculées et le développement de flétrissements foliaires a été suivi pendant quatre semaines, suivi d'un réisolement du pathogène à partir des parties aériennes. Ces analyses ont révélé une grande biodiversité de réponse à la verticilliose au sein de l'espèce Medicago truncatula, avec une variabilité inter et intra-populations. Dans une seconde partie, des QTL pour la résistance partielle à la verticilliose ont été identifiés par génétique d'association (GWAS) permettant la découverte de nouveaux QTL de résistance à Va V31-2 et la confirmation de la présence d'un QTL majeur sur le chromosome 7 précédemment décrit. Selon les phénotypes de maladie utilisés pour l'étude de GWAS, les QTL détectés sont différents, ce qui suggère des contrôles génétiques différents pour l'évolution des symptômes de maladie et la colonisation des parties aériennes par Va V31-2. Une seconde analyse de GWAS menée sur 90 accessions de la population tunisienne Soliman a révélé des gènes candidats différents de ceux identifiés à partir de la collection MtHapmap, suggérant une possible adaptation locale. La validation fonctionnelle de gènes candidats pour la résistance partielle a été entamée, en privilégiant ceux situés sur le chromosome 7, à la convergence de différentes études génétiques. La mise en place d'un système d'inoculation in vitro de racines transgéniques a permis de révéler le rôle du gène Medtr7g070480 codant pour une protéine SEC14 dans la résistance à Va V31-2. L'extinction de l'expression de ce gène par microARN artificiel dans le génotype A17 (résistant) et F83005.5 (sensible) diminue la colonisation des racines par Va V31-2, alors que sa surexpression augmente la colonisation chez A17 : il s'agirait donc d'un gène de sensibilité. L'unique polymorphisme génétique entraînant une substitution non synonyme entre A17 et F83005.5 explique 18,5% de la variation du niveau de résistance observée au sein des 246 accessions MtHapmap. L'étude de l'expression racinaire du gène MtSEC14 24 heures après inoculation par Va V31-2 dans un panel de 14 accessions sensibles et résistantes n'a pas montré de différences significatives entre ces deux types d'accessions. En parallèle, des gènes orthologues aux gènes candidats à la résistance à V. alfalfae ont été identifiés chez d'autres plantes modèles (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.), puis la pathogénicité de Va V31-2 a été testée chez ces espèces en vue de leur éventuelle utilisation pour valider le rôle de ces gènes. Un unique orthologue à MtSEC14 a également été identifié chez Medicago sativa. Grâce à la synténie entre M. truncatula et M. sativa, nos travaux pourront très probablement être transférés à la luzerne cultivée. A notre connaissance, ces travaux mettent en évidence pour la première fois le rôle d'un gène de sensibilité dans une résistance partielle à un micro-organisme chez les Légumineuses. / Pathogens, animals and weeds are responsible for losses ranging from 20% to 40% of global agricultural yield. Legumes are the second most grown crops after cereals as human and animal food, and their yield is also affected by pathogens. Verticillium alfalfae is a soil-borne pathogen causing high yield losses in alfalfa fields (Medicago sativa), the most worldwide legume forage crop grown. To date, there is no chemical control and crop breeding is the best way to protect alfalfa against V. alfalfae. However, Medicago sativa has a complex genome (allogamous and tetraploid), therefore in this work the model legume Medicago truncatula (diploid and self-fertile) was used to investigate genetic mechanisms involved in V. alfalfae V31-2 (Va V31-2) resistance. First, several sources of resistance were identified in M. truncatula biodiversity by assessing disease symptoms development in 261 lines from the Mediterranean basin inoculated by V. alfalfae V31-2. Reisolation of V. alfalfae V31-2 in M. truncatula stems was also led. These analyses revealed a great biodiversity of M. truncatula response towards Va V31-2. A genome wide association study (GWAS) on various disease phenotypes pinpointed several quantitative trait loci (QTL): one of them colocalized with a previous major QTL on chromosome 7 detected on LR4 and LR5 RILs populations. Both phenotypic and genetic analyses thus suggest the occurrence of different resistance mechanisms in M. truncatula populations towards V. alfalfae. Resistant candidate genes towards Va V31-2 were also identified by GWAS using 90 accessions of M. truncatula Soliman Tunisian population. These candidate genes are different from the pinpointed candidate gene of our previous GWAS analysis. These results might underline a local adaptation towards Verticillium. Consistencies between GWAS results with previous QTL and transcriptomic data led us to perform the functional validation with the candidate genes localized on chromosome 7. An original in vitro inoculation system of M. truncatula transgenic roots was used to validate Medtr7g070480 (gene encoding a SEC14 protein) as a key player towards V. alfalfae V31.2 in M. truncatula. Silencing the SEC14 gene using artificial microRNA in A17 (resistant) and F83005.5 (susceptible) lines decreases Va V31-2 colonization rate on transgenic roots whereas overexpressing MtSEC14 increases the colonization rate in A17. This MtSEC14 gene appears as a disease susceptibility gene. Moreover, 18.5% of the disease variation in the studied M. truncatula accessions is explained by the unique non-synonymous polymorphism between A17 and F83005.5 in MtSEC14. Root expression patterns of the SEC14 gene one day after inoculation by Va V31-2 was also analyzed in response to inoculation among a panel of 14 susceptible and resistant M. truncatula accessions of diverse geographic origins. No significant differences were found. At the same time, orthologous resistance candidate genes towards Va V31.2 in several other model species (Lotus japonicus, Arabidopsis thaliana, Nicotiana sp.) were discovered. Pathogenicity of Va V31-2 in these species was monitored to use them as potential model for functional validation. Only one orthologous gene of MtSEC14 has been identified in Medicago sativa. Because of a great synteny between M. truncatula and M. sativa, our work could be useful for alfalfa breeding. In this work and for the first time, a susceptibility gene involved in a quantitative resistance against microorganisms in Legumes was identified.

No description available.

[EN] Cold is one of the most important abiotic stresses, severely affects the growth and development of plants, and limits their geographical distribution. Given that cold, salinity and drought stresses overlap some of their molecular mechanisms of response, a cDNA library of sugar beet (Beta vulgaris), generated from leaves of plants subjected to saline stress, was used to try to identify genes for tolerance to cold stress by its overexpression in yeast. In this way it was identified, among others, the CRIO4 gene whose characterization has been the work of this thesis. CRIO4 encodes a SEC14-like protein, and it is ortholog to PATL family of Arabidopsis thaliana and it shares a conserved domain with SEC14 and SFH family of yeast. CRIO4 overexpression confers to the yeast cells the ability to grow at low temperatures and tolerance to tunicamycin (an inhibitor of protein glycosylation). The in silico analysis of the CRIO4 sequence confirms several motifs and domains conserved in the protein that seem to direct its function toward the vesicular trafficking, and it reveals multiple potential phosphorylation sites in CRIO4 suggesting a possible role in signaling. Sec14 domain is a phospholipid binding and transfer domain, and the obtained results indicate that CRIO4 binds to phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. CRIO4 does not complement the function of Sec14p of yeast, and this could be due to the lack of phosphatidylcholine affinity by CRIO4. Tryptophan transport is the greatest limiting factor for growth at low temperatures in yeast. The results of the yeast coexpression assay of CRIO4 and TAT2 (a high-affinity tryptophan permease) displayed in this thesis, seem to indicate stimulation of Tat2p transport to the plasma membrane by CRIO4, which could develop into an enhanced tryptophan absorption, thereby explaining the greater cold tolerance conferred by overexpression of CRIO4 in yeast. The subcellular localization study has shown that CRIO4 is associated with the plasma membrane and intracellular membranes, being part of vesicles, which seems to confirm the role of CRIO4 in intracellular trafficking, function that it would share with its orthologous genes. The expression pattern of CRIO4 in sugar beet has shown that CRIO4 is expressed in all analyzed tissues, focusing its highest expression in leaf and root. It has also been shown that CRIO4 expression increases after shorter exposure to cold stress and heat stress. Phenotypic studies of several mutant lines of PATLs genes from Arabidopsis thaliana have been carried out and high variability in results was obtained, this could be due to functional redundancy among the members of this multigenic family. Phenotypic studies of transgenic lines of Arabidopsis thaliana overexpressing the CRIO4 gene have also been performed. These lines show an improvement in their growth and development at low temperatures, thereby increasing their tolerance to cold stress. Furthermore, expression of CRIO4, in A. thaliana transgenic lines, increases considerably after cold stress and heat shock. Moreover, accumulation points of CRIO4 were observed along the whole cell, after heat shock. Intracellular recycling of PIN2, a gravitropic response indicator, is affected by decreasing temperature. The results obtained in this thesis suggest that overexpression of CRIO4 reactivates intracellular transport of PIN2 under cold stress, which would imply that its phenotype is related to auxin traffic. / [ES] El frío es uno de los estreses abióticos más importantes, afecta severamente al crecimiento y desarrollo de las plantas, y limita su distribución geográfica. Puesto que el estrés por frío, por salinidad y por sequía solapan algunos de sus mecanismos moleculares de respuesta, se usó una biblioteca de ADNc de remolacha (Beta vulgaris) generada con hojas de plantas sometidas a estrés salino, para tratar de identificar genes de tolerancia a estrés por frío mediante su sobreexpresión en levadura. De este modo se identificó, entre otros, el gen CRIO4 cuya caracterización ha sido el trabajo de esta tesis. CRIO4 codifica una proteína tipo Sec14, y es ortólogo a la familia PATL de Arabidopsis thaliana y tiene un dominio conservado con SEC14 y la familia SFH de levadura. La sobreexpresión de CRIO4 confiere a las células de levadura la capacidad de crecer a temperaturas bajas y tolerancia a tunicamicina (inhibidor de la glicosilación de proteínas). El análisis in silico de la secuencia de CRIO4 confirma diversos motivos y dominios conservados en la proteína que parecen dirigir su función hacia el tráfico vesicular, y revela múltiples potenciales sitios de fosforilación en CRIO4 sugiriendo una posible función en señalización. El dominio Sec14 es un dominio de unión y transferencia de fosfolípidos, y los resultados obtenidos indican que CRIO4 establece unión con fosfatidiolinositol y fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la función de Sec14p de levadura, y esto podría ser debido a la falta de afinidad de CRIO4 por fosfatidilcolina. En levadura, el transporte de triptófano es el mayor factor limitante para el crecimiento a temperaturas bajas. Los resultados del ensayo de coexpresión de CRIO4 con TAT2 (una permeasa de alta afinidad para triptófano) en levadura mostrados en esta tesis, parecen indicar una estimulación del transporte de Tat2p hacia la membrana plasmática por parte de CRIO4, que podría devenir en una absorción de triptófano mejorada, explicando así la mayor tolerancia a frío conferida por la sobreexpresión de CRIO4 en levadura. El estudio de localización subcelular ha mostrado que CRIO4 está asociada a la membrana plasmática y en membranas intracelulares, formando parte de vesículas, lo que parece confirmar el papel de CRIO4 en el tráfico intracelular, función que compartiría con sus ortólogos. El patrón de expresión de CRIO4 en remolacha ha mostrado que CRIO4 se expresa en todos los tejidos analizados, concentrándose su mayor expresión en hoja y raíz. También se ha mostrado que la expresión de CRIO4 aumenta tras tiempos cortos de exposición a estrés por frío y estrés por calor. Se han realizado estudios fenotípicos de diferentes líneas mutantes en genes PATLs de Arabidopsis thaliana, obteniéndose una gran variabilidad en los resultados que podría ser debida a la redundancia funcional entre los miembros de esta familia multigénica. También se han realizado estudios fenotípicos de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen CRIO4. Estas líneas muestran una mejoría en su crecimiento y desarrollo a temperaturas bajas, aumentando por tanto su tolerancia al estrés por frío. Además, la expresión de CRIO4, en las líneas transgénicas de A. thaliana, aumenta considerablemente tras el estrés por frío y tras un choque térmico, observándose en este último caso, acúmulos de CRIO4 a lo largo de toda la célula. El reciclaje intracelular de PIN2, indicador de la respuesta gravitrópica, se ve afectado por la disminución de la temperatura. Los resultados obtenidos en esta tesis parecen indicar que la sobreexpresión de CRIO4 reactiva el transporte intracelular de PIN2 bajo estrés por frío, lo que implicaría que su fenotipo está relacionado con el tráfico de auxinas. / [CA] El fred és un dels estressos abiòtics més importants, afecta severament al creixement i desenvolupament de les plantes, i limita la seua distribució geogràfica. Ja que l'estrès per fred, per salinitat i per sequera solapen alguns dels seus mecanismes moleculars de resposta, es va usar una biblioteca d'ADNc de remolatxa (Beta vulgaris) generada amb fulles de plantes sotmeses a estrès salí, per tractar d'identificar gens de tolerància a estrès per fred mitjançant la seua sobreexpressió en llevat. D'aquesta manera es va identificar, entre d'altres, el gen CRIO4 la caracterització del qual ha estat el treball d'aquesta tesi. CRIO4 codifica una proteïna tipus Sec14, i és ortòleg a la família PATL d'Arabidopsis thaliana i té un domini conservat amb SEC14 i la família SFH de llevat. La sobreexpressió de CRIO4 confereix a les cèl·lules de llevat la capacitat de créixer a temperatures baixes i tolerància a tunicamicina (inhibidor de la glicosilació de proteïnes). L'anàlisi in silico de la seqüència de CRIO4 confirma diversos motius i dominis conservats en la proteïna que semblen dirigir la seua funció cap al tràfic vesicular, i revelen múltiples potencials llocs de fosforilació en CRIO4 suggerint una possible funció en senyalització. El domini Sec14 és un domini d'unió i transferència de fosfolípids i els resultats obtinguts indiquen que CRIO4 estableix unió amb fosfatidiolinositol i fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la funció de Sec14p de llevat, i això podria ser a causa de la falta d'afinitat de CRIO4 per fosfatidilcolina. En llevat, el transport de triptòfan és el major factor limitant per al creixement a temperatures baixes. Els resultats de l'assaig de coexpressió de CRIO4 amb TAT2 (una permeasa d'alta afinitat per triptòfan) en llevat mostrats en aquesta tesi, semblen indicar una estimulació del transport de Tat2p cap a la membrana plasmàtica per part de CRIO4, que podria esdevindre en una absorció de triptòfan millorada, explicant així la major tolerància a fred conferida per la sobreexpressió de CRIO4 en llevat. L'estudi de localització subcel·lular ha mostrat que CRIO4 està associada a la membrana plasmàtica i en membranes intracel·lulars, formant part de vesícules, la qual cosa sembla confirmar el paper de CRIO4 en el tràfic intracel·lular, funció que compartiria amb els seus homòlegs. El patró d'expressió de CRIO4 en remolatxa ha mostrat que CRIO4 s'expressa en tots els teixits analitzats, concentrant-se la seua major expressió en fulla i arrel. També s'ha mostrat que l'expressió de CRIO4 augmenta després de temps curts d'exposició a estrès per fred i estrès per calor. S'han realitzat estudis fenotípics de diferents línies mutants en gens PATLs d'Arabidopsis thaliana, obtenint-se una gran variabilitat en els resultats que podria ser deguda a la redundància funcional entre els membres d'aquesta família multigènica. També s'han realitzat estudis fenotípics de línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana que sobreexpressen el gen CRIO4. Aquestes línies mostren una millora en el seu creixement i desenvolupament a temperatures baixes, augmentant per tant la seua tolerància a l'estrès per fred. A més, l'expressió de CRIO4, en les línies transgèniques d'A. thaliana, augmenta considerablement després de l'estrès per fred i després d'un xoc tèrmic, observant-se en aquest últim cas, cúmuls de CRIO4 al llarg de tota la cèl·lula. El reciclatge intracel·lular de PIN2, indicador de la resposta gravitrópica, es veu afectat per la disminució de la temperatura. Els resultats obtinguts en aquesta tesi semblen indicar que la sobreexpressió de CRIO4 reactiva el transport intracel·lular de PIN2 sota estrès per fred, la qual cosa implicaria que el seu fenotip està relacionat amb el tràfic d'auxines. / Izquierdo García, AC. (2016). Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62826